This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השיטה שנבחרה כדי להשיג את האינדוקציה של pluripotency רלוונטית לבטיחות קלינית תא ביחס השתלה לטווח ארוכה. כיום, קיימות מספר שיטות מתאימות תכנות מחדש. בין השיטות הלא-אינטגרטיבי יותר, ויראלי סנדאי (SEV) הווקטור הוא וירוס RNA אשר יכול לייצר כמויות גדולות של חלבון ללא להשתלב בגרעין של התאים הנגועים 40 ויכולה להיות אסטרטגיה כדי להשיג תאי שב&quot;ס. וקטורי sev יכולים להיות מועמד אטרקטיבי עבור הדור של תאי שב&quot;ס translational כיתה, אך הוא מציג כמה חסרונות. רפליקז ויראלי הוא רגיש לאופי הרצפים המהונדסים. מאז וקטורי sev constitutively לשכפל, הם יכולים להיות קשים להיפטר מתאי המארח, גם אם אסטרטגיות שונות משמשות לשיפור היבט זה 41, 42. זה דורש טיפול מיוחד, כגון ארון בטיחות ביולוגית רמה 2. שם אניזה רק הספק מסחרי אחד זמין. קיים חוסר נוכחי של sev קליני כיתה לתכנות מחדש ויש עלויות גבוהות של ייצור תאי שב&quot;ס. בשל ההיבטים הללו, מערכת transposon יכולה להיחשב גישה טובה יותר ביחס וקטורי sev, וכאן אנו קובעים כי מערכת זו היא שיטה מתאימה תכנות מחדש תאי עכבר AF עם יתרונות שונים. היא מאפשרת את ייצור תאי xenofree שב&quot;ס בניגוד פרוטוקולי ייצור ויראלי הנוכחיים המשתמשים תנאי xenobiotic. אין לו מחסום מינים לכאורה ויש לו קיבולת מטען transgene גדולה יותר וירוסים. היא מאפשרת משלוח פשוט ובטוח של transposons פלסמיד באמצעות השימוש בשיטת transfection תאים סטנדרטית, אשר יכול להתבצע בקלות בכל מעבדה מצוידת עם ארון בטיחות ביולוגי 1 רמה. מחדש ביטוי Transposase מתיר הגריעה של רכיבי PB עם דור סוגר של עכבר טביעה ללא ושב&quot;ס אדם תאים, כפי שמודגם ce השונהקווי ll 32, 34, 35. מחקרים שונים הראו כי מערכות transposon להציג בתדירות נמוכה יותר מיקוד ליד גנים והטיית פחות מסרטן מיקוד גנים פעילים לעומת וקטורים ויראליים מבוסס 43, 44, 45, 46, 47. תכנות מחדש על בסיס transposons תלוי בשיטת המשלוח שנבחר, וזה מגבלה בשל התנגדות או רעילות הקשורים לשיטות transfection DNA (lipofection, electroporation או nucleofection). כאן השתמשנו ניסוח שאינו liposomal נועד transfect DNA אשר עבד היטב עם תאי AF העכבר. אם תאים אחרים מועסקים, בדיקות תהיינה צורך להשתמש בשיטת המסירה הטובה ביותר במונחים של יעילות גבוהות רעילות נמוכה. על סף, שיטת transposon PB נחשבת וכספתעלות נמוכה ד אך עם יעילות נמוכה לעומת וקטורי sev. לגבי ההליך להשיג תאי העכבר AF, זה קריטי שיהיה זמינים עכברות הרות. ככזה, יש צורך להגדיר מספר מספיק של הזדווגויות (לפחות שש נקבות עם שתי נקבות לכל זכר). עוד ניסויים יכול להתבצע באופן ספציפי על תאי AF האדם לייצר תאי iPS מעוברים בריאים וחולים. בהתחשב במגוון הרחב של מחלות מולדות כי ניתן לאתר דרך לאבחון טרום לידתי, תאים המתקבלים AF במהלך ההריון מייצג את המקור הטוב ביותר כדי להפיק תאי iPS הוא בלימוד המחלה 48 וגם לתכנון גישת רפואת רגנרטיבית במקרה של פגמי רקמות כמו לב או שריר שלד 49, 50.

אבחון טרום לידתי הוא כלי קליני חשוב להעריך מחלות גנטיות (סטיות כרומוזומליות כלומר, monogenetic או polygenetic / מחל מולטיפקטוריאלית) ו מומים מולדים (כלומר מולד בקע סרעפתי, נגעי ריאות פיברוזיס, exomphalos, gastroschisis). מי שפיר (AF) תאים הם פשוט להשיג מנהלים מתוכננים באופן שגרתי במהלך השליש השני של הריון (כלומר מי שפיר ו amnioreduction) או ניתוחים קיסריים 1, 2. הזמינות של תאי AF מחולים טרום לידתי או בילוד מספק את האפשרות של שימוש מקור זה עבור רפואה רגנרטיבית, וכמה החוקרים בדקו את האפשרות לטיפול נזקים ברקמות שונות או מחלות באמצעות האוכלוסייה בתאי גזע שבודדו 3 AF, 4, 5, 67, 8, 9, 10, 11, 12. האפשרות של קבלה בקלות תאי AF מחולים חולים, בחלון הזמן בו המחלה היא לעתים קרובות נייחת, פותחת את הדרך אל הרעיון של שימוש מקור התא הזה למטרות תכנות מחדש. ואכן, גזע מושר (iPS) תאים שמקורם בתאי AF יכולים להיות מובחנים בתאים של ריבית עבור בדיקות סמים במבחנה או גישות הנדסת רקמות, כדי להכין טיפול למטופל ספציפי נאות לפני הלידה. מחקרים רבים כבר הוכיחו את יכולתם של תאי AF כדי לתכנת מחדש בדיל לתוך מגוון רחב של סוגי תאי 13, 14, 15, 16, 17 &lt;/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. מאז גילויו על ידי טקהאשי יאמאנאקה 28 תאים סומטיים לתכנות מחדש דרך הביטוי הכפוי של ארבעה גורמי שעתוק (Oct4, Sox2, cMyc ו Klf4), הושג התקדמות בתחום של תכנות מחדש. בהתחשב בשיטות שונות, אנו יכולים להבחין בין גישות ויראלי ולא ויראלי. הראשון מצפה השימוש של וקטורים ויראליים (רטרווירוסים ו lentiviruses), אשר יש יעילות גבוהה, אך בדרך כלל השתקה שלמה של transgene retroviral, הוא עם התוצאה של שורת תאים לתכנות מחדש באופן חלקי את הסיכוןinsertional mutagenesis 29, 30, 31. השיטה הלא-ויראלי משתמשת באסטרטגיות שונות: פלסמידים כלומר, וקטורים, mRNA, חלבון, transposons. על הגזרה של תאי iPS ללא רצפים מהונדסים שואפת לעקוף את השפעות מזיקי ביטוי transgene דולף mutagenesis insertional. בין כל האסטרטגיות הלא-ויראלי הנ&quot;ל, את PiggyBac (PB) מערכת transposon / transposase דורשת חוזרת מסוף ההפוך רק חובק transgene ו ביטוי חולף של אנזים transposase לזרז אירועי כניסה או כריתה 32. היתרון בשימוש transposons על פני שיטות אחרות לייצור תאי שב&quot;ס הוא האפשרות לקבל תאי iPS ללא וקטור עם גישת וקטור שאינו ויראלי שמראה אותה היעילות של וקטורי retroviral. זה אפשרי על ידי כריתת עקבות-פחות של קידוד transposon המשולב עבור reprogramming גורמים הבאים ביטוי חולף חדש של transposase בתאי שב&quot;ס 33. בהתחשב בכך PB הוא יעיל בסוגי תאים שונים 34, 35, 36, 37, הוא מתאים יותר עבור גישה קלינית ביחס וקטורים ויראליים, ומאפשר את ייצור תאי iPS ללא קסנו בניגוד פרוטוקולי ייצור ויראלי הנוכחיים משתמשות xenobiotic תנאים, מערכת זו משמשת להשיג תאי שב&quot;ס מן בעכברים AF. כאן אנו מציעים פרוטוקול מפורט לאחר עבודה שכבר פורסם להראות לייצור שיבוטי שב&quot;ס פלוריפוטנטיים מתאי AF עכבר (תאי iPS-AF) 38.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Bacterial-grade Petri Dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>For in vitro differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21043</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21468</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21442</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11005</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase kit&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85L1</td>
			<td>Alkaline Phosphatase&#160; staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>For bacterial selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DH5&#945; cells</td>
			<td rowspan="2">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">18265-017</td>
			<td rowspan="2">Bacteria for cloning procedure</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965039</td>
			<td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>For exogenous factors expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)&#160;</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>72.706</td>
			<td>For PB production&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES FBS&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10439024</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>For MEF medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>Dumont #5&#160;</td>
			<td>AF isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>131</td>
			<td>Used 0.1%, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>For blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin QS</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H3404</td>
			<td>Nuclei detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE&#160;</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>04-061010</td>
			<td>Histological analysis of teratoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nuclei detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc2005</td>
			<td>Secondary antibody (immunoperoxidase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT NovaRED&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4805</td>
			<td>Peroxidase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with needle (25G)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01H25161</td>
			<td>Amniocentesis procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klf4&#160;</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc-20691</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>For bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td>For mouse AF and iPS-AF cells medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>354234</td>
			<td>For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>Peroxidase blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 24 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>For in vitro differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 6 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog&#160;</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0002P-F</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S2000</td>
			<td>For blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12087-87-0</td>
			<td>For cell permeabilization. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Oct4</td>
			<td rowspan="2">SantaCruz</td>
			<td rowspan="2">sc-5279</td>
			<td rowspan="2">Mouse monoclonal IgG2b</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td>For RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244</td>
			<td>PFA, fixative, diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14200-067</td>
			<td>D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150mm)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td>For MEF culture, tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac transposase expression plasmid&#160;</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>mPBase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>For plasmids purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>For plasmids purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid&#160;</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>rtTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2&#160;</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc-17320</td>
			<td>Goat polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16285</td>
			<td>Mouse monoclonal IgM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>For RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab20680</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Cell culture passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-047</td>
			<td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">TRIzol Reagent</td>
			<td rowspan="2">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">15596-026</td>
			<td rowspan="2">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tubb3&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Promega&#160;</td>
			<td rowspan="2">G712A</td>
			<td rowspan="2">Mouse monoclonal IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;fp&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Mouse Monoclonal IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">&#945;SMA&#160;</td>
			<td rowspan="2">Abcam</td>
			<td rowspan="2">ab7817</td>
			<td rowspan="2">Mouse Monoclonal IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (FuGENE HD)</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>E2311</td>
			<td>For AF cells transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SM2645</td>
			<td>To perform amniocentesis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>70.760012</td>
			<td>To pick bacteria colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11 stainless 25U</td>
			<td>To perform amniocentesis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td>To clean the abdominal wall of the pregnant dam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture petri dish (150 mm)&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td>For MEF expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287-2MG</td>
			<td>For MEF inactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 96 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353071</td>
			<td>For iPS-AF culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the production of pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells using a transposon system

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

כדי להעריך את היכולת של תכנות מחדש, בתאי עכבר AF נאספו מעוברים של עכברים GFP. התאים היו transfected עם הפלסמיד transposon עגול PB-tetO2-IRES-OKMS, המבטא את הגורמים יאמאנאקה (Oct4, Sox2, cMyc ו Klf4) צמוד חלבון פלואורסצנטי mCherry באופן דוקסיציקלין-מושרה, הפוכה transactivator טטרציקלין (PB- CAG-rtTA) פלסמידים יחד עם הפלסמיד ביטוי transposase (mPBase). תאי עכבר AF היו transfected עם Oct4, Klf4, cMyc ו Sox2 לאחר שבוע 1 של הרחבת במבחנה מעל שכבת מזין MEF. על מנת לתת ביטוי של גורמים אקסוגניים, דוקסיציקלין נוספה היום לאחר transfection בריכוז של 1.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, כפי שתואר לעיל 39. הביטוי של mCherry היה גלוי לאחר 24 שעות מתוספת דוקסיציקלין, המציין transfection. המושבות הראשונות עם מורפולוגיה ES דמוית הופיעו 20 ימים לאחר DOXאינדוקציה ycycline ונאספו 30 ימים-transfection פוסט. מושבות אלה היו זורעים על שכבות מזין פיברובלסטים מומתות. לאחר קטיף, שיבוטים לשרוד היו מתוחזקים במדיום השלים עם דוקסיציקלין קטעים מסוימים עד שיימצא דוקסיציקלין העצמאי בבארות משוכפלות 33. עכבר שיבוטים שב&quot;ס-AF הוערכו על פרמטרים שונים: ביטוי mCherry, מכתים phosphatase אלקליין, ביטוי החלבון של סמנים pluripotency Oct4, Sox2, Klf4, Nanog ו SSEA1, הביטוי של גנים pluripotency אקסוגניים אנדוגני (Oct4, Klf4, cMyc ו Sox2) , במבחנה (EBS) וב בידול (assay תפלצת רוחנית) vivo. הם מילאו את כל הקריטריונים העריכו לאמת pluripotency שלהם, כמו סיכם את איור 1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54598/54598fig1.jpg" /> איור 1: תכנות מחדש של העכבר AF GFP + תאים. (א) מושבות עצמאיות דוקסיציקלין של שב&quot;ס-AF GFP + תאים היו שליליות על מנת לתת ביטוי mCherry וחיובית עבור phosphatase אלקליין מכתים (ALP). ברי סולם = 250 מיקרומטר ו -100 מיקרומטר. (ב) נציג תמונות של שב&quot;ס-AF דוקסיציקלין עצמאי יציבת תא GFP + להביע Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 ו SSEA1. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) ניתוח RT-PCR על מנת לתת ביטוי אקסוגני (פריימרים מבוססי וקטור, TG) ו אנדוגני (Oct4, Klf4, cMyc ו Sox2) גנים. Beta-2-microglobulin (b2m) נחשב כמו גן משק. שורות תאים לתכנות מחדש גדלו בנוכחות (+) או העדרה (-) (96 שעות) של דוקסיציקלין. תאים R1 ES שימשו כביקורת. (פאנל PCR יש הבדל בין ואח ברטין. 38 </sup&gt;). (ד) המראה ברוטו של teratoma השיג 6 שבועות לאחר ההזרקה של שב&quot;ס-AF GFP + תאים לתוך הגפיים האחוריות של Rag2 - / - γc - / - עכבר. (E) היסטולוגיה teratoma והתמיינות התאים אישר immunostaining לכל שלוש שכבות הנבט (האאקטודרם, mesoderm ו endoderm). αfetoprotein (AFP, endoderm), αsmooth יקטין שריר (αSMA, המזודרם), ו טובולין β3 (Tubb3, האאקטודרם) אותרו המוני גידול. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (F) RT-PCR ניתוח של EBS ו teratoma (Te). C +, בקרה חיובית; NTC, שליטה הלא תבנית. Vimentin (Vim, המזודרם), αfetoprotein (AFP, endoderm) ו טובולין β3 (Tubb3, האאקטודרם). (פאנל PCR יש הבדל בין התייחסות 38). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54598/54598fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של ה</a>הוא דמות.

Watch this Scientific Journal Video about The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System at JoVE.com

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

the-production-pluripotent-stem-cells-from-mouse-amniotic-fluid-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K Views.  Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza. In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. 

Video: The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...