We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

注：患者は、治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与えるべきであり、ヒト多能性幹細胞の委員会は、研究を承認しました。 1.単離とのTILの文化<ol><li>病理サービス/組織の調達コアからの病理組織学的診断のために必要とされない腫瘍材料を入手します。メディアを収集する30ミリリットルの腫瘍（ 表1）を用いて50 mlチューブに腫瘍標本の20〜100グラムを置きます。 </li><li>固体、しっかりと、はさみを使用して、脆弱および/または血の壊死領域からの腫瘍標本の正常組織を解剖。壊死組織を除去した後、可能な限り小さく、試料をミンチするはさみを使用してください。 </li><li>製造者の指示に従って解離および腫瘍解離キット（ヒト）を使用して単一細胞懸濁液に刻んだ試料を解離させます。 50ミリリットルチューブに設定されている70μmのセルストレーナーでサスペンションを濾過して、ストレーナを2回洗浄RPMI1640培地2mlの。 </li><li> 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、T細胞培地（ 表1）の10ミリリットル中に細胞を懸濁します。 </li><li> 100％勾配液及びダルベッコのリン酸で希釈した75％の勾配溶液30mlの中間ステップを10mlの下段で、50 mlチューブにかかるフィコール（勾配液）としての2段階勾配液を調製緩衝生理食塩水、無カルシウム、無マグネシウム（D-PBS（ - ））。 </li><li> （ステップ1.5）の勾配溶液に（工程1.4からの）細胞懸濁液レイヤ。 45分間20℃で400×gで遠心分離します。 </li><li> 100％勾配溶液、50 mlチューブ75％勾配液との界面に濃縮されたのTILを含む層を集め。 （ - ）D-PBS 20〜30 mlで添加することによって富化のTILの溶液の層を希釈します。 </li><li> 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、10mlのTIL濃縮画分を再懸濁T細胞メディア。 </li><li> 37℃、5％CO 2で6ウェルプレート中のT細胞培地を2ml 6,000 IU / mlの組換えヒト（RH）IL-2との培養（工程1.8からの）画分。 </li><li>培養開始後5日目に半分メディアを変更し、その後2〜3日ごと。 </li><li> 80〜90％コンフルエントに達したとき、ウェルの数を2倍、そっと懸濁した後、トリプシン処理することなく、2：1の割合で細胞を分割します。 6000 IU / mlで新鮮なT細胞培地とのrhIL-2の半分の体積（1ミリリットル）を追加します。 </li></ol>マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞プレートの調製<ol><li> 0.1％ゼラチンでコーティングした10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞培地（ 表1）10ml中の培養SNLフィーダー細胞を80〜90％コンフルエンス（3-4×10 6細胞）に到達するまで。 </li><li>直接SNLフィーダー細胞培養皿に0.4 mg / mlでマイトマイシンC溶液310μLを加え、37℃で2時間15分間、5％CO 2でインキュベートします。メディアAを吸引（ - ）ND 5ミリリットルのD-PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 0.5ミリリットル0.25％のトリプシン/ 1mMのEDTAを添加し、細胞を解離するために1分間室温でインキュベートします。単一の懸濁液に細胞を中和し、再懸濁するためにSNLフィーダー細胞培地の4.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 5分間、200×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に細胞を移します。メディアを吸引し、SNLフィーダー細胞培地10mlに再懸濁した後、血球計算板を用いて細胞を数えます。 </li><li>プレート10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞のウェル当たり1.5×10 6細胞を、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 3日以内のSNLフィーダー細胞を使用してください。 </li></ol>センダイウイルス（SeVの）ベクトルを用いたiPS細胞の3世代<ol><li> （ステップ1.11から）のTILを収穫し、プレート結合マウス抗ヒトCD3（1μg/ ml）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの5×10 5細胞を活性化し、のrhIL-2と3で6ウェルプレート中のT細胞培地2ml中（6,000 IU / ml）を7℃で、5日間、5％CO 2。 </li><li>ピペットを用いて15mlチューブ（ステップ3.1）からのTILを採取し、血球計で細胞数を数えます。 </li><li> 500μlの中のrhIL-2（60 IU / ml）で、プレートに結合したマウス抗ヒトCD3（1μg/ mlの）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの1×10 5個の細胞を再活性化37℃で24ウェルプレート中のウェルあたり再プログラム培地（ 表1）、24時間、5％CO 2の。センダイウイルス感染のための3つのウェルを準備します。OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC（1ウェル）。センダイウイルス感染（GFP：緑色蛍光タンパク質）（1ウェル）。細胞数（1ウェル）。 </li><li> （ステップ3.3から）24時間後、血球計数器を用いて細胞数をカウントし、感染症の様々な（3-20）多重度（MOI）のために各ウイルスの量を決定します。 -80℃ストレージからセンダイウイルスベクター管の1セットを削除してください。水浴（37℃）で急速センダイウイルスベクターを解凍し、氷の上に置きます。 ウイルスの容量（μL）ウイルスの細胞/力価（CIU / ml）を×10-3（μL/ ml）を= MOI（CIU /セル）x個</li><li>活性化のTILを含む培地中に10〜20 MOIでセンダイウイルスベクターの混合物を添加することにより、個別にOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCを担持4センダイウイルスベクターチューブのそれぞれの計算されたボリュームを追加します。 </li><li>形質導入効率を決定するために、活性化したのTILのウェルにのSeV-GFPの計算されたボリュームを追加します。 </li><li> 24時間、37℃、5％CO 2のインキュベーター内（ステップ3.5およびステップ3.6から）の皿を置きます。 24時間後、蛍光顕微鏡下でのSeV-GFPに感染したTILを使用して、感染効率を推定します。 </li><li> 15ミリリットルチューブに（ステップ3.5から）の細胞を収集します。 5分間、室温で200×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、霊長類ES細胞用培地および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ngの/ ml）でのhESC培地0.5mlにペレットを再懸濁。 </li><li>コンタ10cmの皿にサスペンションを移しインのhESC培地10mlにSNLフィーダー細胞をマイトマイシンCで処理しました。コロニーが成長するまで一日おきのhESCのメディアを変更します。 </li><li> 18〜21日頃、クリーンベンチ内で10μlのチップを用いて、顕微鏡下でコロニーの周りのSNLフィーダー細胞を除去します。 </li><li> 10μlのチップを用いてコロニーを掻き取り、96ウェル組織培養プレートのウェルあたりiPS細胞培地100μlの中に200μlのチップを使用して転送します。 2-3時間で上下ピペット50から100ミクロンの平均サイズが小さな塊にコロニーを破壊します。 </li><li>塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、4 NG / ml）を用いてiPS細胞培地のウェルあたり2ml中の（工程2から）マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートに小塊を移します。毎日iPS細胞のメディアを変更します。 </li><li>すべての5-6日に1mg / mlのコラゲナーゼIVで新鮮マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートにiPS細胞を移します。 IMMUNのために各クローンのプレート当たり2つのウェルを準備ostaining。 </li><li>多能性マーカー（SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、およびOCT3 / 4）1の免疫組織化学染色により各クローンの完全な再プログラミングを決定します。 注：多能性の可能性をさらに評価するために、完全に再プログラムIPSCラインが胚様体形成および分化アッセイまたはテラトーマ形成アッセイ16により三胚葉に分化することができることを確認します。 </li><li>完全に再プログラムIPSCラインは細胞遺伝学的解析により、正常な核型を示すことを確認してください。 </li><li>テラトーマ形成のために、6〜8週齢の雌NOD / SCIDマウスの皮下組織に10％FCSを含むDMEM100μl中の未分化TIL由来のIPSC（1×10 6）の懸濁液を注入します。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色奇形腫セクション。 </li></ol> SSEA3、SSEA4、TRA1-60およびTRA1-81のためのiPS細胞の4.免疫蛍光染色<ol><li> 1 mlのPBSと4％のPAの1ミリリットルでiPS細胞を固定で洗浄性IPSC10分間raformaldehydeソリューション。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、1mlのPBSで3回iPS細胞を洗います。 注：パラホルムアルデヒドを使用しているとき、それは毒性があるので注意してください。 </li><li> 30分間緩衝液（ 表1）を遮断してiPS細胞を前処理。一方、PBSおよびトリトンで希釈した一次抗体（ラット抗ヒトSSEA3、マウス抗ヒトSSEA4、マウス抗ヒトTRA1-60、およびマウス抗ヒトTRA1-81）1時50分1.5％ヤギ血清溶液を希釈-100（総容量：1ミリリットル）。 </li><li>ブロッキングバッファー（ 表1）を取り外します。希釈した一次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。一方、1.5％ヤギ血清溶液中で二次抗体（抗マウスIgGおよびIgMまたは抗ラットIgM抗体）1:50に希釈します。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。希釈された二次抗体溶液を添加し、暗室において室温で45分間インキュベートします。 </l私&gt; <li>希釈した二次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡を用いてiPS細胞を観察します。 </li></ol> Oct3 / 4用のiPS細胞の5.免疫蛍光染色<ol><li> 1 mlのPBSと10分間、4％パラホルムアルデヒド溶液の1mlでiPS細胞を固定と洗浄性IPSC。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSで3回iPS細胞を洗います。 </li><li>透過化緩衝液（ 表1）を加え、室温で10分間インキュベートします。透過化緩衝液を除去し、緩衝液（ 表1）をブロックに追加します。 </li><li>室温で30分間インキュベートします。一方、ブロッキング緩衝液中で一次抗体（マウス抗ヒトのOct3 / 4）1:50に希釈します。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を除去し、5分間、PBSの1ミリリットルで3回、それぞれのiPS細胞を洗います。一方、ディブロッキング緩衝液で100：二次抗体（ヤギ抗マウスIgG / IgM抗体）1リュート。 </li><li>希釈された二次抗体溶液を添加し、45分間、暗室において室温でインキュベートします。 </li><li>希釈した二次溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡下でiPS細胞を観察します。 </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

ここでは、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCは、4つの転写のセンダイウイルス媒介形質導入によりiPS細胞に黒色腫のTILを再プログラミングするためのプロトコルを要因を明らかにしました。このアプローチは、T細胞を再プログラムするためのSeVシステムを使用して、非組込み方法7の利点を提供します。 以前の研究では、センダイウイルスの再プログラミング・システムは、線維芽細胞だけでなく、末梢血T細胞7,17のみならずを再プログラムするために高効率で信頼性の高いことが示されました。また、我々は最近、より分化しており、末梢血T細胞は、センダイウイルスベクター16を使用して再プログラムすることができるよりも、例えば、PD-1のような阻害性受容体の高いレベルを発現するメラノーマのTILを示しています。センダイウイルスベクターを用いた抗CD3 / CD28による刺激や感染のタイミングが再プログラミングのTI​​Lで重要でした。末梢血T細胞を被験者7、whilから収穫後直ちに再プログラミングのために抗CD3およびIL-2で刺激することができEののTILは、刺激の前にIL-2で3〜4週間培養する必要があります。 TILの99％以上は、抗CD3 / CD28 16とIL-2および活性化と文化の3-4週間後にCD8 T細胞であったが、私たちは、性IPSCはのTIL（ 図からある発生したことを確認するために、iPS細胞にTCR再配列の解析をお勧めします5）。注目すべきことに、我々を含む以前の研究は、すべてのiPS細胞は、末梢血単核細胞からのSeVを用いて生成されたかのTILは、TCR再配列7,16を有することを示しました。 メラノーマのTILからのiPS細胞の生成が可能であったが、我々は黒色腫のTILの再プログラミング効率は、末梢血T細胞（0.1％）7よりも16（0.01〜0.05％）より低かったことを見出しました。この理由は不明のままであるが、それは抑制性受容体の高い発現またはTILを13,16で分化したT細胞サブセットの大きい番号に関連付けられている可能性があります。最近の重要な進展リプログラミング技術のためTIL-iPS細胞の生成のための初期化の効率を向上させることができます。第二世代SeVベクター、TS12KOSは、以前の研究18,19で使用される従来のSeVベクターよりIPSC世代の高効率を有することが判明しました。 センダイウイルスの再プログラミングシステムによるヒトiPS細胞の導出が可能であるが、このプロトコルで考慮すべきいくつかの制限があります。私たちは、このプロトコルでSeVの感染の間にウシ胎児血清を使用します。私たちは、のTILの同様の増殖にもかかわらず、ウシ胎児血清を有するものと比較したSeV感染の間にヒト血清を含む培地を使用している場合は、黒色腫のTILの再プログラミング効率が有意に低いことがわかりました。また、IPSCの生成と維持のために、マウスフィーダー層を使用しますが、定義された無フィーダーと異種非含有システムは、将来の研究における代替方法であるとしてもよいです。 iPS細胞を生成するために、腫瘍の収穫の時から2ヶ月の周りにそれを取りますメラノーマのTILから。また、導入遺伝子を含まないiPS細胞を得るために、さらに1〜2ヶ月かかるだろう。これは、より効率的なウイルス除去率19を示しているSeVベクター、TS12KOS、新しいタイプを使用することによって短縮される場合があります。 結論として、メラノーマのTIL由来のヒトiPS細胞の生成が可能です。現在のプロトコルは、養子T細胞療法のための腫瘍特異的T細胞の無限の数を生成するための重要なステップであるかもしれません。

転写因子の定義されたセットの過剰発現を介して人工多能性幹細胞（iPS細胞）の生成を可能にする細胞再プログラミング技術は、細胞ベースの治療法1,2の分野において非常に有望です。これらのiPS細胞は、転写およびエピジェネティックな特徴を示すと同様に、胚性幹細胞（ESC）3-5の自己再生および多能性の能力を有します。過去10年間にリプログラミング技術で作られた著しい進歩は、私たちはあっても、このようなT細胞6-8のような分化細胞からヒトiPS細胞を生成することができました。 T細胞由来のiPS細胞（TiPSCs）はTiPSCs 9-11からの抗原特異的T細胞の再生を可能にする、元のT細胞などのT細胞受容体（TCR）鎖遺伝子の再配列と同じ構成を保持します。 患者の腫瘍から得られた黒色腫浸潤リンパ球（TILを）のほぼ80％は、具体的には、A、腫瘍関連抗原を認識するNDオリジナルの癌細胞12に対する細胞傷害性を維持します。注目すべきこと、のTILのプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）の発現は、突然変異した新生抗原特異的CD8 +リンパ球13を含む自己腫瘍反応性レパートリーを同定することが見出されました。取リンパ球枯渇レジメンおよびインターロイキン2（IL-2）の全身投与と組み合わせてex vivoで拡大した自己のTILの養子移入は、患者14のサブセットに転移性メラノーマの実質的な後退を引き起こす可能性があります。前臨床モデルおよび患者に結果を励みにもかかわらず、貧しい注入されたT細胞の生存および免疫抑制経路の存在は、養子T細胞療法の可能性を最大限に妥協するように見えます。現在の臨床プロトコルは、多数を得るために、自己T細胞の大規模なex vivoでの操作を必要とします。これは、悪い生存率を有する最終分化T細胞の生成をもたらす、減少proliferative容量、およびPD-1 15の高レベル。 養子T細胞療法のこの制限は、理論的には、免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供することができるiPS細胞を使用することによって克服することができます。我々は最近、センダイウイルス（SeVを）4転写因子の媒介形質導入、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 16によるPD-1の高レベルで発現メラノーマのTILの再プログラミングを報告しています。レトロウイルスベクターは、再プログラミング遺伝子を発現するために宿主染色体への統合を必要とするが、センダイウイルスベクターは、非組み込みがあり、最終的に細胞質から排除されています。リプログラミング効率がレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを6-8と比較したSeVシステムとはるかに高いです。レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターにより生成されるいくつかのIPSCのクローンは非リンパ系系列6-8由来することができるしながらさらに、センダイウイルスは、具体的には、末梢血単核細胞（PBMC）中のT細胞を再プログラムすることができます。ここでは、詳細手順は、ヒトメラノーマのTILの単離および活性化のためにとのSeVの再プログラミング・システムを使用してTIL由来のiPS細胞の生成のために実装されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">gentle MACS C Tubes</td>
			<td style="width:287px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:132px;">130-093-237</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">gentle MACS Dissociator</td>
			<td style="width:287px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:132px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Tumor Dissociation Kit, human</td>
			<td style="width:287px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:132px;">130-095-929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Falcon 70 um Cell Strainer</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">IMDM</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">human AB serum</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">L-glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">gentamicin</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:287px;">GE</td>
			<td style="width:132px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">D-PBS (-)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">recombinant human (rh) IL-2</td>
			<td style="width:287px;">Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">555329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:287px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">FBS</td>
			<td style="width:287px;">Gibco</td>
			<td style="width:132px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">HEPES</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:287px;">Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:132px;">NDC 66220-207-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td>
			<td style="width:287px;">Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td>
			<td style="width:287px;">Corning</td>
			<td style="width:132px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Sendai virus vector</td>
			<td style="width:287px;">DNAVEC</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">SNL feeder cells</td>
			<td style="width:287px;">Cell Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:132px;">CBA-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mitomycin C</td>
			<td style="width:287px;">SIGMA</td>
			<td style="width:132px;">M4287</td>
			<td>soluble in water (0.5 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin</td>
			<td style="width:287px;">SIGMA</td>
			<td style="width:132px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primate ES Cell Medium</td>
			<td style="width:287px;">Reprocell</td>
			<td style="width:132px;">RCHEMD001</td>
			<td>warm in 37 &#8451; water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ReproStem</td>
			<td style="width:287px;">Reprocell</td>
			<td style="width:132px;">RCHEMD005</td>
			<td>warm in 37 &#8451; water bath before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes

ex vivoでの養子移入は、転移性黒色腫を有する患者のかなりの部分集合で、耐久性と完全な応答を媒介することができる自己腫瘍浸潤リンパ球（TILを）を拡大しました。このアプローチの主要な障害は、テロメアの短縮に起因する転送T細胞の減少生存率であり、のTILの限られた数の患者から得られました。長いテロメアを有するあまり分化T細胞は、養子T細胞療法のための理想的なT細胞のサブセットであろうが、これらのあまり分化T細胞を大量に生成することは問題があります。この養子T細胞療法の制限理論的にその自己複製人工多能性幹細胞（iPS細胞）を使用することによって克服することができる、多能性を維持するためには、テロメアの伸長、および免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供しています。ここで、我々はのTILへの再プログラミング因子の伝達にセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、生成します完全に再プログラム、ベクトルフリーのクローンです。これらのTIL由来のiPS細胞は養子T細胞療法のためのあまり分化patient-および腫瘍特異的T細胞を生成することができるかもしれません。

図1は、抗CD3 / CD28による活性化とのTILにOCT3 / 4、KLF4、SOX2、およびc-MYCの遺伝子導入が続いているのrhIL-2と黒色腫のTILの初期膨張を伴う手順の概要を示していますiPS細胞の生成のため。通常、のrhIL-2開始と文化についてのTILは21-28日間培養開始後に球を形成しました。この時点で、のTILは、抗CD3 / CD28で活性化される準備ができていること、21日目のrhIL-2と文化を、。 図2AはのTILを示している抗CD3 / CD28で活性化される準備ができている。 図2Bは、GFPの導入を示しています20でトランスフェクトされたセンダイウイルス（SeVを）によってMOI。 図2Cは、18-21日のSeV感染後に表示されるのSNLフィーダー細胞上の典型的な多能性クローンを示している。 図2Dは、生成されたTIL由来のiPS細胞は、正常な核型を持っていることを示している。図3図免疫蛍光染色は、pを確認するために、性IPSC（SSEA3、SSEA4、TRA1-81、TRA1-60、及びOCT3 / 4）にluripotencyマーカー発現。 図4は、黒色腫のTIL由来iPS細胞は、3胚葉（神経からの種々の細胞が含まれている奇形腫を形成することができることを示しています組織、気道上皮、および軟骨）。TIL由来のiPS細胞は、TCR再配列を保持して生成された図5に示す図 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig1.jpg" /> 図1： メラノーマのTILからのiPS細胞の生成の概略プロトコルは三つの段階が含ま：分離と文化のTILのIL-2と、抗CD3 / CD28とT細胞の活性化、およびセンダイウイルス（SeVを）を用いて細胞の再プログラミングをベクトル符号化OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <p<html>キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;：FOクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig2.jpg" /> 図2：彼らは培養開始後2-3週間を展開するメラノーマのTILからのiPS細胞の作製 （A）のrhIL-2でのTILの形態を表す画像を開始しました。 （B）のSeV感染後のTIL 1日の形態およびGFPの発現を表す画像。 （C）のSeV感染後21日目に、典型的なESCのようなIPSCコロニー。 =200μmのスケールバー。 （D）、黒色腫のTIL由来iPS細胞の1から20のG-バンド化中期細胞上の細胞遺伝学的分析。図（D）は、斉藤ら 16から適合されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：幹細胞の多能性マーカーと免疫蛍光染色免疫蛍光アッセイは、2人の患者からのTIL由来のiPS細胞は、SSEA3、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60、およびOCT3 / 4について陽性であることを示しています。スケールバー= 100μm.Theの図は斎藤ら 16から適合されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig4.jpg" /> 図4：（NOD / SCIDマウスへの6週間後注射）TIL由来のiPS細胞クローン由来奇形腫形成ヘマトキシリンとiPS細胞およびエオシン染色した代表的な奇形腫のセクションのための多能性の確認が表示されます。斎藤ら 16から適応図。.COM /ファイル/ ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig5.jpg" /> 図5：TIL-iPS 細胞におけるTCR-β遺伝子の配列パターンの多種多様な TIL-iPS細胞におけるTCR-β遺伝子再編成は、キャピラリー電気泳動によって識別されます。緑のラインはJβ1遺伝子のためのバンドから導出され、青のラインがJβ2遺伝子のためのバンドから導き出されます。図は斎藤ら 16から適合されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54375/54375tbl1.jpg" /> 表1：T細胞のための作曲、再プログラミング、トンumor SNLフィーダー細胞、およびIPSCメディア、および透過性及びブロッキングバッファーは、収集。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375tbl1large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K ビュー.  University of Michigan. The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

ビデオ: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

発生生物学

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...