Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

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ここでは、LのEGD株はオスまたはメスC57BL / 6Jマウスに25を モノサイトゲネスでの基本的な感染実験を実施する方法のプロトコルを記述します。このプロトコルは、インビボ 31 に先天性および適応リンパ球によるIFN-γ産生に対する新しい小分子IS001の効果を研究するために設立されました。細菌クリアランスと生存感染後を監視することにより、洞察力は、IFN-γにおけるこれらの変化は、感染を制御するホストの能力に影響を与えたかに得られました。 プロトコルにおける重要な検討事項研究のこのタイプの設計における重要な考慮点は、各実験が適切給電と適切に制御することです。感染による免疫応答における生物学的変化に（ 図4、図6を参照）、N = 4ことをお勧めします-グループ当たり5匹のマウスは最初の免疫研究のために使用されるべきです。もしFTERデータの傾向が、グループ間で明らかな有意差があるこれらの研究は、電力計算は、統計的有意性を達成するために、その後の研究に必要な動物の最小数を決定するために行うことができます。コントロールに関しては、免疫研究や車両治療を施すことに関連したストレスから治療の効果を区別しやすくするように制御するためのベースラインIFN-γ応答の決意のために未感染のコントロールを含めることが重要です。別の重要な考慮事項は、治療のタイミングです。 リステリア菌に生得的反応は非常に急速であるので、最初の治療は、試薬の治療レベルが前に達成されることを確実にするために、前に、または接種、と同時に日に投与することをお勧めします先天性免疫応答を開始します。 さらに別の重要な考慮事項は、病原体の用量はinfectioに使用されますn個。それは病原体が細菌のより正確な列挙を可能にする、脾臓および肝臓内に集中される可能性が増加するので致死未満量は、細菌負荷の測定のために推奨されます。致死未満量はまた、動物がピークT細胞増殖の時間の前にリステリア症に屈するしないことを確実にするために、適応型リンパ球によるIFN-γ応答を列挙することをお勧めします。対照的に、より高い感染用量は、これらの細胞によるIFN-γ産生を最大にするために、24時間で初期のNKおよびNKT細胞応答の測定のために使用することが推奨されます。 古典的なLD 50は、マウスの50％の致死率をもたらす病原体の用量です。リステリア症の多くの症状は、動物が感染症に屈する可能性があるかどうかを予測することができますので、死は我々の施設では許容可能なエンドポイントではなかったとので、私たちは私たちの研究におけるエンドポイントとして定義された臨床徴候のリストの代わりに死を使用していました。 USIngのこの方法は、それが修正されたLD 50は、8週齢の雌C57BL / 6Jマウス31のための8週齢の雄及び1.5×10 5 CFUのために10 5 CFUであることが決定されました。これらのLD 50の用量は、各グループにつきN = 8匹のマウスを含有すること（N =合計で5つの研究）段階的用量漸増試験でエンドポイントにマウスの生存率を測定することによって決定した（ 例えば 、マウス、10,000 CFUで最初に感染しました、その後2万CFU、 など ）を有する第二のバッチ。 userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit：LD 50計算は、生存率の値（y軸）のプロビット（ウェブサイトに対するログ（CFU）（x軸）の回帰プロットから決定しました/ProbitAnalysis.pdf）。 私たちの研究室で決定された修正されたLD 50用量は、 リステリア・モノサイトゲネスの同じ株をマウスに感染させた場合でも、別の研究室でと異なる場合があります。この変動の一部は主観的な性質Oに関連してもよいですF死のより絶対エンドポイントに比べリステリア症の臨床徴候を監視します。追加の変動性は、マウスの食事やラボ間の接種物の製造における微生物や違いなどの環境要因の違いに起因することができます。したがって、この中で使用されるように雌マウス（N = 8匹のマウス/群）、リステリア・モノサイトゲネスの同じ株の1.5×10 5 CFUに感染している場所の前の任意の生存の研究に着手し、パイロット試験を実行することをお勧めします研究と症状がこの用量が実際にエンドポイントに50％の生存につながるかどうかを判断するために監視しました。生存率は、このCFUでより低い又は50％よりも高い場合には、段階的用量増加または用量脱漸増試験を迅速LD 50用量に狭いために実行することができます。 もう一つの重要な考慮事項は、感染症の研究のために使用したマウスの株または亜株です。このプロトコルは、一般的に使用される近交系マウス系統C57BL / 6Jの感染を説明します。この<html>株は、このマウスは、系統33のTh1傾向があると考えられているので、IFN-γ応答の測定のためによく適しており、その結果として、Lに比較的耐性であるようなBALB /などのTh2を起こしやすいマウス系統に比べて感染を（ モノサイトゲネスれますC）34,35。他のマウス系統にこのプロトコルを適応させる特定の株のための病原体の感染量の知識が必要になります。また、モデルを設定する際に必要とトラブルシューティングの量を減らすために、このプロトコルで概説されるように同じ年齢、性別のマウスとベンダーを使用することをお勧めします。例えば、あるベンダー（ 例えば 、C57BL / 6J）から注文したC57BL / 6マウスは、別のベンダー（ 例えば 、C57BL / 6NTac）から注文したC67BL / 6マウス36よりも遺伝的差異を示すことができます。また、腸内細菌叢は、マウス37におけるTh1およびTh17細胞応答のバランスに影響を与えることができます異なるベンダーから入手したC57BL / 6 substrains、間で異なります。 技術へのove_title &quot;&gt;潜在的な変更消化管を介して行われ、ヒトにおける感染の自然経路とは対照的に、マウスは、最も一般的に静脈内に腹腔接種またはされています。 リステリア菌の標準株は非効率的にマウス38の腸上皮に感染するため、口腔感染症はあまり一般的です。 A（INIA）39インターリステリア浸潤タンパク質によってE-カドヘリンの認識の損失をもたらすヒトE-カドヘリンからマウスE-カドヘリンの配列における単一のアミノ酸の変化があるためです。この障壁を克服するために、研究者らは、ヒトE-カドヘリンタンパク質のためのトランスジェニックであるマウスを使用したりするためのWT EGDと同じ親和性でマウスE-カドヘリンに特異的に結合するINIAの変異配列（INIAのMUT）を発現するように操作されたリステリア菌を使用しますヒトE-カドヘリン40。従って、この技術の一つの潜在的な修飾は、経口経路を介してマウスに感染します。読者は経口接種方法38を説明する別のJoveのパブリケーションと呼ばれています。感染のモードを変更すると、感染量だけでなく、病原体の普及の速度に影響を与えることに注意してください。 このプロトコルは、CD4 +およびCD8 + T細胞によるIFN-γの産生を誘発するために熱殺菌リステリア菌を使用する方法について説明します。熱殺菌されたリステリア・モノサイトゲネスは、この抗原が安価であるため、我々の研究に刺激として選択され、私たちの研究室は、病原体に対するCD4 + T細胞応答における主な関心があったのでしました。 1つの制限は、加熱死菌は、 インビトロ 41またはin vivo 42,43の感染のいずれかで効率的に素数でないCD8 + T細胞応答を行うことです。したがって、我々は、感染のピークで収穫脾臓細胞によって観察されたCD8 + T細胞のIFN-γ産生（ すなわち 、 図6）は、おそらく残留に対応しています脾細胞培養液中に存在するかまたはサイトカイン誘導性サイトカイン放出41の結果として誘発された生菌。熱殺菌されたリステリア菌の代替として、1つはまたリステリアタンパク質上のエピトープをコードするペプチドに対するT細胞を曝露することによってex vivoで IFN-γ応答を誘発する可能性があります。実際、MHCクラスII拘束性リステリオリシンOのためのエピトープおよびP60ラーゼ免疫優性およびC57BL / 6およびBALB / Cマウスおよび免疫優性MHCクラスIエピトープについて記載されているがBALB / C 44のために記載されています。さらに別の方法は、抗原特異的に列挙する既存のMHCクラスIおよびMHCクラスII四量体試薬を利用するためにオボアルブミンまたはウイルス抗原などのモデル抗原を発現するように操作されたリステリア株をマウスに感染させることです感染マウス45,46におけるT細胞。 議定書のその他の制限このモデルのもう一つの制限は、O点であります脾臓中の免疫細胞によるNLY対策IFN-γ産生。 （L.モノサイトゲネスのオボアルブミンを発現する変異体の）抗原特異的T細胞を列挙するテトラマーの使用に加えて、ここに記載の染色パネルフローサイトメトリー容易例えば、TNFまたはIL-2もしくは他のサイトカインの産生を測定するために変更することができますCD8 T細胞あるいはまたパーフォリンまたはグランザイムBのような病原体のNK媒介性死滅に関与するエフェクター分子が、このプロトコルはまた、肝臓において免疫細胞により産生されるIFN-γを調べるために適合させることができます。 将来の応用このプロトコルを習得されると、それはTh1および細胞性免疫の様々な薬剤や遺伝子の効果をスクリーニングするためのインビボモデルにおける単純として働くことができます。

IFN-γは、細胞内病原体に対する免疫を媒介するため、腫瘍の成長5を制御するために重要であるサイトカインです。耐性菌におけるこのサイトカインの重要性は、IFN-γシグナル伝達経路に変異を有する人間観察に明らかであるマイコバクテリアやサルモネラ菌6での感染を非常に受けやすいです。同様に、マイコバクテリア7-9とL.を含む他の細胞内病原体に対するIFN-γまたは抵抗のIFN-γ受容体展示欠陥のいずれかを欠損したマウスは、10,11、 リーシュマニア 12、 ネズミチフス菌 13、および特定のウイルス11 モノ サイトゲネス 。病原体に対抗することに加えて、IFN-γは、腫瘍14に対する宿主防御に重要な役割を果たしています。 IFN-γの高い生産は、感染または癌の文脈において有益であるが、このサイトカインの持続的生産はトンをリンクされています全身性自己免疫15-17と非肥満糖尿病マウスモデル18におけるI型糖尿病の加速の開発O。 IFN-γの主要な源は、NK細胞、NKT細胞、γδT細胞、Tヘルパー1（Th1）細胞、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）5,19,20を含みます。 IFN-γは、によって先天性および適応免疫の両方を増強する：（1）アップレギュレート（3）強化マクロファージ、（2）抗原提示細胞上の共刺激分子の発現を増加させる、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびII発現を食作用および炎症性サイトカインの産生および殺菌因子（ 例えば 、一酸化窒素および活性酸素種）、（4）（5）（免疫グロブリン抗体のクラススイッチを促進するTh1エフェクター細胞へのナイーブCD4 + T細胞の分化を促進します（）マウスにおけるIg）図2aおよびIgG3、（6）は、iの部位に免疫細胞を動員するケモカインの産生を誘導しますnfection、及び（7）NK細胞およびCTL応答5,19を高めます。病原体および腫瘍に対する宿主応答におけるIFN-γの決定的な重要性を考えると、組換えIFN-γは（19件）様々な感染症や悪性腫瘍の治療薬として試験されています。 IFN-γまたはのTh1促進サイトカインインターロイキン-12（IL-12）の全身投与は、副作用および用量関連毒性19,21に関連付けられているためしかし、によりIFN-γ産生を増加するための代替戦略を開発することに関心があります免疫細胞。新しい生物製剤と小分子の開発は、このような薬剤は、免疫応答の間に、これは、このような動物の生存の増加などの意味のある生物学的作用に変換するかどうかのIFN-γ産生を増加させるかどうかをテストするためにin vivoでスクリーニングツールが必要です。 グラム陽性細菌リステリア菌によるマウスの実験的感染は、のために尽力したモデルとなっています細胞内病原体1,22に対する宿主免疫におけるIFN-γの役割を解読します。静脈内または腹腔内病原体（IP）によるマウスの感染は、それらが脾臓中のピークの細菌負荷が3と4日の間に発生すると常駐マクロファージおよび肝細胞によって内在なり脾臓および肝臓に細菌の急速な普及につながる後感染1,3,22。 NK細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージの活性化及び病原体3に対する早期の抵抗のために重要です。しかし高感染性用量で、IFN-γの産生も病原体のクリアランス23に損害を与える恐れがあります。 NKT細胞は、病原体2,24の初期制御時の脾臓および肝臓におけるIFN-γの供給源であり、この生産は、NK細胞2を含む他の細胞型によってIFN-γ産生を増幅することが示されています。一方、後に作用する適応型Tリンパ球パルティで、CD8 + T細胞cularは、病原体のクリアランスを媒介し、再感染1,4,22に対する保護を提供するために重要です。 この感染モデルは、（1件）いくつかの理由のための研究者にとって魅力となっています。まず、病原体による感染は非常に再現性があり、強力なTh1および細胞性免疫応答を誘導します。第二に、致死感染中に、細菌負荷は、それが容易に測定することができ、肝臓及び脾臓に集中しています。第三に、病原体を安全バイオセーフティーレベル2（BSL2）条件下で取り扱うことができます。第四に、生物とそれが広範囲に特徴づけられている生成する免疫応答。最後に、変異体および遺伝的に改変された株の様々な使用のために利用可能であるが開発されています。 ここで説明するL.のEGD株とC57BL / 6Jマウスの接種のための基本的なプロトコルは25とIFNを測定するためのモノサイトゲネスれる-再γNK、NKT、および適応リンパ球感染後によりsponses。また、致死感染後の脾臓および肝臓における細菌負荷を測定し、病原体の改変LD 50用量での感染後の生存研究を行う方法について説明します。最後に、代表的なデータは、このプロトコルはL.、感染モノサイトゲネスからのIFN-γ応答およびマウス生存に対する新規治療法の効果をスクリーニングするために使用することができる方法を示しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Brain Heart Infusion Broth, Modified</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">299070</td>
			<td style="width:273px;">any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:107px;">214010</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">X100</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1xPBS</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">D8537</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TissueLyser II</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">85300</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ammonium Chloride (NH3Cl)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">KHCO3</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">22400089</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">12483</td>
			<td>Before use, heat-inactivate at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554724</td>
			<td>Use 4 &#956;l in 6 ml cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">16% Paraformaledehye</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">10 x Perm/Wash buffer</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554723</td>
			<td>Dilute 10x in ddH20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">14-0161</td>
			<td>Dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">65-0866</td>
			<td>Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">15-0041</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">11-0081</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS57/mCD1d tetramer-APC</td>
			<td style="width:191px;">NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td>Obtained as a gift from the facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse TCR&#946;-PE-Cy7 (H56-597)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-5961</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">47-3351</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-0451</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">12-7311</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">01-1111</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Mouse IFN gamma ELISA kit</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td>88-7314</td>
			<td>Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50 mL vented tubes for culture</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">bacterial petri dishes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2 ml cyrovials</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">UV spectrometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">safety engineered needles</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">C57BL6/J</td>
			<td style="width:191px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:107px;">Stock#000664</td>
			<td>Order for arrival at 7 wks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Glass beads</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>rotor, buckets, bucket covers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Sterile Glycerol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70 micron strainers</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3 ml syringe</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette gun</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Filtration Units</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Round bottomed plates</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">FACs tubes</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Flowjo software</td>
			<td style="width:191px;">Treestar</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Multichannel pipettor (0-300 &#181;l)</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing glass beads, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microbank Bacterial Preservation System</td>
			<td style="width:191px;">Pro-lab Diagnositics</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental infection with listeria monocytogenes as a model for studying host interferon-&#947; responses

リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介性疾患の原因であるグラム陽性細菌です。この病原体によるマウスの実験的感染は、細胞内病原体に対する宿主の免疫における自然免疫と適応免疫細胞および特定のサイトカインの役割に非常に有益となっています。 リステリア菌と亜致死感染の間の生来の細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージおよび病原体1-3の初期の制御を活性化するために重要です。また、適応メモリリンパ球によるIFN-γ産生が再感染4時に先天性細胞の活性化をプライミングするために重要です。 L.は、このように感染モデルをモノサイトゲネス IFN-γの産生を増加させるために設計されている新しい治療法は、in vivoでの IFN-γ応答に影響を与えると、そのような細菌のクリアランスを大きくするか、マウスの生存率を向上させるなどの生産的な生物学的効果を持っているかどうかを調査するための優れたツールとして機能しますから感染。 リステリア菌のEGD株とC57BL / 6Jマウスの腹腔内感染を行うために、フローサイトメトリーによって、NK細胞、NKT細胞、および適応リンパ球によるIFN-γの産生を測定する方法のための基本的なプロトコルは、ここで説明します。 （1）成長し、接種菌を調製し、（2）脾臓及び肝臓における細菌負荷を測定し、エンドポイント（3）測定動物の生存：また、手順がに記載されています。代表的なデータは、この感染モデルは、 リステリア・モノサイトゲネスおよびこの感染からマウスの生存に対するIFN-γ応答の特定の薬剤の効果を試験するために使用することができる方法を説明するために提供されます。

図3は、病原体の10 5 CFUで24時間の感染後に脾臓NK細胞およびNKT細胞におけるIFN-γのいくつかの典型的なフローサイトメトリー染色を提示します。この図はまた、表2に記載の染色パネルのためのゲーティング戦略を示しています。 図4は、雄マウスは、PPARαアンタゴニストIS001や車両制御で処理された10 5 CFU リステリア菌に感染させ、その後、24時間後にNK細胞とNKT細胞におけるIFN-γについて分析した一つの実験で得られたいくつかの代表的なデータを示しています。この図は、IS001を用いた治療は、病原体に感染した後、NK細胞、NKT細胞によるIFN-γ応答をブーストではなく、ことを示しています。 図5は、熱殺菌PAでのex vivoでの再刺激後7日目の脾臓CD4 +およびCD8 + T細胞におけるIFN-γのための代表的な染色後の感染を示していますthogen。この図はまた、表3に記載の染色パネルのためのゲーティング戦略を示しています。 図6は 、感染後7日で、雄マウスは、PPARα拮抗薬IS001またはビヒクル対照で毎日処置した一つの実験で得られたリステリア菌の致死未満量に感染させ、そして分析した代表的なデータを示しています。この実験は、IS001を用いた治療は、両方のCD4 +およびCD8 +リンパ球によるIFN-γ応答を増強したことを示しています。 図7は、病原体の変更されたLD 50用量を感染させた後、エンドポイントにマウスの生存に対するPPARαアンタゴニストIS001の効果を調べた研究からの代表的なデータを示しています。プロットは、時間後の感染に対するマウスの生存率です。この図は、IS001を用いた治療は、エンドポイントに雄マウスの生存率を増加したことを示しています。一緒に、これらのデータは、このモデルを調査するために適用することができる方法を示してこれらの免疫の変化が、感染から動物の生存に影響を与える方法を探求するin vivoでの IFN-γ応答に新しい薬や治療の効果と。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig1.jpg" /> 感染マウスから脾臓を解剖図1。写真のこのシリーズは、デッドマウスから脾臓を分析する方法を示しています。 （a）はその右側にマウスを横になって、70％エタノールで皮膚を下にスプレー。 （b）は 、無菌または滅菌ピンセットとタフカットはさみを使用して、ちょうど肋骨の下の下の皮膚を切開。 （C）70％エタノールで露光筋層を下にスプレー。脾臓は、筋層（白抜き矢印ヘッド）の下に表示されるはずです。 （d）の無菌または滅菌鉗子と細かいハサミを使用して、脾臓を明らかにするために、筋層を切開。 （e）は静かに鉗子とuと脾臓をつかみますSE細かいハサミは結合組織を取り巻くから離れて脾臓をカットします。 （f）は 、滅菌1×PBSを含む15ミリリットルコニカルチューブに脾臓を置きます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig2.jpg" /> 血球計数器を用いて、図2.計数脾細胞。 （a）は 、血球計数器の中央のグリッドを示しています。 （B）25大正方形を（それぞれが16より小さい正方形を含むこと）が含まれ、中央グリッドの拡大図を示します。カウントのために使用される5大正方形は灰色（4隅の正方形プラス中央グリッドの中央広場）で強調表示されます。 （c）は 、大きな灰色の正方形の一つの拡大図を示します。 10 6 / mlの、最初の数の細胞容積を決定するために、5大規模な灰色の四角内の全ての生細胞。図示の例では、このカウントは215カウントすると、唯一のグリッドの右側と下部に二重線に触れているものも含め、明確な（非青）細胞のすべてを、カウントするようにしてくださいです。グリッドの左と上に二重線に触れる細胞をカウントしないでください。合計5平方数を取り、10 6 / mlの中の細胞の数を取得するために10で割っ。実施例では、10で割った215 21.5×10 6細胞/ mlです。トリパンブルーで1：これらの計算のみを強調されているように、あなたが大きな正方形の5をカウントしている場合は動作し、あなたの細胞1を希釈することに注意してください。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig3.jpg" /> IFN-γの検出のための図3.ゲーティング戦略NKおよびNKT細胞におけるγ産。 SSC-プロットすることにより、FSC-A上のリンパ球上の第1ゲート。その後、FSC-H / FSC-プロット上に対角線上にあるそれらのイベントの上にゲート。これらはシングレットです。そしてライブ（AmCyan - ）上のゲートおよびCD8 -細胞。そして、TCRβに対するテトラマー染色をプロットします。 NKT細胞は、二重陽性集団内で、NK細胞は、二重陰性集団内です。二重陽性細胞、およびFSC対プロットNKp46の上のゲート。 NKT細胞（このゲートは、NK細胞のプロットから2つの集団に分割点を見つけることによって設定することができます）ですNKp46の陰性集団にゲート、。 TCRβ - - NKp46の+集団NK細胞は四量体です。 NKおよびNKT細胞ゲート内では、PEチャンネル内のIFN-γ+細胞は、FMOの制御に基づいてゲートを設定した後に同定されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig3large.jpg" target="_blank">クリックしてください</a>ここで、この図の拡大版を表示します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig4.jpg" /> 図4.代表的なデータは、24時間の感染後にIFN-γ+ NKおよびNKT細胞の頻度用として取得しました。この実験では、雄のC57BL / 6Jマウス（N = 3 - 4 /群）は10 5 CFUのL.モノサイトゲネスに感染IPたまたは未感染のままにしました。マウスはまた、接種および後12時間の同時に薬物IS001またはビヒクル（0.5％カルボキシメチルセルロース）を投与しました。 24時間接種後、マウスを安楽死させ、脾臓を除去し、個別に処理され、フローサイトメトリーのために染色しました。示した車両または薬物IS001で処理した後の非感染または感染したマウスにおけるNKにおけるIFN-γ+細胞（A）又はNKT細胞ゲートのSEM周波数±平均（B）です。 *示す両側t検定によりビヒクル対照からのSA差（P &lt;0.05）。データは、 免疫学のジャーナル （容積195頁。5189から5202、2015）からの許可を得て31から再印刷されます。著作権2015年免疫学者のアメリカ協会、Inc.は、 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig5.jpg" /> 図5. CD4とCD8細胞におけるIFN-γの産生を検出するためのゲーティング戦略。 SSC-AのプロットによってFSC-A上のリンパ球上の第1ゲート。その後、FSC-H / FSC-プロット上に対角線上にあるそれらのイベントの上にゲート。これらはシングレットです。このゲートの中で、ライブ上のゲート（AmCyan - ）CD45 +細胞。そして、CD8 +またはCD4 +集団のいずれかの上にゲート。各ゲート内では、IFN-γ+PEチャネル中の細胞は、FMOの制御に染色を比較することによって同定されます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig6.jpg" /> 図6.代表的なデータは、 リステリア・モノサイトゲネス （EGD株）と7日後に感染症でIFN-γ+ CD4 +およびCD8 + T細胞の頻度用として取得しました。この実験では、雄のC57BL / 6Jマウスは、2×10 4 CFU のL.モノサイトゲネス （N = 7 /群）または非感染のままにした（N = 3 /群）に感染腹腔ました。マウスはまた、接種日の薬物IS001またはビヒクル（0.5％カルボキシメチルセルロース）、一日二回起動を投与しました。 7日後、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出し、個別のために処理しました細胞培養。脾細胞の単核細胞は、培養の最後の4時間添加阻害剤タンパク質輸送と熱殺菌リステリア・モノサイトゲネスを用いて24時間刺激しました。次いで、細胞をフローサイトメトリーのために染色しました。 IFN-γビヒクル（0.5％カルボキシメチルセルロース）での処理後のCD4 +（A）または非感染または感染したマウスにおけるCD8 +細胞ゲート（B）に+細胞または薬物IS001のSEM周波数±平均値が示されています。 *は、両側t検定によって決定されるように、車両制御相手との差（P &lt;0.05）を示します。データは、 免疫学のジャーナル （容積195頁。5189から5202、2015）.Copyright 2015免疫学者のアメリカの協会から許可を得て31から再印刷され、Inc.は、 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図7.代表的なデータは、 リステリア・モノサイトゲネスを持つオスのC57BL / 6Jマウス（EGD株）の感染後のエンドポイントへのマウス生存に対するPPARαアンタゴニスト1S001の効果を比較すると、実験中に得られました。この実験では、雄のC57BL / 6Jマウス（N = 10マウス/群）は、リステリア・モノサイトゲネスの病原体の改変されたLD 50用量（10 5 CFU）に感染腹腔ました。マウスはまた、接種日の薬物IS001またはビヒクル（0.5％カルボキシメチルセルロース）、一日二回起動を投与しました。マウスは、臨床徴候について毎日続いたと人道的エンドポイントが満たされた場合に安楽死させました。示したログランク検定（P &lt;0.05）によって決定されるように、経時的エンドポイントにマウスの生存率*は、群間の生存の差を示しています。データは、 ジャーナルOから許可を得て31から再印刷されています免疫学（容積195頁。5189から5202、2015）は、f。著作権2015年免疫学者のアメリカ協会、Inc.は、 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54554/54554table1.jpg" /> 表1：日培養物のアリコートにCFUを決定するためのいくつかの代表的な計算を表示します。この例では、一日の培養物のアリコートを採取し、1に希釈した：BHI培地で1。この希釈された試料のOD 600は 0.84であると決定されました。加えて、100μlのアリコートをCFUの決意のために採取しました。このサンプルは、BHI培地を900μL（10 -1）で希釈し、洗浄し、1mlのBHIに再懸濁しました。このサンプルの10倍希釈系列（10 -9〜10 -2）を調製し、希釈したサンプルをBHI AGA上にプレーティングしましたrのプレート（10 -4〜10 -9のための値のみが示されています）。翌日コロニーを計数しました。 30から300の間のコロニー数を持っていただけのプレート（ すなわち 、10 -6プレートは、黄色で強調表示）の計算のために考慮されました。このプレート（70）上のコロニーの数は、その後、希釈されたサンプルのCFU / mlのを取得するために、0.1（メッキミリリットル中容量）で割りました。この値は、非希釈培養物のCFU / mlの測定値を得るために希釈係数（10 6）を乗じました。 TMTCカウントするにはあまりにも多くの=。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/54554/54554table2.jpg" /> 表2：NK およびNKT細胞における 検出IFN-γのための染色パネル 。パネルまたはCD4抗体クローンGK1.1の種々の蛍光色素のバージョンで染色した脾細胞で使用されるフロー抗体で染色補償ビーズのいずれかは、単一の正の対照として使用することができることに注意してください。 <img alt="表3" src="/files/ftp_upload/54554/54554table3.jpg" /> 表3：CD4 + およびCD8 + 細胞 における 検出IFN-γのための染色パネル 。パネルまたはCD4抗体クローンGK1.1の種々の蛍光色素のバージョンで染色した脾細胞で使用されるフロー抗体で染色されたいずれかの補償ビーズは単一のポジティブコントロールとして使用することができることに留意されたいです。

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Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

このプロトコルは、 リステリア・モノサイトゲネスのEGD株と（リステリア菌）を C57BL / 6Jマウスに接種すると、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞によるインターフェロンγ（IFN-γ）反応を測定する方法を説明しますそして、適応Tは、感染後のリンパ球。このプロトコルは、病原体の改変されたLD 50用量での感染後のマウスの生存の研究を実施する方法について説明します。

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K ビュー.  University of Toronto. このプロトコルは、 リステリア・モノサイトゲネスのEGD株と（リステリア菌）を C57BL / 6Jマウスに接種すると、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞によるインターフェロンγ（IFN-γ）反応を測定する方法を説明しますそして、適応Tは、感染後のリンパ球。このプロトコルは、病原体の改変されたLD 50用量での?...

ビデオ: Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

の口頭伝達<em&gt;リステリア菌</em&gt;汚染された食品の摂取を介したマウスにおける

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em&gt;リステリア菌</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.