1.抗体は大容量磁気プロテインAまたはプロテインG磁気ビーズ上に捕獲<ol><li>一様に穏やかに振盪することにより磁気ビーズを再懸濁します。ビーズを小分けするときサスペンションを均一に保ちます。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにビーズスラリー50μlのを追加します。 10秒間磁気スタンドに置きます。大切に保管してバッファを削除します。 </li><li>抗体結合緩衝液の250μlのを追加します。 </li><li>混合し、10秒間磁気スタンドに置きます。慎重に結合緩衝液を除去します。 </li><li>ビーズに抗体の50-100μgのを含む試料の1.0ミリリットルを追加します。試料は、細胞培地中の抗体または抗体を精製することができます。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。 </li><li>抗体結合/洗浄緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間マグネチックスタンドに置き、結合/洗浄緩衝液を除去します。このSを繰り返し2回の洗浄の合計のためのTEP。 </li><li>アミン化学を用いてラベル抗体に対する第2に、またはチオール化学を用いてラベル抗体と第3節に進んでください。 </li></ol>アミン化学を使用した2抗体ラベリング<ol><li>コンジュゲート抗体<ol><li>ビーズにアミン結合緩衝液の100μlのを追加します。 </li><li>染料の1.0 mgのジメチルスルホキシド（DMSO）100μlを加えることによっての10mg / mlのアミン反応性蛍光色素（のAlexaFluor 532-SE）を溶解します。ボルテックスで混和します。使用直前にこのソリューションを行います。 </li><li>抗体100μgのためにアミン反応性色素の2.5μlを添加します。 注意：一般的に反応染料の5-20モル過剰が推奨されます。しかし、反応性染料の量は、経験的に、抗体の比と固有の抗体の特性に所望の染料に応じて最適化する必要がある反応物に添加しました。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズがサスペンシオに残っていることを確認しますn個。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。 </li><li>抗体結合/洗浄緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間磁気スタンドに置きます。削除し、結合/洗浄緩衝液を廃棄します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>抗体の回復<ol><li>ビーズに溶出緩衝液50μlを追加します。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で5分間混合します。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。溶出されたサンプルを削除し、中和バッファーを5μlを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。 </li><li>プロセスをもう一度繰り返し、溶出されたサンプルをプールします。 </li><li>抗体濃度を定量し、色素と抗体の比率項4に記載の方法。 </li></ol></li></ol>チオール化学を使用した3抗体ラベリング<ol><li>抗体削減<ol><li> 250μLを追加チオール結合緩衝液と混合します。 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。バッファを削除し、破棄します。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>チオール結合緩衝液の100μlのを追加します。 </li><li> 2.5mMの最終濃度までジチオスレイトール（DTT）を加えます。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを配置し、バッファーを捨てます。 </li><li>チオール結合緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。バッファを削除し、破棄します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>チオール結合緩衝液の100μlのを追加します。 </li></ol></li><li>コンジュゲート抗体<ol><li>染料の1.0 mgの100μlのDMSOを添加することによって、/ミリリットルの10mgでチオール反応性染料を溶解させます。ボルテックスで混和します。使用直前にこのソリューションを行います。 </li><li>抗100μgのためのチオール反応性色素の2.5μLを追加体。 注意：一般的に反応染料の5-20モル過剰が推奨されます。しかし、反応性染料の量は、経験的に、抗体の比と固有の抗体の特性に所望の染料に応じて最適化する必要がある反応物に添加しました。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。 </li><li>チオール結合緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間マグネチックスタンドに置き、バッファを削除します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>溶出抗体<ol><li>ビーズに溶出緩衝液50μlを追加します。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で5分間混合します。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。溶出されたサンプルを削除し、NEUTの5μLを含む新しいマイクロ遠心チューブに移しますralizationバッファ。 </li><li>プロセスをもう一度繰り返し、溶出されたサンプルをプールします。 </li><li>抗体濃度を定量し、色素と抗体の比率項4に記載の方法。 </li></ol></li></ol> 4.計算色素と抗体比<ol><li> 280 nmの（A280）で色素（Amaxの）のためのλmaxでの抗体 - 色素複合体の吸光度を測定します。 </li><li>抗体濃度を計算します。 抗体濃度（mg / mlで）= A280 - （CF× 最大 ）/ 1.4 CFは、（製造者によって提供される）色素の補正係数=場所。 </li><li>色素と抗体の比率を計算します。 色素と抗体比（DAR）=（15万×MAX）/抗体濃度（mg / ml）×ε 色素 ここで、ε 色素は 、その吸収極大および抗体=15万ダの分子量で、色素の吸光係数を=。 </li></ol>

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Authors are employees of Promega Corporation.

この研究の目的は、小分子の様々な、低濃度で細胞培地中に存在する抗体を標識する方法を開発することでした。抗体発見の初期段階で多数の抗体を可能にするような方法では、小分子で標識され、生物学的に関連するアッセイを用いてスクリーニングすることができます。 1つのこのようなアッセイは内在化があっても同様の結合親和性を有する抗体の間で変動し得る受容体が媒介する抗体の内在化アッセイです。したがって、従来の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）ベースのスクリーニングに加えて、それらの内在化特性について具体的に抗体をスクリーニングすることが重要です。初期の抗体開発段階で抗体を標識する方法のための重要な要件は次のとおりです。直接細胞培地から抗体を標識するa）の能力。 b）細胞培地中の抗体濃度は、を50μg/ mlである場合、例えば、低濃度で存在する抗体を標識する能力。 C）標識抗体および抗体濃度の純度は、下流のアプリケーションとの互換性を保つ必要があります。 d）の方法は、アミンおよびチオールベースの​​結合化学の両方と互換性があります。 e）の方法は、複数のサンプルを同時に処理すると互換性があります。 これらの要件を考慮すると、我々は高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズを使用して、ビーズ上の抗体標識および精製方法を開発しました。これらのビーズは、低非特異的結合特性を有する親水性セルロースに基づき、 図2に示すように、高純度の抗体調製物をもたらしている。ビーズの大容量ビーズ少量の効率的なメディアおよび抗体由来の抗体を捕捉することができることを意味します従って、抗体を濃縮少量で溶出します。 表1において、唯一の10μlをANビーズを1.0 mlのサンプル（予想濃度50-100 / mlの）からの抗体を捕獲するために使用された沈降しましたD標識された抗体は、200-500 / mlの間の濃度で120μlの容量で溶出しました。これらの濃度は、典型的な抗体濃度は1.0μgの/ mlのから10ng / mLの15,16の範囲でセルベースの内在化実験と互換性があります。ビーズ上の標識方法は、アミン及びチオールの化学的性質の両方と互換性があり、色素と抗体の比率の広い範囲は、標識された抗体（ 表1）の効率的な回収に伴って達成することができます。実験は三連で行われた、最大12サンプルがかなりの処理時間を短縮する、手動で並列に処理されました。標識化のスループットはさらに、磁気ビーズ19,22を使用する他のアプリケーションに示されているように、ロボットプラットフォームを使用することによって増加することができます。 抗体の回収及び標識efficieを維持しつつ、高い抗体量の試料を容易に捕捉するために使用されるビーズの量を増加させることによって対応することができますNCY（ 表2）。種々の染料抗体コンジュゲートを作製することができることが、色素と抗体の比率を最適化する必要があるので、この方法は、複数の染料と互換性があります。 2-4の抗体比染料11,12最適であると決定され、承認されたADCの場合には、抗体当たり3.5薬物の平均23が報告されています。上のビーズ結合化学によれば、抗体当たり小分子の最適な数は、下流側のアプリケーションの要件に応じて調整することは比較的容易です。また、標識のためのチオールとアミンの化学的性質の両方は、 インビボ安定性、すなわち抗原および受容体結合が示されているようにADCの重要で最良化学オプションを決定するために試験することができ、抗体の治療活性は、コンジュゲーション化学24に依存します、25。 良好な抗体標識と回復を達成するためのいくつかの重要な要因があります。小分子aのプロパティ抗体比に対する抗体の回復と色素の両方のための重要なドライバの再。疎水性小分子、抗体比が高い色素は、ビーズと大幅に減少した抗体の回収に標識抗体の非特異的付着を原因となります。時には、色素と抗体特性に応じて、我々は1ビーズが故に、他のより良い仕事得ることを見出し、最適化中のビーズの両方のテストが有用である可能性があります。プロテインA及びプロテインGは、異なる種由来の抗体のために、適切なビーズを選択する際に考慮すべきである異なるサブタイプの異なる親和性21を有しています。例えば、プロテインAは、したがって、プロテインGビーズが強く推奨されているマウスIgG1との親和性が低いです。チオール化学のために、DTT及びTCEP還元剤は同様に良好に動作します。 DTTは、しかしそれ故に完全に洗浄することにより除去されるべきであるマレイミド反応を阻害します。 2.7の低pHは、溶出のために推奨されていますが、2.2の低いpHは、効率的なRECのために必要とすることができますいくつかのケースではオーヴェリー。低pHで変性することができる標識された抗体を効率的に回収し、抗体の機能性とのバランスは、経験的に決定されなければなりません。よく標識化学は、抗体-抗原結合活性11,23に影響を与えることが知られている、したがって、所望の下流側のアプリケーションを使用して標識した後、抗体の機能性をテストするために絶対に必要です。 要約すると、我々は、任意の前の精製工程なしで直接細胞培地から蛍光色素を有する抗体を標識する方法について説明します。この方法は、高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズを活用し、高濃度10,11で高度に精製された抗体を必要とするソリューションベースの標識方法を超える有意な改善です。磁気ビーズの使用は、非磁 ​​性ビーズに基づく標識法17,18よりも有利で ​​あるマニュアルだけでなく、自動化された試料の取り扱いを可能にします。大容量の最後に、使用BEADSは、ビーズの少量を使用して、マイクログラムから数百低いマイクログラムレベルからの抗体の標識反応のスケールアップを可能にし、他の磁気ビーズに基づく標識方法19からこのメソッドを区別します。ここで紹介するプロトコルは、蛍光色素で抗体を標識が記載されているが、この方法は、ビオチン、細胞傷害性薬物およびおそらく酵素を含む他のラベルに拡張することができます。

小分子で標識された抗体は、おそらく生物学1,2で最も一般的に使用される試薬です。蛍光色素とビオチンで標識された抗体広範囲撮像に使用される、免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびその他のアプリケーション3-6間の免疫沈降。放射性標識した抗体3,7イメージングおよび治療 ​​における広範な使用を見出す、細胞毒性薬（のADC）で標識した抗体は、癌の治療に新たな選択肢を提供している、と2個のADCは、既に治療的使用の8のために承認されています。その広範な使用にもかかわらず、抗体を標識するための方法は、驚くほど変化しないままで、通常は複数の反応を伴い、脱塩が9-12ステップしています。解決方法は、わずか数抗体が標識される必要があり、高濃度で高度に精製された形態で利用可能である場合には、十分なボリュームで非常にうまく機能します。しかし、ADCのような新しいアプリケーションのために、そこにあります例えば、それらは生物学的に関連する特性についてスクリーニングすることができるように、初期のハイブリドーマ段階で抗体を標識する必要があり、受容体媒介性抗体の内在13-16。ハイブリドーマ段階で、サンプル容量は限られている抗体が低濃度で発現され、サンプルの数は、従って、溶液ベースの標識方法は適していない、大きいです。 従来の抗体標識法のスループットを簡素化し、改善するために、いくつかの代替的なアプローチは、17,18提案されています。一つのアプローチは、標識および精製されたタンパク質の標識反応と溶出した抗体を捕捉するために、非磁性タンパク質小さなカラムに充填親和性ビーズを使用することです。この方法は、細胞培地から直接抗体を標識するために使用することができるが、列の使用が面倒であることができます。磁気ビーズに基づく方法は、最近のカラムの使用を排除し、スループットが、原因を改善すること19が報告されていますビーズの結合能力を制限された抗体には、抗体の低マイクログラム量にのみナノグラムを標識することができました。 我々は最近開発され、小分子20と細胞培地中に存在する抗体を標識するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズ（落ち着いたビーズのヒトIgG / mlでの&gt; 20 mg）を使用しました。ビーズの高容量は、抗体のマイクログラム数十〜数百が便利に標識することを可能にし、ビーズの迅速な磁気応答は、並列に多数のサンプルの取り扱いおよび処理を簡素化します。小分子の代替物として蛍光色素を使用して、我々は、この方法は、アミンおよびチオール標識化学と互換性があり、標識され、非常に純粋な抗体の高い回収率を提供していますことを示しています。 このプロトコルおよび付随するビデオは、磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いて細胞培地中に存在するマウス抗体のビーズ上の標識を説明します。プロトコルです4つのセクションに分かれて：第1節では、生物学的サンプルからビーズへの抗体の取り込みについて説明します。捕捉に続いて、アミン化学を用いて、またはチオール化学を用いて蛍光色素を有する抗体の標識は、それぞれ、セクション2およびセクション3に記載されています。最後に、セクション4は、抗体濃度の計算および抗体比染料のための方法が記載されています。

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Beads</td><td>Promega Corporation</td><td>&amp;nbsp;G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

蛍光染料のような小分子、細胞毒性薬、および放射性トレーサーで標識した抗体は、本質的な生物医学研究のツール、免疫診断およびより最近の治療薬としてあります。小分子を用いて抗体を標識するための従来の方法は、比較的高い濃度で精製された抗体を必要とする複数の透析工程を含み、スループットが制限されています。しかし、抗体薬剤コンジュゲート（ADC）ですの分野を含むいくつかのアプリケーションでは、細胞培地から直接抗体の標識化を可能にする新しい方法の恩恵を受ける。このような方法は、例えば、抗体は、生物学的に関連するアッセイにおいてスクリーニングされるADCの場合の受容体媒介性抗体内在化アッセイを可能にすることができます。ここでは、直接細胞培地から抗体の少量の標識化を可能にする方法（オン・ビーズ法）を説明します。このアプローチは、抗体を捕捉するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインG親和性ビーズを利用しますアミン又はチオール化学および標識抗体のその後の溶出のいずれかを使用して小分子で標識することにより、続いて細胞培地から。小分子の代替物として蛍光色素を取って、我々は、アミンおよびチオール標識化学の両方を用いて細胞培地から直接三つの異なるマウス抗体のビーズの標識を示します。プロテインA及びプロテインGに対する抗体の高い結合親和性は高い回収率だけでなく、標識抗体の高純度を保証します。また、磁性ビーズの使用が著しく標識スループットを向上させる、複数のサンプルを手動で処理することを可能にします。

高容量の磁気プロテインAおよびプロテインGビーズを使用して小分子と抗体を標識するための概略図を図1に示す磁気プロテインGビーズ上に捕捉された抗体は、ラベルアミン化学のいずれかを用いて、蛍光色素、例えば、小分子で標識することができます一次リジンアミノ酸のアミンまたは抗体のヒンジ領域中の還元チオールでラベルチオール化学を用いて。抗体とプロテインGとの間の親和性は、標識反応時の抗体の損失を最小限に21、結果強いです。これは、単純な精製に比べて蛍光色素で標識した後、三つの異なるマウス抗体アイソタイプの効率的な回収率（50％〜90％）（ 表1）に反映されています。 （19の前に報告されたものと同様の）効率的な回収がクマシーゲルでも明らかである（ 図2）バンドintensi精製された抗体および標識抗体の重鎖および軽鎖の関係を表1に報告された結果を反映する。クマシーゲル（ 図2）に見られるような磁気プロテインGビーズは高度に精製された抗体をもたらす低非特異的結合特性を有し、両方の重鎖および軽鎖は、蛍光（ 図2）標識されています。ビーズ上の標識は、磁気プロテインAビーズで行われ、抗体の比（ 表2）の高回収率と良好な色素を生じる複数の蛍光色素と適合性であることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig1.jpg" /> 蛍光分子を有する抗体のビーズ上の標識の図1の回路図。 （A）抗体標識チオール化学を用いて。抗体は、高容量の磁気プロテインAまたは磁気プロテインG Bに捕捉されますDTTまたはトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）などの還元剤を用いて鎖間ジスルフィド結合の還元、続いてEADS。蛍光染料を含有するチオール反応性マレイミドは、抗体を標識するために添加されます。標識抗体は、低pH溶出によって回収し、すぐに中和されます。 （B）抗体標識アミン化学を使用して。高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズ上に捕捉された抗体は、リジンの第一級アミンで抗体を標識するためにアミン反応性蛍光色素と反応させます。標識抗体は、低pH溶出により溶出し、直ちに中和されます。ナス、N. ら20から適応<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig2.jpg" /> 図2. 変性Sマウスを3 IgGのDS-PAGEゲルの画像上のビーズ法を用いて、精製し、のAlexaFluor 532で標識したアイソタイプ（A）アミン反応物（B）チオール反応。チオール反応性色素で標識された抗体のゲル画像。レーン1-6は、 表1に示したサンプルに対応する。ゲルは、第一の蛍光スキャナを用いて画像化し、のみのAlexaFluor 532標識抗体の重鎖および軽鎖を示しました。抗体のみを精製したサンプルは表示されません。ゲルは、その後、標識した抗体と同様に精製した抗体からの重鎖および軽鎖を表示するにはクマシー染色で染色しました。ナス、N. ら 20から適応<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td colspan="2"> アミン反応 </td><td colspan="2"> チオール反応 </td></tr><tr><td> よく </td><td> アイソタイプ </td><td></td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比の染料 </td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比の染料 </td></tr><tr><td> 1 </td><td rowspan="2">マウスIgG1 </td><td>精製</td><td> 54.8±1.8 </td><td> 0 </td><td> 49.2±2.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td>共役</td><td> 27.4±3.2 </td><td> 4.2±0.2 </td><td> 46.​​2±3.5 </td><td> 1.6±0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td rowspan="2">マウスIgG2a </td><td>精製</td><td> 85.9±6.4 </td><td> 0 </td><td> 75.3±8.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Conjugエーション</td><td> 60.7±3.2 </td><td> 4.4±0.1 </td><td> 61.5±7.4 </td><td> 5.5±0.4 </td></tr><tr><td> 5 </td><td rowspan="2">マウスのIgG2b </td><td>精製</td><td> 79.9±6.9 </td><td> 0 </td><td> 73.3±1.4 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 6 </td><td>共役</td><td> 66.7±0.5 </td><td> 5.6±0.1 </td><td> 55.7±0.9 </td><td> 5.2±0.5 </td></tr></tbody></table> 表1は三つのマウスIgGのビーズ上の標識は、アミンおよびチオール化学を用いて細胞培地から直接アイソタイプ各サンプルについて、。 1.0 mlのCell培地の1つのアリコートを、単にアミン反応性のAlexaFluor 532色素でのビーズの標識のために使用した磁気プロテインGビーズ（50μlのスラリー）と第二のアリコートを用いて抗体を精製するために使用しました。両方の場合において、抗体回収率を算出した（本文参照）ANDは、標識反応中に抗体の損失を決定するために比較しました。抗体比染料は、すべての3つの抗体について計算しました。全ての反応を三連で行いました。ナス、N. らから適応。20 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> 磁気プロテインGビーズ </td><td colspan="2"> 磁気プロテインAビーズ </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比染料 </td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比染料 </td></tr><tr><td> 1 </td><td>精製</td><td> 263.7±10.4 </td><td> 0 </td><td> 269​​.4±5.1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> AlexaFluor532 </td><td> 182.9±15.3 </td><td> 5.377; 0.04 </td><td> 189.1±6.9 </td><td> 6.9±0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> AlexaFluor647 </td><td> 192.5±2.9 </td><td> 3.3±0.1 </td><td> 112.3±11.4 </td><td> 3.6±0.2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td>フルオレセイン</td><td> 179.5±5.3 </td><td> 6.8±0.1 </td><td> 201.5±6.5 </td><td> 6.8±0.1 </td></tr></tbody></table> 表2：3つの異なるチオール反応性蛍光色素とマウスIgG2aのオンビーズ標識濃縮細胞培地のサンプルがその方法を示すためにこの実験に使用したが、抗体の異なる量を採用することができます。また、コンジュゲーション反応は、磁気プロテインG、並びに磁気プロテインGビーズ（100μlのスラリー）を用いて抗体の精製に使用した細胞培地濃縮1.0 mlに磁気プロテインA Oneアリコートを用いて行きました。他の三つの1.0ミリリットルのアリコートsがチオール反応性のAlexaFluor 532、のAlexaFluor 647およびフルオレセインで標識し、精製しました。抗体回収率を算出した（本文参照）および種々の標識反応を比較しました。抗体比染料はまた、3つすべての蛍光色素について計算しました。同様の精製および標識は、磁気プロテインAビーズを用いて行きました。全ての反応を三連で行いました。ナス、N. らから適応。」20 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> コメント/説明 </td></tr><tr><td>アミン結合緩衝液（10mM重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 8.5） </td><td> 1. 0.084グラムの重炭酸ナトリウム 2.脱イオン水に溶解します。 pH8.5に調整します。 3.脱イオン水で100ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>チオール結合緩衝液（1mMのEDTA、pH7の10 mMリン酸緩衝液。0） </td><td> 1. 0.0378グラムのリン酸ナトリウム、一塩基性、一水和物 2. 0.195グラムのリン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物 3.脱イオン水に溶解します。 4. 1.0ミリモルの最終濃度にEDTAを追加します。 5. pHを7に調整します。 6.脱イオン水で100ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>抗体結合/洗浄緩衝液（10mMリン酸緩衝液、pH 7.0） </td><td> 1. 0.0378グラムのリン酸ナトリウム、一塩基性、一水和物 2. 0.195グラムのリン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物 3.脱イオン水に溶解します。 pHを7に調整します。 4.脱イオン水で100ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>溶出緩衝液（50mMのグリシン緩衝液、pH 2.7） </td><td> 1. 0.188グラムのグリシン 2.脱イオン水に溶解します。 HClで2.7にpHを調整します。 3.脱イオン水で50ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>中和緩衝液（2 Mトリス緩衝液、pH 7.5） </td><td> 1. 0.472グラムトリズマベース 2. 2.54グラムのトリズマ塩酸塩 3.脱イオン水に溶解します。 pH7.5に調整します。 4.脱イオン水で10ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr></tbody></table> 表3：バッファー成分。

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Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

小分子を有する抗体を標識するためにビーズ法は、細胞培地から直接抗体の少量の標識化を可能にします。この方法は、アミンおよびチオール化学と互換性があり、手動または自動化されたプラットフォームを使用して、並行して複数のサンプルを処理することができます。

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K ビュー.  Promega Corporation. 小分子を有する抗体を標識するためにビーズ法は、細胞培地から直接抗体の少量の標識化を可能にします。この方法は、アミンおよびチオール化学と互換性があり、手動または自動化されたプラットフォームを使用して、並行して複数のサンプルを処理することができます。 

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Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

検出するための実験プロトコール<em&gt;シアノバクテリア</em&gt;抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

環境学

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

神経科学

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

生化学

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

生物学

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

An Immunolabeling Technique to Visualize the Subcellular Localization of Proteins

Source: Aishwarya, R., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64085">Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a technique for the immunolabeling of sigma-1 receptors in a murine heart tissue section using quantum dots. The heart tissue is fixed, osmicated, stained, dehydrated, embedded in resin, and then sectioned. The sections are then treated with antibodies and labeled with quantum dots to demarcate the subcellular localization of Sigma-1 receptors using electron microscopy.

タンパク質の細胞内局在を可視化する免疫標識技術

1. Animal preparation

	Anesthetize the mice using 3% isoflurane. Open the chest by making a horizontal incision in the region above the middle abdomen ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

抗体ベースの技術

抗体ベースのイメージングと検出方法

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

要約

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検出するための実験プロトコール