We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N&#176; SFI20111203770 and N&#176; PJA 20131200143.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、ライブイメージングと細胞移植を使用してキメラ胚の生成を組み合わせることにより、 インビボでの細胞遊走における候補遺伝子の役割を研究するための簡単な方法を提示します。 モザイク胚の作成細胞のダイナミクスを研究することは、細胞質拡張を分析するために、その輪郭の可視化が必要となります。良好な視覚的なコントラストを提供し、環境 - または異なって標識された - これは、そうでなければ、非標識で単離された細胞を標識することによって達成することができます。 確率的に胚における細胞の一部を標識する簡単な方法は、1細胞期16でプラスミドDNAを注入することです。注入されたプラスミドは、ランダムかつ不均等に細胞分裂中の細胞に分離される凝集体を形成します。これは、セルのランダムなサブセットにおけるプラスミドの発現をもたらし、従ってMOを生成するために非常に速く、簡単で非侵襲的方法を表しますSAIC胚。しかし、注入されたプラスミドを発現する細胞は、クラスターを形成する傾向があり、将来の脊索前板に少数の単離された発現する細胞を含む胚を発見する確率は極めて低いです。さらに、プラスミドDNAの使用は、注入された構築物の発現レベルの非常に限られた制御を提供しています。プラスミドDNA注入よりも技術的に難しいが、細胞移植によるキメラ胚の作成は、多くの利点を提供しています：移植された細胞の数の制御を、構築物（RNA注入）の発現レベルの制御、および最後のではなく、少なくとも、細胞移植は、細胞が機能構築物の損失または利得を含んで移植されたモザイク胚を作成することによって、細胞自律的な効果のためにテストすることができます。逆に、移植はまた、修飾された胚に野生型細胞を移植することにより、環境の非自律的な役割を評価するために使用することができます。これは、テストのために特に関心のものとすることができます例えば、細胞遊走の分析に特に関連する細胞外マトリックス成分の機能。 細胞移植のための詳細なプロトコールは、すでに10に記載されています。このプロトコルに比べて、私たちは私たちの手順2つの主要な相違点を議論したいと思います。 第1の相違点は、ドナー胚注入の段階に関連しています。我々の経験によると、蛍光タンパク質のRNAと1細胞期に注入した胚が原因細胞内のRNAの不完全な拡散のために、すべてのセルに均一に蛍光タンパク質を発現しません。 4つのセルのいずれかで、4細胞期でのドナー胚の注入は、蛍光タンパク質のRNAを同時注入トレーサブルではない他のRNAとしているときに特に関心のある細胞の均質なクローンを、取得することができます。 第二の主な違いは、transplantat中の代わりに油の空気の使用でありますイオンシリンジ。空気で満たされたシステムの主な欠点は、空気の弾性に起因する慣性力です。オイルは逆に、非圧縮性であること、吸引圧力の良好な制御を提供しています。しかし、少しのトレーニングで、針の薄い、テーパ部に空気と胚の媒体との間のインターフェースを維持することにより、空気充填システムと吸引圧力の制御は、シールド段階で細胞を移植するのに十分です。細胞はより小さく、より粘着性になるように後の段階のために、吸入空気が充填​​された設定を用いて達成することができない非常に正確に制御する必要があり、高圧を必要とします。セットアップが任意の気泡なしでオイルを充填システムとして、油の代わりに空気を容易に使用することは難しいです。また、油と移植針を充填避けます。これは、移植針を再利用することを可能にし、従って慎重に調製します。私たちは、鋭いエッジがなく、正確な直径の針がsucceの鍵であることを感じますssful移植。この移植ステップは明らかに簡単に実行される前に練習が必要プロトコル、における重要なステップの1つです。 私たちは、移植針内で一意のセルを描画するために、移植前に、細胞を解離することからなる単一の細胞を移植するための具体的な手順を、また提案しています。これは一過性の細胞解離は、自分のアイデンティティおよび/または動作を変更しないことを意味します。脊索前板前駆細胞のために、我々は遺伝的に細胞のアイデンティティを課す、と慎重にこれらの細胞は非解離のもののように振る舞うことをチェックしています。しかし、我々は正式に解離および/または遺伝的誘導が細胞内で見過ごさ修正を誘導することを除外することはできません。それらを解離することなく、単一の細胞を移植することは可能です。細胞は、移植針に慎重に策定されるべきです。しかし、少なくとも我々の手で、成功率は非常に低く、いずれか2つ以上のセルが旧姓になるためDLE、または策定し、針で死ぬか、一度移植された細胞ばさみが原因。 高速共焦点イメージング対落射蛍光モザイク胚を作成するために、細胞移植の使用は、他の標識された細胞から分離された単離された細胞を標識を可能にします。プロトコルで提案され、この文脈では、細胞形態及び動態の優れたイメージングは​​、標準的な落射蛍光顕微鏡を用いて達成することができます。これは、比較的広範囲の装置とより高価な共焦点イメージングシステムへの低コストの代替であることの明らかな利点を有します。 正確な細胞内局在のために、共焦点画像は、特定の軸方向の解像度で、解像度を改善するために使用することができます。まだ十分な時間分解能を得るには、高速共焦点イメージングを使用する必要があります。私たちの経験から、スピニングディスク顕微鏡は、解像度、スピードと光毒性の間の妥協点を提供します。高速走査型共焦点マイク（共振走査型顕微鏡のような）roscopesにも良いオプションですが、あまり頻繁で、より高価。 細胞骨格のラベリングアクチンフィラメントとそのダイナミクスの良好な標識は、アクチンベースの細胞移動のメカニズムを研究することが重要です。膜に結合した蛍光マーカーは、細胞の輪郭を分析するほうが効率的ですが、アクチン標識が細胞突起のより良い可視化を可能にします。 3標識された細胞が接触し得る場合に特に、拡張の輪郭と混同を受けることができ、隣接細胞の膜のように2つの隣接するセルの間に位置する細胞質拡張を識別することは非常に困難です。アクチンフィラメントをラベリングすることは、我々が注目しているアクチンベースの細胞突起の明確な検出を可能にします。細胞の形態は、定量化されることになっていた場合、膜の標識が好ましいであろう。別のオプションは、いずれかのトランスジェニックのLi 3色画像（いずれかを使用して、両方の標識を使用することですね、アクチンおよび膜のための1のための1つ）、または膜を標識GFPこともできます。トランスジェニック系統において、GFPは、細胞質であり、グースコイド-GFP陽性細胞は、このように膜がGFP標識であっても、識別することができます。 過去数年にわたり、プローブの数は、生試料中のアクチンを標識するために使用されています。最初のものは、アクチンモノマーに直接融合しました。これらは、2つの主要な欠点​​を提示しました。まず、彼らはすべてのアクチンを標識し、具体的にアクチンを重合しません。第二に、彼らはしばしば毒性でした。現在使用されているプローブは、蛍光レポーターに融合した繊維状アクチン結合ドメインです。このプロトコルでは、我々は現在、繊維状アクチンのために最も頻繁に使用されるマーカーであり、すべての繊維状アクチンにラベルを付け、ABP140 17（酵母アクチン結合タンパク質140のアクチン結合ドメイン）を使用しました。 （相同ドメインカルポニン）ユートロフィン18はまた、繊維状アクチンを標識するが、唯一の安定したフィラメントを標識するために表示されます。この差は、IDENために使用されていますtifyダイナミックアクチンフィラメント、ものはABP140によって標識していないユートロフィン19として。 最近ではABP140とユートロフィンが長い式20以上、特に毒性作用を持つことができることをフライに報告されています。我々はABP140標識細胞内の任意の移行欠陥を気づいていないにもかかわらず、我々はABP140発現は、内因性アクチンダイナミクスを混乱させる可能性があることは否定できません。繊維状アクチンのための第3のプローブは、最近21を報告しました。 F-tractin（ラットイノシトール三リン酸3-キナーゼからのアクチン結合ドメイン）は、毒性作用20,22を示さないであろう、繊維状アクチンの忠実なレポーターとして記載されています。我々の知る限りでは、F-tractinの使用はまだゼブラフィッシュで報告されていません。 アクチンに加えて、多くの他の細胞成分は、細胞遊走の我々の理解を改善するために標識することができます。これは、ミオシン、微小管、中心体、ならびにknのような他の細胞骨格の構成要素を含んでいます自身の細胞遊走の調節因子（低分子量GTPaseのRho、RacのとCdc42は、PIP3のための蛍光プローブの活性化形態...）または細胞接着に関与するタンパク質（インテグリン、カドヘリン...）。 全体として、このプロトコルは、 インビボで細胞遊走を制御する際に候補遺伝子の関与を試験するための迅速かつ容易なシステムを提案するために前述のツールおよび技法の数を再編成します。我々は、それが向け集団移住の興味深いモデルであるとして将来の脊索前板の移行を使用して、ためにそれを標識する利用可能なトランスジェニック系統の。しかし、同様のプロトコルが、開発中に発生する他の移行イベントを分析するために適合させることができます。

多細胞生物において、細胞遊走は、組織や器官への細胞の組織化を確実に胚の発達のために、それが組織の恒常性（創傷治癒）および免疫性に関与する成人用の両方に必須です。これらの生理学的な機能に加えて、細胞遊走はまた、特に、癌転移を含む多様な病的状態に関与しています。 細胞遊走は、平坦な表面上での細胞の移動を確保する分子機構の全体的な理解を提供する、数十年にわたってインビトロで分析された。 インビボではしかしながら、細胞は、より複雑な環境に直面しています。明らかに、移行を誘導する細胞や分泌ケモカイン隣接、そのような細胞外マトリックスとして生体内移行が外部の合図によって影響され得ることは、過去数年に登場し、その記載されているものと異なる場合があり、細胞移動を駆動機構&lt;em&gt;のin vitroで1,2。 生体内の細胞遊走に確保するメカニズムは、in vitro試験に比べて、主に増加した技術的な困難のため、これまであまり注目されてきた。特に、細胞遊走のインビボ分析遊走細胞への直接的な光アクセスを必要とする、でユニークな細胞を標識するためのテクニックその原動力と形態、ならびにゲインまたは機能の損失を見るためには、候補遺伝子の役割をテストするために近づきます。これまでのところ、これらの特性を保有するだけ少数のモデル系は、 インビボ細胞遊走3 に切開するために使用されています。 我々は最近、 生体内の細胞遊走4,5 に制御する際に候補遺伝子の機能を評価するために、新しい便利なモデルシステムとして初期のゼブラフィッシュの胚に前向き脊索前板の移行を使用していました。 （また、前方の中内として知られている）前向き脊索前板はGASTの開始時に形成する細胞群であります胚の背側にrulation。原腸形成時に、このグループをまとめ脊索前板、中内胚葉の肥厚、脊索に前方、および神経板の下にあるを形成するために、胚6-8の動物極に向かって移動します。その後部の可能性が高い中胚葉9を頭に貢献しながら、脊索前板の前方部分は、孵化腺を生じさせます。外部開発及び魚類胚の光学的透明度のおかげで、細胞遊走を直接かつ容易にこの構造では観察することができます。 細胞移植は、モザイク胚10を迅速かつ簡単に作成できます非常に強力なテクニックです。単離された細胞を標識に移植された細胞の結果で蛍光細胞骨格マーカーを発現する、の形態とダイナミクスを容易に観察することができます。機能の喪失またはゲインにこれ​​をアプローチ組み合わせることにより、缶の細胞自律的な機能の分析を可能にしますdidate遺伝子。 提示されたプロトコルは、我々は生体内 5 に細胞遊走およびアクチンダイナミクスを制御する際にTORC2コンポーネントSIN1の機能を評価する方法について説明します。しかし、結果に記載し、さらに説明するように、 インビボでの細胞遊走を制御する任意の候補遺伝子の潜在的な含意を分析するために使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&#160;mm)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300085</td>
			<td style="width:167px;">standard thickness</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">300085</td>
			<td>thin-walled</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10&#160;000&#160;units penicillin and 10&#160;mg streptomycin per ml</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">fine tweezers</td>
			<td style="width:71px;">Dumont Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>5F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Air transjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micro-forge</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micromanipulator (for injection)</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Micromanipulator (for cell transplantation)</td>
			<td style="width:71px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica Micromanipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hammilton Syringe</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:323px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:71px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Transplantation mold</td>
			<td style="width:71px;">Adapative Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">PT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Needle holder</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">HI-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tube connector</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">CT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing in vivo cell migration using cell transplantations and time-lapse imaging in zebrafish embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

提示された技術は、 インビボ細胞遊走に制御する際に、SIN1、Torの錯体2（TORC2）のコア要素の1つの役割を分析するために使用しました。細胞移植の使用は、単離された細胞と細胞自律的効果の分析の標識化を可能にします。映画S1は、移植脊索前板前駆細胞の遊走を示しています。 ABP140とアクチン標識がアクチン豊富な細胞質突起の容易な可視化を可能にします。私たちは、その頻度と向きを測定しました。野生型細胞は、移動の方向（ 図3B）、 すなわち動物極の方向に配向頻繁な大きな細胞質突起を生成します。 SIN1の機能の喪失は、アクチンリッチ突起の形成を制御するSIN1の重要性を実証し、残りの大幅な突起の数の減少、およびランダム化につながります。興味深いことに、この表現型は、電子によって救出することができますRac1の15の構成的に活性な形のXPRESSIONは、強くTORC2はRac1の（ 図3B）を介してアクチン動態と細胞突起の形成を制御することを示唆しています。 提示された技術は、細胞動態4に、Arpin、ARP2 / 3複合体の最近同定された阻害剤の役割を特徴づけるために使用されました。 Arpin機能の喪失は、突起周波数（所定の時間に突起を有する細胞の平均率）の増加をもたらします。これは、より頻繁な突起形成にまたは突起安定性の増加のいずれかによるものである可能性があります。突起寿命を測定することArpinの非存在下で、突起の時間的持続性は（ 図3C）倍になる、ことが明らかになりました。これは、突起退縮を促進するARP2 / 3阻害剤としてArpinの役割と一致して、かつArpinではなく、突起の安定性を調節することにより、突起周波数に影響を与えることを示唆しています突起開始。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53792/53792fig1.jpg" /> 図1：手順の概要は、Tgは（GSC：GFP）。胚は4細胞期（1時間後に受精）で注入されています。 28℃で5時間後、シールド（GFP +）の内ABP140-mCherryを陽性細胞を示した胚をドナー胚として選択されます。シールド細胞は、移植針内に吸い上げと宿主胚のシールドに移します。回復の0.5時間後、ホスト胚が搭載されていると落射蛍光顕微鏡（対物レンズ40倍）で画像化。 HPF：時間は受精を投稿してください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/53792fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53792/53792fig2.jpg" /> 図2：Transplantati皿や個々のウェルとイメージングチャンバー。（A）移植皿に。 （B）細胞移植皿用モールド。 （C）ホームメイドの撮像チャンバー。 （D）自家製撮像チャンバーの模式図。スケールバー= 1 cmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/53792fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53792/53792fig3.jpg" /> 図3：細胞動力学解析の結果から突出角度測定の（A）スキーム。 （B）細胞突起の方向と周波数解析。 SIN1モリブデン（Mo-SIN1）の非存在下では、細胞は、より少ない突出部を放出し、残りの凸部がランダムに配向しています。この表現型は、GTPアーゼRac1のモリブデン（Mo-罪の構成的に活性な形態の発現によって救出することができます1 + CA-Rac1は）。デュモルティエとDavid、2015年5突起寿命の。（C）の分析から変更されました。 Arpinモリブデン（Mo-Arpin）の非存在下では、突起頻度が増加します。これは、突起寿命の増加によるものです。モルホリノに鈍感arpin RNAを再導入することは、このハイパー突出表現型を復元します。ダンら変更され、2013年4。スケールバー=10μmです。 ：前方; P：後方、L：左、R：右<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/53792fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="映画1" src="/files/ftp_upload/53792/53792movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/Movie_1.mp4">映画1：Rac1を介した細胞突起のSIN1コントロールの形成、（右クリックしてダウンロード）。</a>を注射移植脊索前板前駆細胞、ABP140-mCherrry RNAおよびRac1のの構成型の制御モルホリノ、またはSIN1のモルホリノ、またはSIN1モルホリノおよびRNAを。突起周波数及び配向は、これらの画像上で測定しました。

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

7.6K ビュー.  IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure. Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration. 

ビデオ: Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

発生生物学

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

成体ゼブラフィッシュテレンスファロンにおけるプラスミドDNAの生体内送達に関するエレクトロポレーション法

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...