This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

すべての手順は、イタリアの法律に従いました。マウスAFサンプルをGFPと呼ばれるC57BL / 6-Tgの（UBC-GFP）30Scha / Jマウスからの13.5日後交尾（DPC）で妊娠したマウスから採取しました。 1.トランスポゾン生産注：トランスポゾン発現ベクターは、標準的なクローニング手順を用いて作製しました。マウスAF細胞のトランスフェクション用のプラスミドDNAを、市販のキットを用いて調製しました。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内DH5α細菌の50μlのプラスミドDNAの10 ngのを混ぜます。 20分間氷上でマイクロ遠心チューブをインキュベートします。 </li><li> 40秒間42℃でヒートショック。 </li><li> 2分間氷上でマイクロ遠心チューブを置きます。 </li><li>予め温めた（37℃）LB培地（LB）培養液250μlのを追加します。 37℃で30分間（300 rpm）を振ります。 </li><li> 0.1mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上に各形質転換30μlのスプレッド。プレートを乾燥し、37°C​​ OVで反転インキュベート許可ernight。 </li><li>次の日は、午後に、各形質転換から、無菌の200μlのヒントを使用して、3個のコロニーを選択し、0.1mg / mlのLBアンプに転送します。 </li><li> 37℃で一晩（300 rpm）した細菌を振ります。 </li><li>プラスミド精製のための市販のキットを使用します。 -20℃でストックのプラスミド。 </li></ol> 2.マウス胎児線維芽細胞（MEF）の文化<ol><li> 0.1％ゼラチンで6ウェルプレートのコーティング <ol><li>フードの下コートプレートは、6つの各ウェルに滅菌0.1％のゼラチンを1ml加えます。ゼラチンを1時間インキュベーター（37℃）で重合してみましょう。 </li><li>過剰を捨てて、1時間、プレートを乾燥させます。 </li><li>室温でプレートを密封して保存するためにパラフィルムを使用してください。 </li></ol></li><li> マイトマイシンCとのMEFの不活化 <ol><li> 37℃の浴を用いて4×10 6のMEF細胞のバイアルを解凍します。 </li><li> MEF媒体とペトリ皿（150ミリメートル）上のフードにMEFをシード。 </li><li> 37℃で細胞を培養し、5％CO 2。 </li><li> （注意）細胞がコンフルエントであるマイトマイシンC（5 mg / mlで）を追加します。 </li><li> 3時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）に入れる細胞。 </li><li>マイトマイシンCで洗浄細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回培地を除去します。 </li><li> 5分間37℃のインキュベーターに商業トリプシンと場所細胞の2ミリリットルを追加します。後、トリプシン反応を停止するためにメディアをブロックする18ミリリットルを追加します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってburkerチャンバーを用いて細胞を数えます。 </li><li> 5分間、145×gで遠心分離した細胞。上清を捨てます。 </li><li>シード0.1％ゼラチンコーティングしたプレート上の不活性化MEFの60,000細胞/ cm 2。 </li><li> AFおよび/またはIPS-AF細胞を播種する前に、37℃で24時間、5％CO 2の細胞を養います。 </li></ol></li></ol> 3.マウスのAF細胞の単離<ol><li>時限交配を設定し、膣のPLUをチェック共同住宅の24時間後にGS。 </li><li> 13.5 DPCまで観察し、頸椎脱臼を通して妊娠中のダムを生け贄に捧げます。 </li><li> 70％エタノールを用いて動物の腹壁を清掃してください。 </li><li>はさみを使用して、腹腔内へのアクセスを得るために腹壁の長さを切開正中開腹術を行います。 </li><li>鉗子を使用して子宮を公開します。はさみを使用して子宮を取り出して、滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に移す氷上に置きました。 </li><li> 10X倍率でAFを収集するために実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>鉗子で子宮を持ち、はさみで子宮壁を取り除きます。胎児膜およびその結果としての羊水漏れへの損傷を避けるように注意してください。 </li><li>滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に胎児を収集し、氷上に置きます。 </li><li>きれいな100ミリメートルペトリ皿に細かい点鉗子と場所との1胎児の胎盤をつかみます。 </li><li>細かい点の鉗子を使用してSAC卵黄を削除してください。 </li><li&gt;は細かい点の鉗子を使用して羊膜を破砕し、15ミリリットルコニカルバイアルにインスリン注射器を使用して、各胎児のためにAFの30μLを集めます。 </li><li> AF収集した後、1％ウシ胎児血清（FBS）を補充した滅菌1×PBSで各胎児を洗い、そして15ml中にAFを含有する円錐管を集めます。 </li><li> 5分間、145×gで遠心分離AF。ボンネットの下に上清を除去し、ペレット化したAF細胞を播種します。 </li></ol> 4.マウスのAF細胞培養<ol><li> マウスAF細胞の播種 <ol><li>ある日播種の前に、マイトマイシンC処理MEF 0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。 </li><li> AF収集後、AF用培地を用いて（約1×10 7細胞を6胎児から得た）分裂不活性化MEFに羊水穿刺から得られた細胞を播種します。 </li><li> 37℃で細胞を培養し、5％CO 2、一日おきに培地を変えます。 </li><li>培養7日後、トランス以下の手順でfect AF細胞。 </li></ol></li></ol> 5.トランスフェクション、IPS-AF細胞の生成と文化注：マウスAF細胞（PB-CAG-rtTAの）トランスポゾンプラスミドトランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒に、逆テトラサイクリントランスアクチベーターで、PB-tetO2-IRES-OKMSトランスポゾンプラスミドでトランスフェクトしました。全てのプラスミドは、教授アンドラーシュナジ33によって提供されました。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに：mPBase0.5μgのとPB-CAG-rtTAの（2μgのトータルDNA）の0.5μgのでPB-tetO2-IRES-OKMS1μgのを混ぜます。 </li><li>無血清培地で100μL（ - DMEMダルベッコ改変イーグル培地）にDNAを希釈します。 </li><li> DNAを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに：トランスフェクション試薬の8μL（ 例えば 、FUGENE）（8μLのトランスフェクション剤に2μgの（DNA）のトランスフェクション剤のプラスミドDNAの比で）を追加します。 </li><li>室温で15分間トランスフェクション試薬/ DNA混合物をインキュベートします。 </li><li> /ウェル2 mLの最終容量で、マウスのAF細胞と6ウェルプレートにウェル当たりトランスフェクション試薬/ DNA混合物の100μLを滴下添加して、静かに旋回することにより配布します。 24時間放置。 </li><li>翌日は、ドキシサイクリンの1.5μgの/ mLの（各ウェルのメディアの2ミリリットル）を補充した新鮮なのiPS-AF培地で細胞を供給することにより、山中の要因（Oct4の、Klf4の、CMYC、Sox2の）の発現を誘導します。 </li><li>新鮮なDOX含有培地（ポイント5.13までドキシサイクリンを補充した培地中で細胞を維持する）で、通過することなく、毎日の細胞を養います。 </li><li> mCherryを発現のために24時間以内に、毎日のコロニー形成（コロニーは、典型的には、トランスフェクション後20〜30日の間に表示される）のための細胞を観察します。 </li><li>一日コロニーピッキングの前に、マイトマイシンC処理したMEF 96ウェル組織培養プレートを準備します。 </li><li>ボリュームusinの50μLに、単一のコロニーをピックアップGA 200μLピペット、および個々のウェルで96ウェルプレートに順次転送します。 </li><li>翌日、商業トリプシンを50μl添加することによって、単一細胞にすべてのコロニーを解離し、37℃で5分間インキュベートします。 </li><li>コロニーを脱凝集するために上下にピペット。 </li><li>ドキシサイクリンを補充した新鮮なのiPS-AF媒体の100μLを充填した96ウェルプレートコーティングされた0.1％ゼラチンで不活性化MEFで新しいウェルに解離したコロニーを含むトリプシンの譲渡50μL。 </li><li>細胞60〜70％コンフルエンスに達すると、24ウェルプレートのウェルに分割。 </li><li>コロニーはドキシサイクリンなしの状態でも表示されるかどうかを確認するために2つの井戸、ドキシサイクリンなしのドキシサイクリンとの1および他に2：細胞が60から70パーセントコンフルエンスに達したら、1を分割します。 </li><li> IPS-AF媒体に不活性化MEFに、ドキシサイクリンの独立したiPS-AFクローンを、維持し続けます。 </li><li> 37℃、5％CO 2、CHで細胞を培養毎日培地をanging。 </li></ol> 6.アルカリホスファターゼ染色<ol><li>ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、製造業者のプロトコルに従って、アルカリホスファターゼ染色を実行します。 </li></ol> 7.免疫蛍光<ol><li>ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、不活性化MEF 24ウェルプレートのウェルに15万細胞/ cm 2を播種し、37℃、5％CO 2で48時間、細胞を増殖させます。 </li><li> （注意）を室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）のウェルあたり300μLを加えることにより細胞を固定してください。 </li><li>細胞を透過性にするために、0.1％NP-40の300μLを加えます。 </li><li> 0.1％PBS-Tweenで20300μlで細胞を洗浄。 </li><li>室温で1時間ブロッキング緩衝液（1×PBS中の10％ウマ血清）の300μlのを追加します。 </li><li> （1:10のOct4（1:80）、Sox2の（1:80）、Klf4の（1:80）、Nanogの次の一次抗体を使用して、0）およびSSEA1（1:80）。 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清でSSEA1を希釈し、0.3Mグリシン0.1％PBS-Tween-20を含みます。 1×PBS中の10％ウマ血清を持つすべての他の抗体を希釈します。 </li><li> 4℃で一晩抗体をインキュベートします。 </li><li> 0.1％PBS-Tween-20での300μlですすいでください。 </li><li> Alexa594結合ヤギ抗マウスIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ヤギIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ウサギIgGを1×PBS中の10％ウマ血清で希釈した二次抗体を使用し（1：200）、Alexa568結合ヤギ抗マウスIgM（1：200）。室温で2時間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSですすいでください。 </li><li> 1×PBS中：ヘキスト溶液（万1）で染色核。 </li></ol> インビトロ細胞分化8. <ol><li>ハンギングドロップ胚様体（EB）を形成するために、分化培地を使用して、ペトリ皿の蓋の上に単一の滴（2,000細胞/ 20μl）を養います。 </li><li> 37℃で皿をインキュベート4日間、5％CO 2。 </li><li>分化培地中で3日間懸濁培養100mmの細菌等級皿にEBSを移します。 </li><li>別の14日間（DMEMで1:10に希釈した）基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルプレート中にプレートしたEB。 </li><li> T（1：100）、αFP（1：200）とTubb3（1：500）37免疫蛍光分析のために、一次抗体を使用しています。 </li></ol> 9. インビボテラトーマ形成<ol><li> - / - γC - / -マウスRAG2の後肢の筋肉に1×10 6のiPS-AF細胞を含有する1×100μlのPBSを注入します。 </li><li> 6週間細胞注射後に頸椎脱臼を通してマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>以下の分析のためのマウスの後肢から、その大きさによって区別、腫瘍塊を除去します。 </li><li>クライオスタットを用いて、イソペンタン、凍結腫瘍の7-10μmの厚さの横断切片をカットします。 </li><li> ヘマトキシリンANのためのdはエオシン（HE）染色： <ol><li>製造業者のプロトコールに従って、腫瘍組織の組成を評価するためにHEで染色。 </li></ol></li><li> 免疫染色のために： <ol><li>室温で15分間、4％PFAでテラトーマのセクションを修正しました。 </li><li> 0.1％トリトンX-100で透過性。 </li></ol></li><li>以下の抗体を用いてインキュベートする：Tubb3（1：100）、αFP（1：50）およびαSMA（1：100）は、1×PBS中の1％BSAで希釈しました。 1（Tubb3用）37℃で時間または4℃で一晩（他の抗体用）インキュベートします。 </li><li> 20分間、100％メタノールを用いてペルオキシダーゼを遮断します。 </li><li>二次抗体抗マウスHRPコンジュゲート（150 1）を用いて37℃で45分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSですすいでください。 </li><li> 5分間ペルオキシダーゼ（HRP）基板（ 材料表を参照してください）でインキュベートします。 </li><li> 5分間水道水ですすいでください。 </li><li> 9秒間ヘマトキシリンQSで染色。 </li><li>水道水ですすいでください。 </li></オール&gt; 細胞からの10 RNA抽出<ol><li>製造業者の推奨プロトコルに従って、商業用のRNA抽出キットを使用してください。 </li></ol>奇形腫から11 RNA抽出<ol><li>サンプルを解凍避けるために、乳棒と乳鉢および液体窒素を使用して奇形腫を均質化。 </li><li>組織25mgを秤量します。 </li><li> RNA抽出のための市販試薬1mLのクロロホルムの200μLを追加します。 </li><li> 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 13,000×gで遠心分離し、15分間、4°C。 </li><li>新しいチューブにクリアして上清を移します。 </li><li> RNAは、製造業者のプロトコルに従って商用のRNA抽出キットを使用して精製しました。 </li></ol> 12.逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応分析<ol><li>逆転写（RT） - ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびオリゴ（dT）アコーために逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成製造業者のプロトコルに丁は、50 ngの/ cDNAのμLを得ました。 10 ngの/μLの濃度でRNaseフリー水を用いてcDNAを希釈します。 </li><li> cDNAの1 ngの/μLを利用し、製造業者のプロトコルに従って、DNAポリメラーゼを用いてRT-PCRを行います。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

多能性の誘導を得るために選択された方法は、長期移植に関して細胞臨床的安全性に関連します。今日では、再プログラミングに適したいくつかの方法があります。非組込み方法のうち、センダイウイルス（センダイウイルス）ベクターは、感染した細胞40の核内に統合することなく、タンパク質を大量に生産することができ、iPS細胞を得るための戦略であり得るRNAウイルスです。センダイウイルスベクターは、翻訳グレードiPS細胞の生成のための魅力的な候補かもしれないが、それはいくつかの欠点を提示します。ウイルスレプリカは、トランスジェニック配列の性質に敏感です。センダイウイルスベクターは、構成的に複製するので、別の戦略は、この態様41,42を改善するために使用される場合であっても、宿主細胞から排除することは困難です。このようなレベル2の生物学的安全キャビネットのように、特別な処理を必要とします。そこで私唯一の商業ベンダーが利用可能です。再プログラミングのための臨床グレードのセンダイウイルスの現在不足しているとiPS細胞の生産の高コストがあります。 このような側面のおかげで、トランスポゾンシステムは、センダイウイルスベクターに関して、より良いアプローチと考えることができ、ここで私たちは、このシステムは、様々な利点とマウスAF細胞を再プログラミングするのに適した方法であることを規定しています。これは、生体異物の条件を使用して、現在のウイルス産生プロトコルに反しxenofree iPS細胞を製造することができます。これは明らかな種の壁を持たないウイルスよりも大きな導入遺伝子カーゴ容量を有します。これは、簡単にレベル1の生物学的安全キャビネットを装備したすべての実験室で実施することができる標準的な細胞トランスフェクション法の使用により、プラスミドトランスポゾンの簡単かつ安全な送達を可能にします。トランスポザーゼ再発現は、様々なCEに示されているように、足跡のないマウスおよびヒトiPS細胞の結果的生成とPB要素の除去を可能にしますLL線32、34、35。別の研究では、トランスポゾンシステムは、癌関連遺伝子およびウイルスベースのベクター43、44、45、46、47と比較して活性遺伝子を標的にあまりバイアス近く標的に低い周波数を表示することを示しました。トランスポゾンに基づくリプログラミングは、選択された配送方法に依存しており、これが原因で、DNAトランスフェクション法（リポフェクション、エレクトロポレーションまたはヌクレオ）に関連した抵抗性または毒性に制限です。ここでは、マウスのAF細胞とよく働いたDNAをトランスフェクトするために設計された非リポソーム製剤を使用していました。他のセルが使用される場合は、試験は高効率かつ低毒性の点で最良の配信方法を使用することが必要であろう。即決、PBトランスポゾン方法は、安全ANであると考えられていますD低コストが、センダイウイルスベクターを用いて比較して低い効率で。 マウスAF細胞を得るための手順については、利用可能な妊娠中の雌マウスを持っていることが重要です。このように、交配の適切な数（オスあたり2人の女性との少なくとも6人の女性）を設定する必要があります。 より多くの実験は、健康と病気の胎児からiPS細胞を生成するために、ヒトAF細胞に特異的に行うことができます。出生前診断によって検出することができる先天性疾患の広い範囲を考慮すると、妊娠中にAFから得られた細胞は、病気48を検討し、また、組織欠損の場合には再生医療のアプローチを計画するための両方のためのiPS細胞を誘導するための最良のソースを表します心臓や骨格筋49、50など。

出生前診断は、遺伝性疾患（ すなわち染色体異常、単成または複成/多因子疾患）と先天性奇形（ すなわち先天性横隔膜ヘルニア、嚢胞性肺病変、臍帯ヘルニア、胃壁破裂）を評価するための重要な臨床的ツールです。羊水（AF）細胞（ すなわち 、羊水穿刺およびamnioreduction）または帝王切開1、2妊娠中期の間に定期的にスケジュールされた手順から取得するのは簡単です。出生前または新生児の患者からのAF細胞の利用可能性は、再生医療のためのこのソースを使用する可能性を提供し、いくつかの研究は、AF 3、4、5、6から単離された幹細胞集団を使用して、異なる組織の損傷または疾患を治療する可能性を検討しました、7、8、9、10、11、12。簡単に罹患した患者からのAF細胞を得る可能性は、疾患はしばしば静止している時間ウィンドウ内で、再プログラミングのために、この細胞源を使用するというアイデアに道を開きます。実際、AF細胞由来の人工多能性幹（iPS）細胞は、出産前の適切な患者特有の治療を製造するために、 インビトロでの薬物試験のために、または組織工学的アプローチのための目的の細胞に分化することができます。多くの研究は、既に細胞型13、14、15、16、17 &lt;広範囲に再プログラムと区別されるAF細胞の能力を実証しています/ SUP&gt;、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。 4転写因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）の強制発現を介して、再プログラミングされた体細胞の高橋と山中28によって発見されて以来、進展が再プログラミングの分野で行われています。異なる方法を考慮すると、我々は、ウイルスおよび非ウイルス性のアプローチを区別することができます。最初は、部分的に再プログラムされた細胞株の結果とのリスクの両方で、高効率レトロウイルス導入遺伝子の通常不完全なサイレンシングを有するウイルスベクター（レトロウイルスおよびレンチウイルス）の使用を想定し挿入突然変異29、30、31。 すなわちプラスミド、ベクター、mRNA、タンパク質、トランスポゾン：非ウイルス法は、異なる戦略を使用しています。トランスジェニック配列を含まiPS細胞の誘導は、漏出性導入遺伝子発現および挿入突然変異の潜在的に有害な影響を回避することを目指しています。上記の全ての非ウイルス戦略の中で、のpiggyBac（PB）トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは挿入または切除イベント32を触媒する導入遺伝子およびトランスポザーゼ酵素の一過性発現に隣接する唯一の逆方向末端反復を必要とします。 iPS細胞の生成のための他の方法を介してトランスポゾンを使用する利点は、レトロウイルスベクターの同じ効率を示す非ウイルスベクターアプローチとベクトルフリーiPS細胞を得る可能性があります。これはreprogrのための統合されたトランスポゾンエンコーディングのトレースレス切除することにより可能ですiPS細胞33内のトランスポザーゼの新たな一過性の発現以下の要因をamming。 PBは、異なる細胞型34、35、36、37に効率的であることを考えると、ウイルスベクターに対する臨床的アプローチに適している、および生体異物を使用し、現在のウイルス産生プロトコルに反して異種非含有のiPS細胞の産生を可能にします条件は、このシステムは、マウスAFからiPS細胞を得るために使用されます。 ここでは、マウスのAF細胞（IPS-AF細胞）38からの多能性のiPSクローンの生産を表示するには、すでに発表された研究を、以下の詳細なプロトコルを提案します。

<table><tbody><tr><td>100 mm Bacterial-grade Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; differentiation</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase kit&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Alkaline Phosphatase&amp;nbsp; staining</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>For bacterial selection</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bacteria for cloning procedure</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Doxycycline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>For exogenous factors expression</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>72.706</td><td>For PB production&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>For MEF medium</td></tr><tr><td>Fine point forceps</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&amp;nbsp;</td><td>AF isolation</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Used 0.1%, diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>For blocking solution. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Haematoxylin QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Nuclei detection</td></tr><tr><td>HE&amp;nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Histological analysis of teratoma</td></tr><tr><td>Hoechst&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Nuclei detection</td></tr><tr><td>Horse Serum&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>For blocking solution</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Secondary antibody (immunoperoxidase)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Peroxidase substrate</td></tr><tr><td>Insulin syringe with needle (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Amniocentesis procedure</td></tr><tr><td>Klf4&amp;nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Rabbit polyclonal IgG</td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>LB broth (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>For bacterial growth</td></tr><tr><td>LIF&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>For mouse AF and iPS-AF cells medium</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; differentiation. Diluted 1:10 in DMEM</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Peroxidase blocking</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24 well plate</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; differentiation</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6 well plate</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture</td></tr><tr><td>Nanog&amp;nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Rabbit polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Non-essential amino acids&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>For blocking solution. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Mouse monoclonal IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>For RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (solution)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, free of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x</td></tr><tr><td>Penicillin - Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td></tr><tr><td>Petri Dish (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>For MEF culture, tissue culture</td></tr><tr><td>PiggyBac transposase expression plasmid&amp;nbsp;</td><td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td><td>-</td><td>mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid</td><td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td><td>-</td><td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>For plasmids purification</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>For plasmids purification</td></tr><tr><td>Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid&amp;nbsp;</td><td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td><td>-</td><td>rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td>Sox2&amp;nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>Goat polyclonal IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Mouse monoclonal IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>For RT-PCR</td></tr><tr><td>T&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Rabbit polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Cell culture passaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>For RNA extraction</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubb3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G712A</td><td>Mouse monoclonal IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1x</td></tr><tr><td>&amp;alpha;fp&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>Mouse Monoclonal IgG1</td></tr><tr><td>&amp;alpha;SMA&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Mouse Monoclonal IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfection Reagent (FuGENE HD)</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>E2311</td><td>For AF cells transfection</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>To perform amniocentesis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l tips</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>70.760012</td><td>To pick bacteria colonies</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 stainless 25U</td><td>To perform amniocentesis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>To clean the abdominal wall of the pregnant dam</td></tr><tr><td>Tissue culture petri dish (150 mm)&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>For MEF expansion</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>For MEF inactivation</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96 well plate</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>For iPS-AF culture</td></tr></tbody></table>

the production of pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells using a transposon system

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

再プログラミングの能力を評価するために、マウスAF細胞をGFPマウスの胎児から採取しました。細胞は、PB-（ドキシサイクリン誘導方法でmCherryを蛍光タンパク質に連結山中因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）を発現円形トランスポゾンプラスミドPB-tetO2-IRES-OKMSでトランスフェクション、およびテトラサイクリントランスを逆にしました。 CAG-のrtTA）トランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒にプラスミド。マウスAF細胞をMEFフィーダー層上のインビトロ拡張の1週間後のOct4、Klf4の、CMYCおよびSox2のトランスフェクトしました。以前39に記載されているように 、外因性因子の発現のために、ドキシサイクリンは、1.5 / mlの濃度で、トランスフェクションの翌日に添加しました。 mCherryをの発現は、トランスフェクションを示すドキシサイクリン加え、24時間後に見えました。 ES様の形態を持つ最初のコロニーは20日DOX後に登場しましたycycline誘導および30日後にトランスフェクションを採取しました。これらのコロニーは、不活性化された線維芽細胞フィーダー層上に播種しました。複製されたウェル33内の独立したドキシサイクリンであることが判明するまで、ピッキングした後、生き残ったクローンは、いくつかの通路のためにドキシサイクリンを添加した培地中で維持しました。 マウスのiPS-AFのクローンが異なるパラメータについて評価した：mCherryを発現、アルカリホスファターゼ染色、多能性マーカーのOct4、Sox2の、Klf4の、Nanog及びSSEA1のタンパク質の発現は、外因性および内因性多能性遺伝子の発現（Oct4の、Klf4の、CMYCおよびSox2の） 、 インビトロ （EBS）およびin vivoで （奇形腫アッセイ）分化。 図1にまとめたように彼らは、彼らの多能性を検証するために評価されたすべての基準を満たしました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54598/54598fig1.jpg" /> 図1： マウスのAF GFP + 細胞 の再プログラミング 。 IPS-AF GFP +細胞の（A）ドキシサイクリン独立したコロニーは、アルカリホスファターゼ（ALP）染色にmCherryを発現するための陰性および陽性でした。スケールバー= 250μmから100μmです。 （B）のOct4、Sox2の、Nanogの、Klf4のとSSEA1を発現する安定ドキシサイクリン非依存のiPS-AF GFP +細胞の代表的な画像を。スケールバー=100μmです。 （C）外因性（ベクトルベースプライマーTg）は内因性（ のOct4、Klf4 の、CMYCおよびSox2の ）遺伝子の発現のためのRT-PCR分析。 β-2-ミクログロブリン （B2M）は、ハウスキーピング遺伝子としました。ドキシサイクリンの（96時間） - （）再プログラム化細胞株は存在（+）または非存在下で増殖させました。 R1 ES細胞を対照として使用しました。 （PCRパネルはベルタンらから変更されている。38 </SUP&gt;）。 （D）6週間RAG2の後肢へのiPS-AF GFP +細胞の注射の後に得られた奇形腫の総出現- / - γC - / -マウス。 （E）奇形腫の組織学および免疫染色はすべての3つの胚葉（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）への細胞分化を確認しました。 αfetoprotein（AFP、内胚葉）は、αsmooth筋アクチン（αSMA、中胚葉）、およびβ3チューブリン（Tubb3、外胚葉）は、腫瘍塊で検出されました。スケールバー=100μmです。 （F）のEB及びテラトーマ（TE）のRT-PCR分析。 C +、ポジティブコントロール。 NTC、非テンプレートコントロール。 ビメンチン （Vimの 、中胚葉）、αfetoprotein（AFP、内胚葉）及びβ3チューブリン （Tubb3、外胚葉）。 （PCRパネルは、基準38から変更されています）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54598/54598fig1large.jpg" target="_blank">番目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>図です。

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The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K ビュー.  Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza. In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. 

ビデオ: The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

発生生物学

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

生物学

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

遺伝学

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...