This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).

倫理に関する声明：本研究プロトコルは、カトリック大学校（KC12TISI0861）の施設内倫理委員会によって承認されました。 血からの単球細胞の1の単離<ol><li>単球細胞の単離（日-5） <ol><li>細胞調製チューブ（CPT）に採血から新鮮な血液の少なくとも10ミリリットルを取得します。 </li><li>新しい50mlのコニカルチューブに血液を移し、1で滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でそれを希釈：4の比率。 注：希釈の比率が高いが、より高純度のために使用することができます。 </li><li>新しい50 mlのコニカルチューブに密度勾配媒体の10ミリリットルを追加し、慎重に密度勾配媒体の上に希釈した血液をレイヤー。遠心ブレーキなしで室温（RT）で30分間、750×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に、新しい50 mlのコニカルチューブにバフィー層を転送管にPBSの30ミリリットルを追加し、細胞を洗浄。 </li><li>室温で5分間、515×gで細胞を遠心&lt;/李&gt; <li> PBSを捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を懸濁します。 </li><li>細胞をカウントし、24ウェルプレートのウェルあたり1×10 6個の細胞をプレート。蒸発を防ぐために、周囲のウェルにPBSを追加します。 </li><li>形質導入の前に5％CO 2中、37℃で5日間、細胞を安定化させます。細胞を乱すことなく、日3-4に新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルを追加します。 </li></ol></li></ol>センダイウイルス2.伝達<ol><li>トランスダクション（0日目） <ol><li>収集し、15mlのコニカルチューブに血液細胞を転送し、血球計数器を使用してそれらを数えます。 </li><li>伝達あたり3×10 5細胞を調製し、室温で5分間、515×gで細胞を遠心します。 </li><li>吸引により上清を捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を再懸濁します。 </li><li>非コーティングした24ウェルプレートのウェルに細胞を移します。 </li><li>氷の中にセンダイウイルスの混合物を解凍し、suコマンドに追加spended細胞。メーカーの推奨に基づいて細胞にセンダイウイルスを追加します。 </li><li>封止フィルムでプレートを密封し、30℃で30分間1,150×gで、それを遠心。 </li><li>遠心分離後、5％CO 2で一晩（O / N）で37℃で細胞をインキュベートします。 </li></ol></li><li>フィーダーマトリックスへの細胞移動（1日目） <ol><li>翌日、コートビトロネクチンとの24ウェルプレート。最終5μg/ mlの濃度のために、PBS中のビトロネクチン液を希釈します。 24ウェルプレートのウェルにビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。使用前にコーティング溶液を除去します。コーティングしたプレートを3日間室温で保存することができます。 </li><li>コーティングしたウェルに細胞やウイルスを含むすべてのメディアを転送します。 </li><li>新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルと残りの細胞を収集し、細胞含有ウェルにそれを追加します。 </li><li> 35℃で10分間、1150×gでプレートを遠心。 </li><li>セント後rifugation、上清を除去しIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5％CO 2、O / Nで、37℃で細胞を維持します。 </li></ol></li><li>第二の細胞移動（2日目） <ol><li>コートステップ2.2.1で説明したように5μg/ mlのビトロネクチンとの新しい24ウェルプレートのウェル、。各形質導入のためのプレートの1つのウェルを使用してください。 </li><li>新たにコーティングされたビトロネクチンプレートに第一プレートから細胞懸濁液を転送します。 注：必要でない場合、懸濁細胞を廃棄することができます。ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。手順が繰り返される場合は、細胞を採取します。 </li><li>また、メンテナンスのため、第一プレートのウェルにIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5％CO 2、O / Nで37℃で静置します。 </li><li> 37℃で付着した細胞を維持し、5％CO 2、新鮮なIPSCメディアを毎日培地交換を行います。コロニーは形質導入後の日14-21に表示されます。 </li><li> Centrifug10分間1,150×gで35℃で懸濁細胞を含む電子新たにコーティングされたプレート。 </li><li>遠心分離後、5％CO 2、O / N中37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、上清を除去し、新鮮なIPSCメディアと交換してください。 注：ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。ステップが繰り返される場合は、上清中の細胞を採取し、ステップ2.3を繰り返します。 </li><li> 80％の密集度に到達するまで毎日メディアの変化と付着した細胞を維持します。 </li></ol></li></ol> 3.再プログラムされた細胞のメンテナンス<ol><li> 24ウェルプレートの培養後の早期のメンテナンス<ol><li>細胞がコンフルエントとしたら7-10日形質導入後、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。最終5μg/ mlの濃度PBS中のビトロネクチン液を希釈します。皿にビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。 </li><li>洗いますPBSで細胞と細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5％CO 2。 </li><li>細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。上清を除去し、新鮮なIPSC培地3mlに細胞を再懸濁。 </li><li>プレートは、すべて新たにコーティングされた60-mmディッシュに細胞を再懸濁しました。 </li><li>細胞が80％コンフルエントになるまで、5％CO 2中37℃でそれらを細胞に10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加して維持します。 </li></ol></li><li>コロニーの外観のためのスプリット（サブクローニング調製） <ol><li>ステップ3.1.2で説明したように、ビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュを準備します。 </li><li> PBSで細胞を洗浄し、細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5％CO 2。 </li><li>細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、ディッシュあたり1×10 4細胞を調製。</li><li> 250×gで細胞を遠心分離し、室温で2分間。 </li><li> IPSCメディアの6ミリリットル、再懸濁1×10 4個の細胞は、コーティングされた100-mmディッシュにそれらをめっきし、メディアに10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加します。 </li><li>大きなコロニーが現れるまで一週間、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。 注：サブクローニングのためのコロニーを維持し、展開します。サブクローニングは、通常、5継代の下で行われています。 </li></ol></li><li>ソリューションを外すIPSCのコロニーを使用してピッキングコロニー<ol><li>コロニーピッキング、種子ステップ3.2.7で述べたようにビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュで1×10 4細胞、前の週。 </li><li>ビトロネクチン溶液2mlを添加し、少なくとも1時間室温でインキュベートすることにより、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。 </li><li>顕微鏡（40Xまたは100X倍率）を介して観察することにより、マーカーペンを使用して、明確な境界を有するコロニーをマーク。ステップ3.3.2で行われた新しいプレートからビトロネクチン溶液を除去し、6ミリリットルを追加します。IPSCのメディアは、10 mMのRhoキナーゼを補充しました。 </li><li>細胞から培養培地を除去し、PBSの3ミリリットルでそれらを洗ってください。 </li><li> IPSCコロニー取り外し溶液1mlを加え、室温で30秒のためにそれらをインキュベートします。 </li><li>プレートから溶液を除去し、さらに30秒間、室温で静置します。 </li><li> P200のピペットを用いて、プレートから200μlの培地を描き、ピペッティングによって標的コロニーを切り離します。新しい100-mmディッシュに飛散コロニーを転送します。 </li><li>インキュベートし、5％CO 2中37℃で細胞を維持します。 注：これらは10の特徴付けが、少なくとも10継代後に行われた通路に到達するまで、純粋なIPSCのコロニーを得た後、細胞を維持しました。抗体希釈プライマー情報を表1及び2に示されています。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application.">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine:+current+progress+and+future+perspectives.">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li><li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application.">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li><li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions.">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li><li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells.">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li><li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells.">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

胚性幹細胞（ESC）は、いくつかの欠点を示しているので、代替ツールの必要性が必要とされました。したがって、山中によって誘導多能性幹細胞（iPS細胞）の開発が国際的なスポットライトの下に来ました。山中は、多能性成体体細胞にのみ4つの遺伝子を添加することによって誘導することができることを発見して以来、約10年間でした。 iPS細胞は、成熟した体細胞から「誘導され」ているので、彼らはかつてのESCに関連する懸念されていた倫理的な問題を回避することができます。 ESCは異なり、性IPSCは、各個体から生成することができます。したがって、それらは、パーソナライズされた医学研究、薬物スクリーニング、疾患モデル、または再生薬のような他の研究において使用され得ます。 最初のヒトのIPSCが正常にこの細胞型の再プログラミング2007の様々なグループに皮膚線維芽細胞から生成されたが、侵襲的な外科的処置は、この一次電池を得ることが必要でした。したがって、それは考えではありませんでした様々な疾患iPS細胞を生成するか、再生医療を設計するためのリットルソース。代替的かつ容易に得られる細胞型は、ケラチノサイト、尿単球、および血液細胞として、必要でした。しかしながら、これらの細胞が膨張しにくい、そのうちのいくつかは、汚染10のより高い可能性を有しています。 本研究では、我々が正常などのPBMCのような全血細胞からiPS細胞を生成することができるプロトコルを提示しました。特定の細胞型のいずれかの膨張過程なしに、このプロトコルは、さらに、一次血液細胞の少量から、iPS細胞を生成するための比較的簡単な方法が提案されています。 PBMCを血液から単離した後、細胞を5日間血液細胞培地中で安定化させました。導入前の安定化工程は、このプロトコルで重要でした。再プログラミング効率は、血液細胞培地中で細胞をインキュベートした後に良好でした。この培地は、CD34 +細胞の増殖のために使用しました。しかし、全血細胞は、この私の中で維持された場合5日間の直径は、細胞数は、最初の数とほぼ同じでした。全血細胞を使用して、CD34 +細胞が拡大されていたかどうかを確認することは困難でした。それにもかかわらず、安定化工程自体は成功した再プログラミングのために重要であると思われました。 形質導入後、我々は連続的遠心分離によってビトロネクチンでコーティングしたプレート上に細胞を播種しました。もともと、再プログラムされた細胞は、形質導入後、ウェルの底に沈みました。機械的な力または遠心分離で細胞を昇圧し、形質導入した細胞は付着し、増殖することができました。プロトコルは、全血の細胞を使用するので拡張しかし、異なる試料と試み試験の半分は、形態の様々なタイプをもたらしました。したがって、コロニーピッキングによって純粋なIPSCコロニーの単離は、このプロトコルで重要でした。単離されたコロニーから増殖した細胞は、純粋なiPS細胞のすべての特性を示しました。 他の利点にもかかわらず、性IPSCは持っていますいくつかのハードルを克服します。いくつかの山中因子は癌遺伝子として知られているので、性IPSCは、in vivoで腫瘍に開発することができます懸念があります。したがって、再プログラムされた細胞は、統合によって残存外因性の遺伝子発現を有していないことが重要です。 iPS細胞の現像後の早い時期には、このようなレトロウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルスは、再プログラミングのために使用しました。再プログラミングの速度が正常高い、まだこれらのウイルスは、細胞ゲノムへのランダムな組み込みを必要としました。この理由のために、他のいくつかの方法が開発されています。センダイウイルスなどのウイルスを統合せずに細胞を形質導入することが知られており、小分子およびエピソームベクターを使用して、他の方法も開発されています。本研究では、再プログラミングのためのセンダイウイルスを使用していました。積分率は、レンチウイルスに比べて比較的低かったです。我々はまた、いくつかの残りのウイルス成分が生成されたiPS細胞であったことを確認しました。 3回の試験のうち一つはintegratをもたらしましたイオン、後でも15から20の通路。しかし、この統合は、1つの単一細胞由来コロニーをサブクローニングすることにより、取り外し可能でした。我々の経験では、単一細胞由来の健康なコロニーを得るための密度は、100-mmディッシュあたり1×10 4細胞でした。完璧な円形状を生じたコロニーを採取し、残りのウイルス成分のPCRの再確認のために拡大しました。非統合された細胞由来のコロニーをさらなる使用のために維持しました。削除されると、細胞は、非統合の状態を維持します。 本研究では、血液細胞の再プログラミングのためのプロトコルを提案します。我々は、浮遊細胞の再プログラミングの速度を増加させるために、そのような連続めっきや遠心分離などのいくつかのステップを追加しました。この方法は、PBMCおよび臍帯血単核細胞（CBMCs）を用いて行きました。このプロトコルは、韓国のGMP施設でのホモ接合体性IPSCを生成するために使用されました。当社グループは、使用してIPSCの再プログラミングプロセスの加速を楽しみにしています私たちのプロトコル。

幹細胞は、過去数十年の1のための臨床治療の中で最も魅力的な材料の一つとなっています。幹細胞の魅力的な特性は、多分化能と自己再生する能力です。 1981年、第一の胚性幹細胞（ESC）は、マウス胚2から単離しました。技術は、ヒト胚に適用した場合しかし、それはいくつかの倫理的な問題に直面しました。 博士は山中と彼のチームは、マウスの体細胞から最初の多能性細胞を再プログラムするとき、2006年に、幹細胞のフィールドは、その可能性を取り戻し、関心が3が再燃しました。いくつかの定義された因子を送達することによって、多能性幹細胞は、成体体細胞から「誘導され」、したがって、命名された成功した「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」を2007年には、この技術は、ESCの正確な特徴を有する細胞を得、ヒト細胞4に適用されたが、倫理的な議論のどれも。理論的には、のiPSCsは、任意の個体または患者から得られる任意の細胞型から生成することができます。患者特異的iPS細胞は、疾患の表現型および個々の患者のエピジェネティックな条件をシミュレートすることができます潜在的なツールとして上昇しています。遺伝子編集または病原性の状態を逆にすることができ、他の方法を使用して、患者特異的iPS細胞はまた、オーダーメイド医療5で使用することができます。彼らはドナーと同じ免疫アイデンティティを持っているので、また、性IPSCは少ない6自動移植より現実作り、免疫拒絶と関連しています。したがって、性IPSCは、疾患のモデリング、薬剤スクリーニング、および再生治療で最も有望なプラットフォームとなっています。これらの利点を考慮すると、最小の細胞源から最短の時間でより純粋な、より高い収率を与えることができる改良されたプロトコルが開発中で常にあります。将来のアプリケーションのための最も効率的なプロトコルを見つけることの1つの主要な考慮事項は、主要な細胞型です。早期IPSC生成プロトの大半colsのは、元のIPSCラインが皮膚線維芽細胞4から誘導されたので、接着細胞用に最適化されています。しかし、これらの細胞の単離および調製は、労働集約的です。また、皮膚線維芽細胞の単離は、より広範なアプリケーションのための主要な欠点になることができます侵襲性外科手術手順が含まれています。 したがって、iPS細胞をさらなる使用のために、便利な収集を有する細胞源が必要とされます。それはむしろ低侵襲手順7-9を介して取得されるので、血液は、理想的な細胞源とみなされます。本研究では、末梢血単核細胞（PBMC）からhiPSCs生成プロトコルに簡単な変更を開発しました。そのようなCD34 +細胞のような特定の細胞型の困難な膨張処理なしで、全血細胞またはPBMCを連続山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入した後、遠心分離によりマトリックスでコーティングされたプレート上にプレーティングしました。この方法は、に必要な時間を減少しました形質導入浮遊細胞の付着とは、自分で取り付けることができませんでした再プログラミングされた細胞の損失を減少させました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm Dish</td>
			<td>TPP&#160;</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Cornical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Cornical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>7551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC Isolation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9805</td>
			<td>Blood cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC110</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>8697</td>
			<td>Blood cell media supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC Generation and Culture Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 Media</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express (TrypLE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>12604-039</td>
			<td>Colony detaching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Control Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Cover Glass</td>
			<td>Superior</td>
			<td>HSU-0111580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldyhyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BIOSESANG</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SP-5050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Oct4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>630801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Klf4 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab151733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass, Coated&#160;</td>
			<td>Hyun Il Lab-Mate</td>
			<td>HMA-S9914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>366919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprypylalcohol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>K1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Taq DNA Polymerase</td>
			<td>iNtRON BIOTECH</td>
			<td>25021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 10X TBE Buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15581-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading star</td>
			<td>Dyne Bio</td>
			<td>A750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb (+) DNA ladder marker</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>DM003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0520.1000</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BIOSESANG</td>
			<td>T1027</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>1129</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induced pluripotent stem cell generation from blood cells using sendai virus and centrifugation

人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の最近の開発は成熟した体細胞が未分化多能性の状態に戻ることができることを証明しました。 などケラチノサイト、尿細胞、線維芽細胞、初期の実験は、通常、皮膚線維芽細胞を用いて行った：今、再プログラミングは、成体の体細胞の様々なタイプを使用して行われます。しかしながら、これは、患者からの線維芽細胞を得るために侵襲的な外科的処置を必要としました。したがって、そのような血液および尿細胞などの懸濁細胞を、なぜなら一次細胞を得るための利便性の再プログラミングのために理想的と考えられました。ここでは、末梢血単核細胞（PBMC）からのIPSCを生成するための効率的なプロトコルを報告します。遠心分離を使用して、新しい、マトリックスでコーティングされたプレートにシリアルに形質導入したPBMCをメッキすることにより、このプロトコルは、簡単にIPSCのコロニーを提供することができます。この方法はまた、臍帯血単核細胞（CBMCs）にも適用可能です。この研究は、シンプルかつ効率的PROTを提示しますPBMCおよびCBMCsの再プログラミングのためのocol。

このプロトコルは、血液から単離したPBMCを再プログラムするための簡単な方法を提示します。シリアルめっきおよび遠心分離の組み合わせを使用して、iPS細胞が正常に生成されました。この方法では、性IPSCは、特定の細胞型を単離するか、拡大することなく、全血細胞の少量生成することができます。我々は成功し、小細胞培養プレートにのみ1×10 4個の細胞からiPS細胞を生成しました。 再プログラミングの前に、血液細胞は、密度勾配培地を用いて単離しました。血液細胞を5日間単離後に形質導入しました。 図1Aは、懸濁細胞のための再プログラミング法のスキームを示します。単離後、PBMCをよく非コートに山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入しました。翌日、懸濁細胞は、遠心分離を用いてビトロネクチンでコーティングしたプレート上に採取し、播種した細胞ATT一方非コーティングされたウェルに痛んだが廃棄されました。ビトロネクチンでコーティングされたプレート上に出現付着した細胞を保持し、さらに拡大しました。付着した細胞は、IPSCのメディアを使用して、毎日培地交換して維持しました。遠心分離でめっきプロセスは、残りの懸濁細胞について繰り返しました。 再プログラム性IPSCは、数日間形質導入後、その明確な形態によって区別することができました。しかし、再プログラミングの間に、純粋な形で再プログラムされた細胞を拡大することは困難でした。再プログラミングの初期段階で、性IPSCが取り付けられ、非再プログラミング分化した細胞（ 図2A）と混合しました。 図2A中の矢印は、画像内のIPSC様細胞の種類を示しています。展開する前に、iPS細胞および他の細胞を区別することは困難でした。したがって、純粋なコロニーのみコロニーピッキングプロセスによって得られました。低密度で細胞を播種することにより、リットルコロニー図2Bに示すように、ピッキングのための十分なARGEが得られました。コロニーを単離した後、細胞塊は、単一の細胞培養（ 図2C）に解離しました。純粋なIPSCのコロニーが（ 図2D）、その後見られました。純粋性IPSCを拡大した後、細胞の品質を試験しました。細胞がiPS細胞（ 図3A）の未分化状態を確認するために、アルカリホスファターゼで染色しました。孤立性IPSCすべての由来コロニーは陽性染色を示しました。多能性マーカーは、図3Bに示す免疫蛍光染色によって確認しました。再プログラムされた細胞は非常に、このような最も重要なSSEA4、OCT4、SOX2、TRA-1-81、KLF4、および、TRA-1-60のような多能性マーカーを発現しました。多能性マーカーの発現は、 図3Cに示すRT-PCRによって確認しました。蛍光データに示すように、OCT4及びSOX2は、検出されました。このようなNANOG、DPPA5、TDGF1のような追加のマーカーがpositivましたエリーも同様に発現しました。 さらなる分析のために、核型分析を行いました。 図4Aに示すように、生成されたiPS細胞は、正常な染色体パターンを示しました。真の多能性を確認するために、細胞は外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に分化しました。生成されたiPS細胞は、正常に、図4Bに見られる3つのすべての胚葉へ分化しました。センダイウイルスは、その統合フリー性のために知られているので、ウイルスDNAの除去は、 図4Cに示されています。ウイルスDNAを持っている傾向にあった三つのセルのうち一つでもいくつかの継代後、残っています。しかし、組み込まれた遺伝子は、プロセスをサブクローニングすることにより、取り外し可能でした。 結論として、我々は浮動PBMCからiPS細胞を生成するプロトコルを示しています。プロトコルは、高い効率を示し、血液の少量を必要としました。生成されたiPS細胞は、高い多能性を持っていたし、viのを回避しました<html> RAL統合。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54650/54650fig1.jpg" /> 図1：PBMCからIPSC生成プロトコルのスキーム。メディアタイプとタイムラインに基づいて設計されたプロトコルの詳細図。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54650/54650fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54650/54650fig2.jpg" /> 図2：PBMCから生成されたiPS細胞の明視野像。 （A）再プログラムされた細胞の初期の形態。 （B）ピッキング前コロニーのイメージ。コロニーピッキング精製工程後（C）細胞。 （D）の純粋なコロニーの形態。すべてのスケールバーは200μmで示しています。<html> /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白&quot;&gt; この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54650/54650fig3.jpg" /> 図3：iPS 細胞の多能性は、PBMCから生成されました。 （A）コロニーをアルカリホスファターゼで染色しました。生成されたiPS細胞の（B）蛍光画像。抗体希釈率を表1に示します。 （C）多能性マーカーのPCR分析。プライマーについては、 表2に提供されます。すべてのスケールバーは200μmで示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54650/54650fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> / &quot;/ 54650 / 54650fig4.jpgをアップロード&gt; 図4： 生成されたiPS細胞のさらなる分析。 （A）IPSCのノーマルkaryogram。 （B）三胚葉の分化後の細胞の蛍光画像。 （C）センダイウイルスベクターのPCR分析。非形質導入した細胞を陰性対照として使用し、そして細胞を形質導入は、陽性対照として使用した後の日に回収しました。プライマーについては、 表2に提供されます。すべてのスケールバーは200μmで示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54650/54650fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 抗体名前 </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> SSEA4 </td><td> 1：200 </td></tr><tr><td> Oct3 / 4 </td><td> 1：100</td></tr><tr><td> TRA-1-60 </td><td> 1：200 </td></tr><tr><td> Sox2の</td><td> 1：100 </td></tr><tr><td> TRA-1-81 </td><td> 1：100 </td></tr><tr><td> Klf4の</td><td> 1：250 </td></tr><tr><td>アレクサフルオロ488ヤギ抗マウスIgG（H + L）抗体</td><td> 1：400 </td></tr><tr><td>アレクサフルオロ594ヤギ抗ウサギIgG（H + L）抗体</td><td> 1：400 </td></tr></tbody></table> 表1抗体の希釈液。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ターゲット名 </td><td> 方向 </td><td> プライマー配列 </td><td> サイズ </td></tr><tr><td rowspan="2"> OCT3 / 4 </td><td>フォワード</td><td> ACC CCT GGT GCC GTG AA </td><td rowspan="2"> 190 </td></tr><tr><td>逆</td><td> GGC TGA ATA CCT TCC CAATA </td></tr><tr><td rowspan="2"> SOX2 </td><td>フォワード</td><td> CAG CGC ATG GAC AGT TAC </td><td rowspan="2"> 321 </td></tr><tr><td>逆</td><td> GGA GTG GGA GGA AGA GGT </td></tr><tr><td rowspan="2"> NANOG </td><td>フォワード</td><td> AAA GGC AAA CAA CCCのACT </td><td rowspan="2"> 270 </td></tr><tr><td>逆</td><td> GCT ATT CTT CGG CCA GTT </td></tr><tr><td rowspan="2"> LIN28 </td><td>フォワード</td><td> GTT CGG CTT CCTのGTCのCAT </td><td rowspan="2"> 122 </td></tr><tr><td>逆</td><td> CTG C​​CT CAC CCT CCT TCA </td></tr><tr><td rowspan="2"> DPPB5 </td><td>フォワード</td><td> CGG CTG C​​TG AAA GCC ATT TT </td><td rowspan="2"> 215 </td></tr><tr><td>逆</td><td> AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC </td></tr><tr><td rowspan="2"> TDGF1 </td><td>フォワード</td><td> TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG </td><td rowspan="2"> 140 </td></tr><tr><td>逆</td><td> AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA </td></tr><tr><td rowspan="2">センダイウイルス</td><td>フォワード</td><td> GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C </td><td rowspan="2"> 181 </td></tr><tr><td>逆</td><td> ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC </td></tr><tr><td rowspan="2"> KOS </td><td>フォワード</td><td> ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC </td><td rowspan="2"> 528 </td></tr><tr><td>逆</td><td> ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG </td></tr><tr><td rowspan="2"> Klf4の</td><td>フォワード</td><td> TTC CTG C​​AT GCC AGA GGA GCC C </td><td rowspan="2"> 410 </td></tr><tr><td>逆</td><td> AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA </td></tr></tbody></table> 表2.プライマー情報。

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Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

induced-pluripotent-stem-cell-generation-from-blood-cells-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.1K ビュー.  The Catholic University of Korea. We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

発生生物学

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...