The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.

すべてのマウス実験は米国の動物福祉法に基づいて行われたミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 マウスの心臓の単離のための1手法<ol><li>単回使用の刃で断頭により新生児マウスを安楽死させます。 </li><li> 70％エタノールで胸部を綿棒。 </li><li> ＃5ピンセットで横方向に皮膚を引っ張りながら、標準的なはさみで胸壁から離れて切断することにより、胸部から肌を解剖。 </li><li>腹壁を通して切断することによりハサミで胸骨のすぐ下の腹部を穿孔。はさみで胸の両側にリブかかわらず切断しながら、＃5鉗子で剣状突起をつかみ、身体から吻側胸骨を撤回。胸郭は、心臓を明らかにするためにピンセットで上方に反射されます。 </li><li>ぶっきらぼうにさらす、＃5鉗子で横方向に引っ張ることにより、胸腺の二つの主ローブを分析大動脈弓だけでなく、大静脈と肺静脈。 </li><li> 10cmの春のはさみで、大動脈弓、大動脈自体からの主要な動脈を横断。心のベースと腕頭動脈の間に大動脈を保持します。気管と食道からそれを分離し、前方の心を反映するために、＃5鉗子で切断された血管の端をつかみます。 </li><li> 10cmの春のはさみで心臓の両側に肺と心臓の間で切断することにより、肺血管系および他の主要な静脈を横断。静脈は排水を提供するために開いたままになります。 </li><li>主要な血管の切断端を把持し、＃5鉗子で縦隔から心臓を取り出します。カテーテル挿入のための滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む60mm培養皿に心を置きます。 </li></ol>ランゲンドルフ灌流によって脱細胞化のため2.方法<ol><li>事前にカテーテルアセンブリを準備します。 4センチメートルセクションを描きます小型化、薄型化カテーテルを作成するための小さなアルコールの炎におけるPE 50チューブの。寸法を満たすためにブレードを用いて両端をトリム（約約500μmの外径のフランジと300μmの外径OD）は、 図1に示す。これは、プルの各側面から2つの対称的なカテーテルを提供します。 </li><li>薄い端の開口部にフランジを溶融するために、簡単に炎の中にチューブの切断端を指します。 </li><li> PBSで12ミリリットル注射器を記入し、注射器に3方活栓を配置することによって、カテーテルを組み立てます。コックに22 G×1針を追加し、隔壁を通して針を駆動します。針（ 図1）上に描かれたPEチューブカテーテルをスライドさせます。 </li><li>すべての気泡が除去されたことを保証する、PBSとの組立部品を洗浄。 </li><li> 7-0縫合糸の1タイで大動脈弁とライゲート過ぎて伸びるない、孤立した心臓の大動脈に、上記で概説したように調製し、カテーテルを挿入します。トンのフランジを休ま彼はタイトなシールを作り、カテーテルから外れるの心を防ぐ、タイに対して近位カテーテル。 </li><li>優しくPBSを含む注射器を用いて心臓を灌流しながら、倍率の下でカテーテル法を守ってください。漏れがシステムに存在しないことを確認し、潜在血液が除去されるように組織が均一に白く。 </li><li>入口アダプタの首に隔膜を配置し、ガラスの上側面を折り畳むことによってそれを封印。 </li><li> 図 20に示すようmmHgで圧力を発生させる列を生成するのに十分な長さのラインを介して蒸留水（のdH 2 O）中の1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を60mlを充填したリザーバーを取り付けます。 1。1ミリメートル水銀の関係に基づいて、液柱の高さからの圧力を計算すると1.3595センチメートルのH 2 Oに等しいです。 注意：SDSは、刺激性の特性を有する非常に綿状粉末です。接触は避けるべきです。適切な防護服を使用した粉末を処理します。 </li><li> 14時間、1％SDSで心臓を灌流。心臓が観察されない残りの組織と外観に半透明になります。 </li><li>残りのSDS溶液のコックにシステムをフラッシュし、10ミリリットルのdH 2 Oでそれを置き換えます1×ペニシリンストレプトマイシン（ペニシリン-ストレプトマイシン）を含有する60ミリリットルのPBS、続いて10ミリリットルのdH 2 Oに続いて（蒸留水で希釈した）10ミリリットル、1％トリトンX-100との心を、灌流します。 </li><li> 4℃で1×ペニシリン - ストレプトマイシンを含むPBS中で心を保管してください。意図された後の脱細胞化アプリケーションが灌流を必要とする場合は、大動脈内カテーテルは、そうでなければ、縫合ネクタイをカットし、カテーテルを取り外し、維持されるべきです。 </li></ol> 3. DNAの決意<ol><li> 50のKCl、2.5mMのMgCl 2を、10 mMトリス（pHは8.3）で0.45％のTween 20中に200μg/ mlのプロテイナーゼKを使用して、脱細胞化ECMまたはコントロール心のダイジェストを準備します。 </li><li>組織が溶解するまで、攪拌しながら55℃で組織をインキュベート通常、4-5時間。 </li><li>アッセイ4,11を結合DNAとホモジネートのDNA含有量を定量します。 </li></ol> 4.固定および組織のセクショニング<ol><li>室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で脱細胞化し、再細胞化または制御P3心を修正しました。 </li><li> PBS 3倍で組織を洗います。 </li><li>それが沈むまで4℃で0.1 Mリン酸緩衝液中の7.5％スクロースの溶液中で組織を置きます。 </li><li>それは沈むまで、再度、4℃で0.1 Mリン酸緩衝液中15％スクロース溶液を変更します。 </li><li> 37°Cに組織を加温し、15％スクロースおよび0.1Mリン酸緩衝液中のゼラチン溶液で容量の半分を交換し、一晩平衡化。ゼラチンの濃度は、1％、2.5％、5％を介して段階的に増加し、最終的に7.5％倍されます。 </li><li>新鮮な7.5％のゼラチンを使用してcryomoldsでサンプルを置きます。脱細胞化サンプルの形状を復元するには、液体のゼラチンは、tとの室に灌流することができます彼の心臓は、成形されています。液体窒素でcryomoldsを浮遊させることによって凍結。 -80℃で保管してください。 </li><li>クライオスタットで切断し（厚さ10μm）のセクション。セクションの表面に近いスライドを持参し、セクションが原因で静電処理したスライド上の電荷を表面にナイフからオフに移動を観察。一晩スライドを乾燥させ、将来の分析のために-80℃で保存します。 </li><li>冷凍庫からスライドを外し、室温に平衡化した後、ゼラチンを溶解させ、37℃で20分間、PBSを含むコプリンジャーに配置します。 </li><li>ヘマトキシリンおよびエオシンでステップ4.7から切断面を染色します。コプリンジャーにスライドを置きます。 1.5分間剤を青味、1分間水道水を、3分間バッファー、1.5分間水道水を、45秒間ヘマトキシリンにステップ4.8で水和スライドを公開し、80％エタノールで1分間、アルコールエオシンY 8秒間、 1分間の3×1分、1分2×100％エタノール、エージェントをクリアする（キシレン代替物）80％エタノール、樹脂とカバーガラスベースの取り付けメディア。顕微鏡でスライドを調べます。 </li><li>加湿チャンバー内での水和スライドを配置することによって、このようなコラーゲンIVなどのECMの構造タンパク質のための心臓ECM、汚れのECMタンパク質の反応性の保持を確認し、0.1％トリトンを含むリン酸緩衝生理食塩水で10％正常ロバ血清（NDS）で処理するには室温（RT）で1時間-X100（PBST）。組織切片をカバーするのに十分な量を使用してください。 </li><li> 5％NDS / PBST中で経験的に決定された希釈での選択の一次抗体を含む溶液を交換してください。 150：例えば、コラーゲンIV抗体は1で希釈しました。 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> PBST 3倍でスライドを洗浄し、蛍光色素と結合した任意の二次抗体を適用します。経験的に決定された量によって抗体を希釈します。 RTで1時間インキュベートします。 PBS 3回洗浄します。 </li><li> mountiを含むDAPIを用いて細胞核が存在しないことを確認するために、例えば、DAPIなどのDNA結合色素とのスライドを染色カバースライドを滑る際にメディアをngの。 </li><li> 400Xの50での蛍光顕微鏡でスライドを調べます。 </li></ol>再細胞化のため5. P1新生児マウス心室心筋細胞<ol><li> 70％エタノールで各子犬をスプレーし、単回使用の刃で首を切ります。 </li><li>胸郭が胸腔を露出するように、小さな滅菌ハサミで正中線で分割されている間、親指と人差し指の間の各子犬を保持します。それは、主要な血管および唯一の心室組織を残して心房の自由切断されながら心臓が胸から自由に突出することを可能にするために圧力を適用します。 </li><li> 20 mlの氷冷カルシウム、全ての心が収集されるまで、20mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（CBFHH）と重炭酸フリーハンクス緩衝生理食塩溶液を含む50mlチューブに直接心を置き。 </li><li> CBFHHを吸引し、チューブに新鮮なCBFHH（氷冷）10〜15ミリリットル追加。トンで組織を旋回することによって、組織を洗います彼はチューブを数回。 </li><li> 60ミリメートルのプラスチックペトリ皿に心を含む溶液をデカント。 </li><li>春のはさみで心から離れてトリミングすることにより、氷上で倍率で心からの任意の潜在心房組織を解剖。均一なサイズの小さな断片に心室をみじん切りに。 ＃5ピンセットで皿からの分離された非心室組織を削除します。 </li><li>ピペットで滅菌マイクロ撹拌棒が含まれている小型の滅菌バイアル中に組織片を転送するために必要とされるようCBFHHソリューションの多くを。 </li><li>組織がバイアルの底に沈殿し、CBFHH溶液を除去することができます。 </li><li> CBFHH中の酵素液1.75 mg / mlでトリプシン、20 / mlのDNアーゼIIの50ミリリットルを構成しています。ピペットで5この酵素溶液のmlおよび磁気撹拌機でミンチ心室組織と場所を含むチューブに追加します。 8分間室温で一定速度（340 rpm）で攪拌します。 注：攪拌作用が穏やかな、まだ許可する必要がありますスラリーの懸濁のため。 </li><li>撹拌プレートからバイアルを取り外し、スラリーを3分間沈降することを可能にします。ピペットと、それは主に血液細胞および組織破片が含まれて、最初のダイジェスト上清を廃棄します。 </li><li>ピペット第5ミリリットルの酵素溶液のアリコートと消化心室に追加します。 8分間撹拌し、それが他の3分間沈降することを可能にします。ダイジェストを開始する前に、2 50mlチューブ（1を標識し、2）をそれぞれ含む12ミリリットルの氷冷ウシ胎児血清（FBS）を準備します。各チューブの上に40μmのセルストレーナーを配置します。ピペットでチューブ1上のフィルターを通してこの上清。 </li><li> FBSを含む2つのチューブの間ダイジェスト上清の配置を交互に、消化プロセスをさらに8回繰り返します。各チューブに等しい体積を確保するため、チューブ1と2の間で均等に最後の上清を分割します。 注：各コレクションチューブは現在、細胞懸濁液の32.5ミリリットル総容量が含まれています。 </li><li>遠心管が含まれています4℃で6分間、上澄み150 XGをる。 </li><li>消化アリコートを収集しながら、（10％FBS、1×ペニシリン - ストレプトマイシン、1×L-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））メディアの6ミリリットルで5 100ミリメートル組織培養プレートを準備プレート当たり。培地を平衡化するために30分間、37℃、5％CO 2で、これらのアリコートをインキュベートします。 </li><li>両方のコレクションチューブからの細胞を組み合わせ、CBFHH酵素混合物を吸引し、上記で調製した培地を30mlに細胞を再懸濁。 </li><li> 100mMのプレートの各細胞懸濁液を6mlを戻し、37℃で45分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーションの終わりに、5つの新しい皿に非接着細胞を転送し（線維芽細胞画分は、皿に付着し始めているであろうと、所望であれば別々に成長させることができる）45分間再度インキュベートします。 </li><li>めっき前の第二ラウンドの終了時に、皿から培地および非接着細胞を収集し、150で媒体を回転6分間XG。 </li><li> （灌流液100μlのコンストラクトあたり4.0×10 5細胞）を、おおよその所望の濃度に細胞をもたらすために余分なメディアをオフに描画します。計数およびまたは生存能力試験の14のためのアリコートを削除します。 </li></ol> P3ハートマトリックスの6バイオリアクター再細胞化<ol><li>一晩細胞を添加する前に、培養培地（ステップ5.15参照）で単離された心臓マトリックスを前処理。 </li><li> 図に示すようにランゲンドルフシステムの要素を組み立てます。 2。ガラス部品とエチレンオキシドをオートクレーブ滅菌性を保証するために、プラスチック部品を滅菌します。システムの種々のサブユニットは、支持台上に載置される前に、層流フード内で組み立てることができます。循環水浴加熱水流路は、明確にするために省略されています。 </li><li> （ステップ5.15参照）を組織培養培地120mlで組み立てシステムを埋めます。 </li><li> 60ミリメートルのCULのステップ2.14からカテーテルを挿入し、心臓の行列を配置トゥーレ倍率下皿とカテーテルへのステップ5.20から細胞懸濁液をロード×1針22 Gで1 mlシリンジを接続します。このアセンブリは、心臓塞栓避けるために気泡がないことを確認してください。 </li><li>穏やかに冠状動脈を介して心臓マトリックスに100μlの細胞懸濁液を灌流。完了すると、注射器/針の組み合わせを切り離します。 注：約の遅い灌流。毎分20μlのは、心臓を通過、静脈から流出するから細胞を防止するために必要とされます。 </li><li>バイオリアクター心臓瓶のふたの下側のルアーフィッティングに固定さ22グラム鈍いスタブと、スタブ上にカテーテルを押してください。 </li><li>蠕動ポンプを起動し、 図2に概説されるように進むことを確認します。貯水池からの移行をステップ2.5で大動脈内に配置されたカテーテル（ 図2の赤いパス）に気泡トラップを介して、ポンプを介して。静脈から心臓循環の流れを観察します頂点からsおよびドリップ、メディアリザーバーに再循環。 注：灌流流量は、このような構築物の血管抵抗、および心臓の大きさのような個々の要因に依存するが、50μL/分〜100の割合は、良い出発点です。中間の時点で、機能的な評価を行うことができます。新生児の再細胞化心臓のサイズスケールを行うことができますが、我々は、光学ベースのシステムは、彼らが大人のラット心臓で使用されてきたと同じように行動を破って定量化するために使用することができることを決定した評価を、制限されています。4構築物は、拡張のために灌流することができます（23時間まで）期間。 </li></ol>

<ol>
	<li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation:+Thirty-second+official+adult+lung+and+heart-lung+transplantation+report--2015.">Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015.</a> J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).</li><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update:+A+report+from+the+american+heart+association.">Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li><li>Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+regeneration:+current+progress+and+recent+results.">Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results.</a> Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularized+matrix:+Using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Porrello, E. R., Olson, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neonatal+blueprint+for+cardiac+regeneration.">A neonatal blueprint for cardiac regeneration.</a> Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Polizzotti, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin+stimulation+of+cardiomyocyte+regeneration+in+mice+and+human+myocardium+reveals+a+therapeutic+window.">Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window.</a> Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).</li><li>Jesty, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-kit++precursors+support+postinfarction+myogenesis+in+the+neonatal,+but+not+adult,+heart.">c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).</li><li>Ambrosy, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Health+and+Economic+Burden+of+Hospitalizations+for+Heart+Failure:+Lessons+Learned+From+Hospitalized+Heart+Failure+Registries.">The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries.</a> J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).</li><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary:+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2012+Update+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).</li><li>Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration:+epicardial+mediated+repair.">Cardiac regeneration: epicardial mediated repair.</a> Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).</li><li>Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+Digested+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Cardiomyocyte+Proliferation+In+Vitro.">Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro.</a> Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).</li><li>Borg, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+extracellular+matrix+components+by+neonatal+and+adult+cardiac+myocytes.">Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes.</a> Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).</li><li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials.">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li><li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization:+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities.">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).</li><li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+decellularized+mouse+heart+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+progenitor+cells.">Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells.</a> Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

心の繰り返し灌流にこの技術の依存性は、塞栓症の回避成功した結果の重要な要素になります。ステップ2.2から2.6での心臓の初期カテーテル法からは、ステップ2.8から2.14の間の溶液の変化に、心筋に灌流液の流れを損なう気泡の導入を可能にすることができる操作があります。新生児心臓の小柄なサイズに、血管系であっても微小な気泡は、このように不完全な脱細胞化をレンダリング、技術的な梗塞を引き起こす可能性があります。さらに、後の洗浄工程において、不完全な灌流は、洗剤残留物に悪影響を与える生体適合性をもたらすことができます。これはまた、気泡形成の源とすることができるように変更して溶液からガス移動を溶解したときさらに、このようなステップ2.14において示唆されるように4℃の貯蔵からマトリックスを除去するときのように急激な温度変化は、注意して接近されるべきです温度インチW再細胞化に鶏進む細胞懸濁液を注射器を準備する際、追加のケアは、注入が無気泡（ステップ6.4）であることを確認するために、適用されるべきです。 他の組織タイプに対応するために、このプロトコルの詳細を操作する必要があるかもしれません。ガイダンスを提供することができ4,9,11を報告した脱細胞化プロトコルの数があります。残存DNAにより例示されるように任意の脱細胞化プロトコルの最終目標（複数可）は、ECMタンパク質の構造の維持および関連生化学、およびネイティブの細胞成分を十分に除去することを含むべきです。この設定では、過度の灌流圧の適用は、組織学的に可視化することができるECMの微細構造の破壊をもたらします。 P3マウスの心臓の大きさは、成人組織と比較して細胞投与にいくつかの制約を置きます。大人の心は貫充血を作る厚い十分な心室壁を提示しながら、ナ可能な細胞送達様式は、P3の心臓は、細胞懸濁液を溶解しませんその大きさの針は、心臓にかなりのダメージを与えることは十分に小さいです。灌流は、実行可能なデリバリー戦略ですが、効果的に配信されるように一定の大きさと形状の細胞に依存します。新生児マウスの筋細胞は、この点でうまく機能します。他の小円形細胞も、この目的11を提供するために示されています。これらの心のサイズスケールは、このような圧力ボリュームカテーテルなどの従来の生理学的機能分析の使用を排除します。ビデオキャプチャに基づく他のアプローチを考慮しなければならないことがあります。 これらのデータは、新生児マウスの心臓の脱細胞化および再細胞化の実現可能性をサポートしています。以前の研究では、脱細胞化/再細胞化の研究を目的とした大人の心を使用することを実証しました。これらの大人の心から生産行列は、新生児心筋4と人間との再増殖されてきました人工多能性幹細胞（hiPSCs）17。 hiPSCsの場合には、再増殖した心臓は、NANOG、SOX2、およびOCT4および形成された筋状の構造などの多能性マーカーの減少を表示しました。成熟のすべての示唆に富みます。 ECMの細胞外の合図は、しかしながら、再生能力を保有することが知られている組織からの行列を生成しようとするために、私たちを促し、細胞、組織、および器官の発達に重要な役割を果たすことが示されています。我々の研究では、我々は再細胞化心臓はまだであっても長期培養した後、心筋細胞マーカーを発現することを示しています。これらのデータは、新規の行列を用いて、心筋細胞は心筋細胞としてのアイデンティティを失うことなく長期間維持することができる、ことを示しています。我々のデータは、新生児マウスの心臓を脱細胞化するための技術と可能性をサポートしています。新生児の行列が再増殖研究のためだけでなく、SUPを持つゲルの製造のための新規構築物を提供するための可能性を秘めてerior再生能力。これらの新生児のECMを使用して、我々は今hiPSCs含む細胞型の様々な機能的組織を形成するために、これらの足場の優位性に対処しています。

心不全は一般的で致命的です。これは、臓器への血流を阻害し、身体満たされていないの代謝要求を残す心臓の収縮低下をもたらす進行性疾患です。 570万人のアメリカ人が心不全を有し、それは米国9における入院の主要な原因であると推定されます。米国における心不全の患者を治療するための集団的コストは年間9-10につき$ 300億ドルを超えました。末期の心不全のための唯一の決定的な治療法は、同所心臓移植です。毎年、10万人以上のドナーの心臓は、米国1-2で心臓移植の手続きのために必要とされていると推定されています。ドナーの限られた数に、わずか約2400移植は、米国2で毎年行われています。明らかに、この臓器不足は、他の戦略がtransplantaための付加的な臓器を産生するために必要とされるように対処する必要があります拒絶反応や生涯免疫抑制に関連する合併症を回避するようションとは、理想的には、これらの器官は、自己のだろう。 哺乳類の成体の心筋細胞は、損傷時に限られた再生能力を実証するが、最近の証拠は、哺乳動物の新生児の心がけが5-8以下の驚くべき再生能力を維持することを示唆しています。具体的には、部分的な外科的切除後、再生ウィンドウが誕生し、生後7日目、この回生期間は線維性瘢痕の欠如によって特徴づけられる、血管新生の形成、心外膜からの血管新生因子の放出、および心筋細胞の増殖5-8との間で発見されました、11。この時間の回生ウィンドウには、バイオ人工心臓の開発のための材料の新規供給源としての新生児の心臓を使用しての可能性を提供します。 細胞外マトリックスはcardiomyocytを促進する重要な手がかりを提供することが知られていますEの増殖と成長。新生児と成人の行列12および再生を促進する能力において分子の利用可能性の明確な違いは、13を検討されています。脱細胞化された成人のマトリックスは、細胞の再増殖およびバイオ人工心臓の発生のためのECMの足場を提供するために、いくつかの研究で使用されてきました。これらの研究、および幹細胞技術の新たな発見は、急速に進展しているが、いくつかのハードルが満たされていません。例えば、マトリックスの天然構造、マトリックス壁への細胞の統合、およびすべての制限このアプローチの成功増殖と成長をサポートする能力を維持するには限界。優れた再生属性は新生児心臓に帰されてきたが、そのような組織を使用して実用的な側面は、その探索を制限しています。 新生児の心臓の実証された再生能力に基づいて、我々は、開発することによって、新たな行列を開発しましたP3のマウスの心臓のための脱細胞化の手法。以前は6に決定するが、心臓が収穫、脱細胞化および再細胞化に十分な大きさであるとして、それは心臓再生のウィンドウ内にあるようP3の心はこれらの研究のために選択しました。本研究の目的は、新生児マウスの心臓から行列を作成することの実現可能性を実証することです。我々の研究は、ECMの構造とタンパク質性の整合性を維持しながら、分、新生児の心臓を脱細胞化の実現可能性のための証拠を提供します。また、mCherryを発現する心筋細胞でこの心臓ECMを再細胞化する能力を示す、我々は再細胞化後の種々の心臓マーカーの発現のために、これらの心筋細胞を検討しました。この技術は、バイオ人工心臓の開発のための新生児の行列の優位性のテストのためにできるようになります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">1. Materials For Mouse Heart Isolation</td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>21577</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm Culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Single Use Blade</td>
			<td>Stanley</td>
			<td>28-510</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Scissors</td>
			<td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td>
			<td>14381-43</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors 10 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Forceps</td>
			<td>Dumnot (Fine Science Tools)</td>
			<td>11295-00</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Materials For Decellularization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inlet adaptor</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1013</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Septum</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-3022-99</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing</td>
			<td>Cole-Parmer&#160;</td>
			<td>EW-06422-10</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Male luer to 1/8&#34; hose barb adaptor</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K33</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female luer to 1/8&#34; hose barb adaptor</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K26</td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolene 7-0 surgical suture&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8648G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring stand</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47807</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-6Q</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp regular holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-754Q</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 cc syringe barrel&#160;</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>1186000777T</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beaker</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>14000250</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">22g x 1 Syringe Needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 cc syringe&#160;</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>8881512878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stop cock&#160;&#160;</td>
			<td>Smith Medical&#160;</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22 x 1 g needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE50 tubing&#160;</td>
			<td>BD Clay Adams Intramedic</td>
			<td>427411</td>
			<td>Must be formable by heat. Polyethylene recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% SDS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525-017</td>
			<td>Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sterile dH2O</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30538.02</td>
			<td>Or MilliQ system purified water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Corning CellGro</td>
			<td>30-001-Cl</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3. Materials For DNA Quantitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1700</td>
			<td>&#62;30U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl*6H2O</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5958-04</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris base/hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503/T5941</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pico-Green dsDNA assay kit</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>P7589</td>
			<td>requires fluorimeter to read</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4. Method for fixation and sectioning of tissue.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin Type A from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>must be 300 bloom or greater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5. Method for tissue histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryomolds 10 x 10 x 5mm</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4565</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Hacker/Bright</td>
			<td>Model OTF</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-19</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin 560&#160;</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3801570</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Define</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3803590</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue buffer&#160;</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3802915</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcoholic Eosin Y 515&#160;</td>
			<td>Surgipath/Leica Selectech&#160;</td>
			<td>3801615</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formula 83 Xylene substitute&#160;</td>
			<td>CBG Biotech&#160;</td>
			<td>CH0104B</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Permount Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical&#160;</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen IV Antibody</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-106.1</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Actinin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB9465</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mCherry Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB205402</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.5 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-8697</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-mouse AF488 Antibody</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>&#160;A21202&#160;</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-chicken AF594 Antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>703-585-155&#160;</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-goat CY5 Antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>111-587-003&#160;</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS (Ca, Mg Free)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30031.02</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Corning CellGro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primeria 100 mm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353803</td>
			<td>Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Difco</td>
			<td>215240</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8764</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (Delbecco&#39;s Minimal Essential Media)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V6629</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin coated plates&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heart bioreactor glassware</td>
			<td>Radnoti Glass Technology</td>
			<td>120101BEZ</td>
			<td>Must be sterilizable by autoclaving or gas.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal cardiac scaffolds: novel matrices for regenerative studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

脱細胞化 平均して、このプロトコルを使用して、P3の心臓の脱細胞化までの時間は約14時間です。 P3の新生児用23mgの平均心重量与えられました。 Acellularity 図3aは、完全に無傷でP3新生児の心臓（全体のマウント）を示している。 図3bは、脱細胞化以下同じ心を示している。 図4aおよび図4bショー無傷で脱細胞化心臓のヘマトキシリンおよびエオシン染色を、それぞれ。ヘマトキシリン陽性核の不在と脱細胞化心臓における好酸球構造の減少に注意してください。また、脱細胞化心臓のDNA含有量を大幅に無傷の心臓（n = 6）が脱細胞化心臓における4.73±2.27μgのにで68.08±2.25μgのから減少した（n = 5）。 コラーゲン免疫反応性 脱細胞化以下の細胞外マトリックス（ECM）の維持は、外因性細胞とマトリックスの機能を再増殖することが不可欠です。無傷で脱細胞化ECMにおける新生児のECMのコンテンツを評価するために、コラーゲンIVための免疫染色を行った。 図4Cを、そのコラーゲンIVはロバスト両方無傷および脱細胞化心臓で発現し、このタンパク質の局在化が維持されることを実証しているdは DAPI陽性の核が効果的に除去しながら、細胞除去後（ 図4E-H）。 DNA量 DNAの存在は、細胞性のさらなる指標として使用されます。 図5において、DNAは、界面活性剤ベースの脱細胞化を以下の新生児の心の中で93％減少することが実証されています。 DNAの減少のこの程度は、と一致しています他の組織15-16で洗剤ベースの脱細胞化を使用して文献の報告。 再細胞化 我々は、再細胞化心臓内の様々な心筋細胞マーカーの発現を決定するために免疫組織化学を行った。 図6は 、左心室（ 図6Aおよび6B）の壁に移動した細胞を示している。 図6Cは、再細胞化心臓のDAPI標識を示している。 図6D-Gは、それぞれNKX 2.5、mCherryを、αアクチニンとDAPI、に対して陽性である細胞を示しています。 NKX2.5は、αアクチニンは、分化心筋細胞をマークサルコメア蛋白質であるのに対し、心臓前駆細胞を標識することが知られています。これらの細胞は心筋細胞マーカーのEVを発現し続けることを示す。（ 図6Hピンク）当社は、これらのマーカーの全てを発現する細胞の大部分を観察していますアン灌流の23日後。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig1.jpg" /> 脱細胞化のハードウェア。Aの図1の回路図 。洗剤溶液のための60ccのシリンジバレル槽。B。灌漑注射器などの詳細。Cとのカテーテルアセンブリ。描かれたPEチューブ、カテーテル先端の詳細。D。ドレインと脱細胞化室および隔壁。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig2.jpg" /> 図2.心臓バイオリアクターの模式図。1。カルボゲンガスの加湿（緑の線は、ガス流を表します）。メディア灌流のため2.蠕動ポンプ駆動と酸素（紫色線は人工肺を介してメディアフローを表します）。 3.薄い壁の人工肺。 4.シート人工肺とメディア貯水池。 5.プリロード室と気泡トラップ。 6.ハート室（レッドラインは心臓へとからメディアフローを表す）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig3.jpg" /> 図3. P3新生児マウスの心臓のホールマウント（A）の前及び脱細胞化（B）。この心臓を灌流（B）後の心臓が半透明になるという方法2注記に記載されているようにランゲンドルフ灌流法を用いて、脱細胞化し、わずかに拡大された後、 。スケール= 2ミリメートル。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <pキープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;：FOクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig4.jpg" /> 天然および脱細胞化P3新生児マウスの心臓の図4.組織学。クライオスタット部（10μm）をH＆E（A、B）、コラーゲンIV（C、D、G、H）およびDAPI（E、F、G、Hを用いて染色しました。 ）。天然の心臓（A）と比較した場合、マージされた画像はGで表され、H. H＆E染色は、脱細胞化組織（B）における細胞核と細胞質が存在しないことを示しています。コラーゲンIV含有量は、次の脱細胞化（D）、DAPI染色（核のマーカー）のまま廃止されています。マージされた画像は、ナイーブ心臓（G）におけるコラーゲンIVおよびDAPIの共局在化および脱細胞化心臓（H）で、この共局在が存在しないことを実証します。これらのデータは、細胞が無いことを示しています<html>長い心のコラーゲンマトリックスを移入します。スケール= 500ミクロン。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54459/54459fig5.jpg" /> DNA量の図5の評価。コントロール（N = 6）および脱細胞化（n = 5）をピコグリーン法によりDNA含量についてアッセイした心臓。定量化は、標準偏差±心あたりμgのDNAとして表現しました。アスタリスクは、対照と比較してp &lt;0.01を示しています。これらのデータは、脱細胞化がP3新生児の心に大幅にDNA含有量を減少させることを示す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> OAD / 54459 / 54459fig6.jpg &quot;/&gt; P3の心臓マトリックスの図6.組織学P1 mCherryを発現する心筋細胞で再細胞化。H＆Eで染色した（A、= 250ミクロンスケール、B、スケール= 50ミクロン）、DAPI（= 250μmのC、スケール）は、 次の23日間 、NKX 2.5、 mCherryを、αアクチニン、DAPI、およびマージ（D、E、F、G、H、スケール=50μM）。私たちは、P1の心筋細胞（AC）とコラーゲンマトリックスの効果的な再増殖を示しました。さらに、当社は、m桜陽性の心筋細胞がコラーゲンマトリックスへの導入以下のNkx2.5およびαアクチニン23日を発現することを観察しました。これらのデータは、これらの細胞は、長期間にわたってそれらの心筋細胞のアイデンティティを維持することを示している。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54459/54459fig6large.jpg" target="_blank">このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>igure。

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies at JoVE.com

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

これらの研究では、我々は、回生の研究で使用するための新規、新生児マウスの心臓足場のための方法論を提供します。

新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

neonatal-cardiac-scaffolds-novel-matrices-for-regenerative-studies

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K ビュー.  University of Minnesota. これらの研究では、我々は、回生の研究で使用するための新規、新生児マウスの心臓足場のための方法論を提供します。 

ビデオ: Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

生物工学

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

動脈組織工学におけるエラストマーのPGSの足場

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

回生研究ハーモニックナノ粒子

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

Here we present a fluorophore based imaging technique to detect cell viability on a non-transparent titanium scaffold as well as to detect glimpses of the scaffold impurities. This protocol troubleshoots the drawback of imaging cell-cell or cell-metal interactions on non-transparent scaffolds.

非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff practice clinical interventions such as chest compressions to ensure patient survival in the case of bradycardia or cardiac arrest. The simulators used currently are of low physical fidelity and therefore cannot provide qualitative insight into the procedure of chest compressions. The embedding of an anatomically realistic heart model in future simulators enables the detection of cardiac output generated during chest compressions; this can provide clinicians with an output parameter, which can deepen the understanding of the effect of the compressions in relation to the amount of blood flow generated. Before this monitoring can be achieved, an anatomically realistic heart model must be created containing: two atria, two ventricles, four heart valves, pulmonary veins and arteries, and systemic veins and arteries. This protocol describes the procedure for creating such a functional artificial neonatal heart model by utilizing a combination of magnetic resonance imaging (MRI), 3D printing, and casting in the form of cold injection molding. Using this method with flexible 3D printed inner molds in the injection molding process, an anatomically realistic heart model can be obtained.

This protocol describes a procedure for creating functional artificial neonatal heart models by utilizing a combination of magnetic resonance imaging, 3D printing, and injection molding. The purpose of these models is for integration into the next generation of neonatal patient simulators and as a tool for physiological and anatomical studies.

新生児患者シミュレータでの解剖学的に現実的な新生児心臓モデル

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

3 D プリントのための新規プロセス脱行列

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...