すべてのマウス実験は動物保護のドイツの法律に基づいて行われ、地元の機関動物ケア委員会（Landesamt fuerナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、ノルトラインヴェストファーレン州[承認ID番号の承認と一致した：AZ 84-02.04.2013 .A428]）。 1.メディアの準備<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）：293T媒体を準備します。 </li><li> MEF培地を調製する：DMEM、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​1×非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。 </li><li> TS媒体を作製（W / FGF4 /ヘパリンO）：ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）1640を20％（v / v）のFBS（幹細胞培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2 mMの）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、2-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）。 </li><li>幹細胞（RPMI 1640、20％（v / v）のFBS：FGF4 /ヘパリン（TS + F4H）とTSの培地を調製培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、2-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）、25 ngの/ mlのFGF4、を1μg/ mlのヘパリン。 注：FGF4およびヘパリンを直接使用直前に培地に添加されます。 </li><li> FGF4 /ヘパリン（TS-CM + F4H）とTS-CMを準備：70％MEF馴化TS培地+ 30％新たに調製したTS培地+ 25 ngの/ mlのFGF4、を1μg/ mlのヘパリンを。 注：FGF4およびヘパリンを直接使用直前に培地に添加されます。 </li><li>トランスフェクション培地を調製する：アドバンストDMEM、2％（v / v）のFBS（細胞培養グレード幹）、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。 </li><li>ウイルス生産培地を調製：アドバンストDMEM、5％（v / v）のFBS（細胞培養グレード幹）、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。 </li></ol> 2.マウス胚性線維芽細胞の導出<ol><li> B6.Cg-GT（ROSA）26Sor TM1（のrtTA;（株名を重量129S2SV。女性とホモ接合男性R26 :: rtTAのマウスを使用して設定時限交配* M2）ジェジュン/ J 7）。頸椎脱臼によりE13.5の犠牲マウス上の標準的なプロトコル8に従って初代マウス胚性線維芽細胞（MEFの）を単離。その後、MEF培地で150ミリメートル皿上の1つの胚からのプレートの細胞。 </li><li>一次MEFの文化が150 mmディッシュにコンフルエントに達すると、10mlのPBSで細胞を2回洗浄し、4ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTA溶液を追加します。 37℃のインキュベーターで4分 - 3用の皿をインキュベートします。 </li><li>インキュベーションチェックした後、倒立顕微鏡（10倍レンズを使用して）を使用してディッシュから剥離した細胞の場合。トリプシン処理を停止し、50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を収集するためにMEF培地を5ml加えます。 </li><li>いくつかの料理からプールの細胞懸濁液を、50mlのコニカルチューブに集めます。 200×gで、10℃で3分間遠心操作し細胞懸濁液。 </li><li>上清を捨て、10％を含むFBS中（v / v）のジメチルスルホキシドを細胞ペレットを再懸濁します。さらに使用するためにアリコートでのMEFをフリーズします。 注：または、野生の標準を使用します電子プライマリのMEF。ただし、のrtTAを発現する追加のレンチウイルスベクターは、他のレンチウイルスベクターと一緒に形質導入する必要がある（Maherali ら FUdeltaGW-rtTAのプラスミドを用いて、例えば、 図9）。 </li><li> MEF馴化TS培地の調製 注：変換前の実験に、MEF馴化（CM）TSメディアは（セクション6で説明）、個々のITSC株の継代培養のために必要とされる、準備しなければなりません。 <ol><li>プレート皿の所望の数にMEF培地中の150ミリメートル皿当たり1×10 7有糸分裂不活性化したMEF。 9グレイの線量でγ線照射によってのMEFを不活性化します。 注：150 mmディッシュあたりの収量は約60ミリリットルのCMです。 </li><li>メッキ、吸引後の日とは、MEF培地を廃棄し、戻って37℃のインキュベーターにしたMEFと場所料理、有糸分裂不活性化の各皿の上にたて（FGF4 /ヘパリンなし）TS培地を用意し20ミリリットルを追加します。 </li><li>インキュベートした後有糸分裂が不活性化されたMEF上で3日間のTS培地は、50ミリリットルコニカルチューブ中の培地を収集します。 0.2μmのフィルターを通して媒体を濾過し、2.6.4に進みます。 CMのさらなるバッチの製造のための新たなTS培地20mlでCMを交換してください。 注：有糸分裂不活性化MEFの3回までのCMの調製のために使用することができます。 </li><li>小分けし、-20℃で50ミリリットルコニカルチューブとストアにフィルタリングCMの35ミリリットル必要になるまで。解凍後、1ヶ月まで4℃で70％TS-CMを得るために、店舗に新たに調製したTS培地の15ミリリットルを追加します。 </li></ol></li></ol> 293T細胞における3.レンチウイルスベクターの作製注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2にライセンス実験室のスペースで行われます。 <ol><li>変換実験に先立って、過剰発現TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2とmCherryをの依存ドキシサイクリン（DOX）のためのレンチウイルスベクターを準備します。各レンチウイルスについては、同時トランスフェクト293T細胞を使用してパッケージングプラスミドおよびVSV-Gを発現するエンベローププラスミドと一緒にそれぞれのレンチウイルス導入ベクター（プラスミドについては、材料表を参照してください）​​。 注：ウイルス生産に関する役立つ情報についてGavrilescu ら 10を参照してください。それはレトロウイルスの生産を説明していますが、293T細胞とプラスミドDNAの品質に関する一般的なコメントは、同様に、レンチウイルス生産のための真です。 注意：適切な安全対策は、レンチウイルスベクターと仕事での作業はバイオセーフティレベル2の施設で行わなければならないとき、取られる必要があります。 </li><li>コー​​トポリ-L-リジン（100μg/ mlの）溶液5mlで皿を覆い、静かに均一に塗布液を分配するように揺動することにより溶液で5 100 mmディッシュ。 37℃で30分間バックインキュベーターに皿を置きます。 30分吸引塗布液の後、PBSで一度皿をすすぎます。 </li><li>プレート7×10 10ミリリットル293T-細胞培地、s内の皿当たり6 293T細胞Wirlの料理は細胞を均一に分散し、戻って37℃のインキュベーターに皿を配置します。 </li><li>翌朝は、トランスフェクション培地5mlで成長培地を交換してください。クロロキン液の1,000倍ストック（25mMの）の6μlを添加して、戻って37℃のインキュベーターに皿を置きます。 </li><li> 一方、トランスフェクション混合物を準備します。 <ol><li>各レンチウイルスベクターの場合、AとBというラベルの付いた2つの5ミリリットルの反応管を、準備</li><li> 2×HEPES600μlのは、チューブAに生理食塩水（HBS）をバッファリング追加</li><li> 18.5μgのレンチベクターDNAと9.25μgのpsPAX2とpMD2.G.の9.25μgの持つ管Bミックスで61.5μlの塩化カルシウム溶液（2 M）、無菌培養グレードのH 2 Oで600μlに音量を調節します</li><li>ボルテックスしながら管Bの滴下からチューブAにソリューションを追加します。 RTで15分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。 </li></ol></li><li> 100ミリメートル皿に準備された293T細胞に滴下し、非常に慎重にトランスフェクション混合物を追加します。 AFTER 5〜6時間培地除去およびウイルス生産培地10mlで交換してください。バック37℃のインキュベーターに皿を置きます。 注：培地を除去し、交換時に293T細胞を容易に皿から切り離すので、ご注意ください。クロロキンへの長期曝露が細胞に毒性であるため、トランスフェクション後の培地交換5-6時間は、非常に重要です。 </li><li>翌朝は、慎重に取り外し、メディア破棄し、ウイルス生産培地の7ミリリットルと交換してください。 </li><li>翌朝は、ウイルス含有培地の最初のバッチを収穫します。培地を吸引し、15ミリリットルコニカルチューブに集めます。ここでも、細胞上にウイルス産生培地の7ミリリットルを追加します。冷蔵庫に保管してウイルス含有培地第二のバッチは、次の日に収穫されるまで。 </li><li>翌朝は、最初のバッチを含む15ミリリットルコニカルチューブに追加するウイルス含有培地の第二のバッチを吸引します。 293T細胞は現在、廃棄することができます。 0.45μmのシュールを通じてウイルス含有培地をフィルタリングfactantフリー酢酸セルロース-membraneフィルタ。アリコートは、さらなる使用のために-80℃で、ウイルス含有培地とストアを濾過しました。 注：ウイルス産生はまた、6ウェル皿中で行うことができます。それに応じてボリュームと細胞数を縮小。 </li></ol> 4. 4要因と線維芽細胞の形質導入およびmCherryをコントロールベクター注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2の施設で行われています。 <ol><li>実験概要の概略について図1を参照してください。プライマリのrtTA-のMEFの1つのアリコートを解凍し、MEFメディアの2ミリリットルの全容量で6ウェル皿のウェルあたり3.33×10 5細胞をプレー。少なくとも3ウェルを準備し、4因子（4F）、mCherryをとコントロールでそれらにラベルを付けます。 注：のrtTA発現するレンチウイルスベクターは、ステップ4.2の間にレンチベクターのカクテルに追加されたときあるいは、野生型MEFを、使用することができます。 </li><li>完全にcryopreから回収した細胞の後、次の日servationは、それぞれ、伝達メディアの0.6ミリリットル（4F）、0.9ミリリットル（mCherryを）と1ミリリットル（コントロール）との3 6ウェルにMEFメディアを交換します。 RTでPLV-のtetO-TFAP2C、-Gata3、-Eomes、-etsと-mCherryウイルスの1つのアリコートを解凍し、よく4Fにそれぞれのウイルス含有上清100μl（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）を追加します。 注：野生型のMEFの場合は、100μlのことでpreplatedメディアの容量を削減し、さらに4Fミックスに上清を含むFUdeltaGW-のrtTAウイルスの100μlを添加します。 </li><li>よくmCherryをで標識にmCherryをウイルス含有培地100μlのを追加します。各ウェル中の8μg/ mlの最終濃度にポリブレンを加えます。 37℃でバックインキュベーターに皿を置き、ウイルス含有上清としたMEF O / Nインキュベートします。 注：野生型のMEFの場合は、100μlのことでpreplatedメディアの容量を削減し、さらにFUdeltaGW-のrtTAウイルス含有上清100μlを追加します。 </li><li>翌朝、慎重に取り外しウイルス含有培地及び2mlのPBSで三回洗浄します。最後に、（FGF4 /ヘパリンなし）TSメディアの2ミリリットルを追加します。 注：形質導入したMEFを直接ITSC誘導実験のために使用されるか、またはさらなる使用のために凍結することができます。 </li></ol> 5.線維芽細胞ITSCへの変換注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2にライセンス実験室のスペースで行われます。 <ol><li> 4分 - 2ミリリットルのPBSで3インキュベーターでそれらをインキュベート0.5ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を添加した後、二回形質導入したMEFを洗ってください。細胞の適切な剥離用倒立顕微鏡下で確認してください。 <ol><li> 1mLのTS培地を添加することによってトリプシンを不活性化します。 200×gで3分間、15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。上清を捨て、2ミリリットルのTS培地で細胞を再懸濁します。細胞をカウントするために形質導入​​されていない対照試料を使用してください。 </li><li> 2×10 5の密度でプレート4F-MEFを、mCherryを-のMEFおよび非形質導入コントロールのMEF各培地を2μg/ mlのdox（TS培地+ FGF4 /ヘパリン+ DOX）を含む10ミリリットルのTSさ100mmの細胞培養皿当たりの細胞。 </li><li>また、小さい皿に分化転換を行います。それに応じて希望の皿の大きさ、スケールのボリューム上の1cm 2あたり3.6×10 3細胞をプレー。 </li></ol></li><li>翌日、形質導入効率を推定するためにmCherryをタンパク質の発現をモニター（10×レンズと赤色蛍光励起のために適切なフィルタを使用して）落射蛍光顕微鏡を使用して。 注：形質導入効率は100％に近くなければなりません。増加した細胞死は、導入遺伝子誘導後に明らかである場合、これは、ウイルス力価が高すぎたことを意味します。形質導入は、ウイルス含有培地の量が減少して繰り返されるべきです。 </li><li>今から全ての料理に変化媒体一日おきにプレーティングの翌日10時まで。その後、DOX（TS培地+ FGF4 /ヘパリン）することなく、TS培地で細胞を養います。 </li><li>倒立顕微鏡モニター用を使用して、最大3週間4F皿上の「分化転換領域」の外観（ 図2BおよびCを参照してください）。このようなコロニーは、2つの制御ディッシュ（mCherryを-のMEFおよび非形質導入したMEF）上には表示されません。 </li></ol>個人ITSC行の6の単離注：ステップ6.3のために組織培養フードは必要ありません。細菌汚染の可能性を最小限にするために70％エタノールで倒立顕微鏡を拭くことをお勧めします。個々ITSCコロニーを日21および分化転換の28日の間に単離することができます。 <ol><li> 96 U底ウェルディッシュの12ウェルに0.05％トリプシン/ EDTA溶液40μlを加え、氷上で皿を置きます。 </li><li>コロニー分離、4F-MEF分化転換皿上の培地を吸引する前に。 10mlのPBSで細胞を1回洗浄します。ここでも、倒立顕微鏡下で10mlのPBSと場所皿を追加します。 </li><li> 40μlに設定し、100μlのピペットを使用してcで、個々のコロニーを持ち上げますピペットチップでそれらをirclingと浮遊コロニーを吸引します。調製された96ウェルディッシュの1ウェルに1つのコロニーそれぞれの転送細胞。 12個のコロニーをピッキングした後5分間37℃のインキュベーター中で96ウェル皿を置きます。 </li><li> TS-CM培地（30％新鮮なTS培地+ 70％のCM + FGF4 /ヘパリン）の準備を500μlで24ウェルディッシュの1ウェルに数回、転送細胞懸濁液のために上下にピペッティングにより細胞を解離します。 </li><li>次の日は死んだ細胞を除去し、新鮮なTS-CM培地で培地を交換してください。一日おきに培地交換。 </li><li>明るい境界線（ 図2参照）との上皮コロニーの出現を監視します。コロニーが表示されたら、文化70％コンフルエントになるまで、または最長1週間、徐々に、より大きな皿を上に展開します。今から、正真正銘のTSCなどの培養細胞、血清含有培地中または無血清、定義されたメディア3,5,11における標準プロトコルに従って。 </li></ol>

<ol>
	<li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast.">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts.">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li><li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells.">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li><li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta/activin.">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li><li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues.">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550 (2007).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions.">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで紹介する4因子（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）ベースの分化転換プロトコルは、マウス胚性線維芽細胞から忠実に変換iTSCsを生成するために、信頼性の高い方法を提供しています。さらに、この方法はあるが、胚性線維芽細胞3に比べて効率の低下で、また出生後の尾の線維芽細胞に適用可能です。一般的に、初代線維芽細胞の品質は、分化転換の結果とケアの重要な要因は、初期継?...

最近、トロホブラスト幹細胞の変換にマウス胚性幹細胞のいくつかのアプローチを比較した研究では、全ての分析システムにおいて、系統変換が不完全のままであることを明らかにしました。代わりに誘導された栄養膜幹細胞（iTSCs）のいわゆる栄養膜幹細胞様細胞は、起源1の細胞運命のメモリを保持生成されています。ここでは、ITSC世代の異なるアプローチを行いました。マウス胚性線維芽細胞（MEF）2からの多能性幹細胞の直接誘導と同様に、iTSCsは直接分化した体組織から変換されています。まず、MEFにおける過剰発現された場合、TSCの運命を誘導する12候補因子を同定しました。その後、要因TFAP2C、GATA3、EomesとETS2はITSC誘導3のために必要かつ十分であることが確認されています。同時に、別のグループは、独立して、TFAP2C、GATA3及びEomesがiTSCs中のMEFに変換するのに十分であることがわかりました。しかし、その中で研究は、導入遺伝子発現のために必要な時間がかなり長いETS2に転換カクテル4に存在しない場合、別の変換速度を示し、我々の研究と比較されます。 誘導し、胚盤胞由来トロホブラスト幹細胞の培養物を含有する従来のウシ胎児血清（FBS）は、成長不活性化MEFの5,6によって分泌される因子の存在に依存しています。 ITSC​​誘導時には、これらの要因は、導入遺伝子の完全な組み合わせを欠いており、分化転換を受けていないのMEF、によって提供されています。しかし、一度個々のITSCコロニーは彼らが成長不活化したMEFによってあらかじめ調整されたメディアを、必要とする、サブ培養されます。そこから先、iTSCsを培養し、標準的なプロトコルに従って胚盤胞派生のTSCのように処理することができます。注目すべきは、細胞培養皿をゲル化することなく、田中ら 5、私たちが日常的に文化のTSCとiTSCsとは対照的です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D9891-10G</td>
			<td style="width:180px;">Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Chloroquine diphosphate salt&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:180px;">Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td style="width:180px;">Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">human recombinant Fibroblast Growth Factor 4</td>
			<td style="width:93px;">ReliaTech</td>
			<td>300-131L</td>
			<td style="width:180px;">Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 &#181;g/ml stock solution. Store aliquots at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td style="width:180px;">Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">ProFection Mammalian Transfection System</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td>E1200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1419-094</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966-021</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">RPMI 1640, no glutamine</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31870-025</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Advanced DMEM (1x)</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12491-015</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:93px;">Hyclone</td>
			<td>SH30071.03IR</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140-035</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-039</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030-24</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350-010</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:199px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade</td>
			<td style="width:93px;">Panreac AppliChem GmbH</td>
			<td>A3672,0100</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Tfap2c</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70269</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Gata3</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70270</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Eomes</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70271</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Ets2</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70272</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-mCherry</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70273</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">psPAX2</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pMD2.G</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>19780</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td>
			<td style="width:93px;">JAX Mice</td>
			<td>6965</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">129S2SV</td>
			<td style="width:93px;">Charles River</td>
			<td>129</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells

トロホブラスト幹細胞（のTSC）哺乳類の発生における最初の細胞の運命決定の結果として生じます。彼らは、自己再生および栄養膜系譜のすべてのサブタイプに分化する、胎盤の胎児部分を生じさせる細胞集団を幹の生体内と同等の能力を保持し、in vitroで培養することができます。したがって、のTSCは、in vitroで胚体外細胞運命の決定に対する胎盤の開発および胚を研究するためのユニークなモデルを提供しています。以降、胚盤胞段階から、DNAメチル化とヒストン修飾からなる別個のエピジェネティックな障壁がしっかりと両方の系統を分離します。ここで、我々は完全に過剰発現マウス胚性線維芽細胞における栄養膜重要な調節因子TFAP2C、GATA3、EomesとETS2の一過性のことで、この系統の障壁を克服するためのプロトコルについて説明します。誘導された栄養膜幹細胞は自己再生が可能で、派生トロホブラスト幹細胞を胚盤胞とほぼ同じです私形態学、マーカー遺伝子の発現とメチル化パターンのn項。 in vitroおよびin vivoアッセイにおける機能は、これらの細胞が栄養膜系譜は倍数体栄養膜巨細胞を発生させ、胚盤胞に注入された場合、胎盤をキメラ化に沿って分化することが可能であることを確認してください。体細胞組織からトロホブラスト幹細胞の誘導は、この胚体外系統の遺伝的およびエピジェネティックな特性を研究するための新たな道を開き、それぞれの胚を破壊することなくトロホブラスト幹細胞株を生成する可能性を提供しています。

4Fの導入遺伝子の発現が活性化された皿に、細胞は急速に（ 図2AおよびBを比較）の形態を変更します。一日の周りに14から21の異なる分化転換の領域は（二つの例を図2BおよびCに記載されている）出てきます。これらの一次コロニーは、典型的なTSC形態を欠いています。しかし、彼らはタイトなエッジと善意のTSCの非常に連想させる鮮やかな?...

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Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K ビュー.  Institute of Pathology, University of Bonn Medical School. Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

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Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

発生生物学

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...