This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB：哺乳動物細胞培養のために必要に応じて、以下のステップの各々は、層流フード内で無菌条件下で実施すべきです。また、最適な滅菌細胞培養のための一般的なガイドラインは、適用例 、ヒントいつでも彼らは、交差汚染につながる時間細胞の量を減らすことができるの破棄正しく、メディア全体の変更を行うことなく、静かにすべての攪拌時に空気にさらされていますその均質なピペッティングなどを確保するために細胞懸濁液はまた、インサートは特別な処理を必要とするプラスチック製品の一種です。インサートが操作されたときにまず、簡単に涙ため、実験を危険にさらす可能性が脆弱な膜を、触れないように注意してください。膜を穿孔または接着細胞を解離の危険性があるとしても、細胞培養培地の真空吸引を行うためには適していません。次に、インサートは、マルチウェル組織培養プレートに緩くハングし、したがって、注意が時カ月使用しなければなりませんプラスチック製品をヴィングまたは接着細胞を解離避けるためにピペッティングするとき。大細孔サイズのインサートを使用する場合に加えて、細胞培養培地は、したがって、しばしば液体のレベルを監視することが重要であり、膜を通って浸透し、可能性があります。最後に、以下のプロトコルは、接着細胞用に設計されており、浮遊細胞に適したものにするために若干の変更を必要としていることに注意してください。 インサート共培養実験を行うための1.一般的なガイドライン<ol><li>挿入中の播種細胞型の第1位<ol><li>その梱包からの挿入をアンラップ。 </li><li>適切な大きさの空のマルチウェル組織培養プレートにインサートを配置します。これを行うには、グリップピンセットを用いて、インサートの最上端を。 </li><li>付着細胞の付着及び拡散を向上させるために、播種前に細胞培養培地でインサートを条件付けます。そうするために、細胞培養mediu有する膜の表面全体を覆​​いますマイクロピペットを用いてメートル。 注：必要な数の挿入のためにこれを行います。 </li><li>プレートに蓋を交換し、同じ条件下で、少なくとも1時間またはO / Nインキュベート（通常37℃、5〜10％CO 2）。 </li><li>インサートが調整されるときに、マイクロピペットを用いて細胞培養培地の全てを除去します。使用した培地を捨てます。 </li><li>マルチウェルプレートと同様に、新鮮な細胞培養培地中の種子の細胞型＃1。そうするために、マイクロピペットを用いて細胞懸濁液の適切な量を描き、インサート中の液体を分注します。 注：必要な数の挿入を準備します。 </li><li>すべての挿入を播種した後、静かに細胞を均一に分配するために、次に前後に、左右のプレートを揺らし。これは、細胞がインサートの中心部に蓄積する原因となりますよう、円運動を行わないでください。 </li><li>携帯要件（通常37℃、5〜10％CO通りで指定された板の上に蓋を置き、インキュベート<sub&gt;の2）。 </li></ol></li><li>マルチウェル組織培養プレート中に播種細胞型＃2 <ol><li>項1に記載の新鮮な細胞培養培地中の種の細胞型＃2。 </li><li>挿入の数のために必要な数のウェルを準備します。細胞が均等にウェル中に分布していることを確実にするために）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li>プレートに蓋を置き、同じ条件下でインキュベートする（通常37℃、5〜10％CO 2）。 </li></ol></li><li>インサートで爽やかミディアム<ol><li>マイクロピペットを用いて、細胞型の＃1を含むインサートで、一部または細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。 </li><li>新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ゆっくりインサートの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。 </li><li>プレートに蓋を置き、ステップ1.1.4に従ってインキュベートします。 </li></ol></li><li>マルチウェル組織培養プレート中でさわやかなミディアム<ol><li> micropiを使用しましたpette、一部または細胞型の＃2を含むウェルにおける細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。 </li><li>新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ウェルの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。 </li><li>プレートに蓋を置き、以前に確立された細胞培養プロトコルに従ってインキュベートします。 </li></ol></li><li>細胞型＃2を含むマルチウェル組織培養プレートに細胞タイプ＃1を含むインサートを移します。 注：両方の細胞型は、適切な成長段階に達したときに、この手順を実行します。 <ol><li> ）をウェルへの挿入を転送する前に、以前の手順で説明するように、任意の必要なメディアの変更を行う1.3）と1.4。 注：この時点で、それはインサートメーカーの指示によって指定された両方の区画内のメディアの適切な量を分注することが重要です。 </li><li>グリップ、セルTを含むインサートの最端をピンセットを用いてYPE＃1と優しくウェル細胞型＃2を含む適切なに配置します。 </li><li>すべての挿入を転送した後、インサートの膜の下に気泡が存在するかどうかを確認。 注：気泡がインサートの膜を横切る任意の交換を防止し、実験全体を危険にさらすことができます。 </li><li>気泡が存在する場合、非常に穏やかによく使用ピンセットからインサートを持ち上げて、細胞培養培地に戻って突入。気泡が消えます。彼らはまだ存在している場合は、角度でバック細胞培養培地への挿入を浸漬優しくしてみてください。 注：ノックや接着細胞を解離回避するために、インサートを攪拌しないでください。 </li><li>すべての気泡を除去し、両方の区画内のメディアのボリュームが、プレートに蓋を配置し、インキュベートすることを確認した後。 </li></ol></li><li>共培養系でリフレッシュメディア 注：この膜は容易にインサートとの間のメディアの交換を可能にし、よく、培地をリフレッシュすることで行われますが、拡散のみによって上下コンパートメントで平衡に達するのに要する時間が非常に長くすることができるので、両方の区画。 <ol><li>セルタイプの＃1を含むインサートで爽やか媒体はステップ1.3）と同様に行われます。 </li><li>セルタイプ＃2を含むウェル中の培地をリフレッシュするには、静かにピペットチップを収容するのに十分な広さのスペースを作成する側に挿入部をスライドさせます。 ）ステップ1.4のようにメディアを更新します。 </li><li> ）気泡の有無を確認し、1.5.5を介して手順1.5.3に従ってボリューム）を確認します。 </li></ol></li></ol> 2.例：神経PC12細胞にLPS活性化N9ミクログリアによって分泌されるサイトカインの効果を測定します注：以下の手順はよく特定のフラスコ、皿のサイズのために設計されています。しかし、このプロトコルは任意のプラスチック製品の寸法に合わせてカスタマイズすることができます。メディアや組成の材料表を参照してください。 <ol><li>マルチでのPC12細胞を播種し、差別化ウェル組織培養プレート<ol><li>暖かいルーチンPC12細胞培養培地、37℃の水浴中でPC12分化培地およびトリプシン-EDTA。 </li><li> 75cm 2のフラスコから60から80までパーセントコンフルエンスでPC12細胞を使用してください。 </li><li> 15 mmのパスツールピペットで、フラスコ中の全細胞培養培地の真空吸引を行います。 </li><li>静かに滅菌リン酸緩衝生理食塩水5mlで細胞単層を洗浄し、パスツールピペットで液体を除去します。この段階で細胞を解離しないように注意してください。 </li><li>トリプシンEDTA 3mlで細胞単層を覆い、37℃で2~3分間インキュベートします。 </li><li>すべての細胞が顕微鏡下で分離されることを確認してください。非常に少数の細胞が浮遊している場合は、5分間の最大のために長い期間インキュベートします。 </li><li>トリプシンEDTAを不活性化するために、ルーチンPC12細胞培養培地10mlを加えます。 </li><li>ほとんどの細胞は、O底から解離していることを確認しながら10ミリリットルピペットで、穏やかに粉砕しますフラスコF。細胞懸濁液中の気泡を作成しないでください。 </li><li>同じ10mLのピ​​ペットを用いて50mlの遠心管に細胞懸濁液を移します。 </li><li> 3200×gで1分間遠心操作</li><li>ペレットを乱さないように注意しながらパスツールピペットで上清を捨てます。 </li><li> 10ミリリットルピペットでルーチンPC12細胞培養培地の10ミリリットルを追加します。 注：ペレットが非常に小さい、または大きい場合には、この量を調整することができます。 </li><li>ペレットを均質化するために、同じ10ミリリットルピペットで粉砕します。 PC12細胞は、多くの場合、ピペッティング少なくとも20ので、一緒に凝集し、必要なdownare。 注：活発摩砕が必要であるが、細胞懸濁液中の気泡を作成しないように。 </li><li> 1.5mlチューブでは、トリパンブルー中の細胞懸濁液の適切な希釈を準備します。以前に確立されたプロトコール74に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>個別の50mlチューブに、細胞懸濁液を分割PC12分化培地で24ウェルプレートから（3万¢/ cm 2でよく、製造業者のプロトコルに従ってあたり0.6 ml）をウェルに播種するために希釈された細胞懸濁液を適切に得ることができます。 注：以前に確立されたプロトコル75で指定された24ウェルプレートは、以前に、コラーゲンでコーティングされている必要があります。 </li><li>よくマイクロピペットを用いて、あたりの細胞懸濁液0.6ミリリットルを配布します。 </li><li>全てのウェルを播種しているとき、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li> PC12細胞の適切な分化は、共培養実験を行う前に、PC12分化培地15,16の5％CO 2の湿潤雰囲気中で37℃で7-9日間、24ウェルプレートをインキュベートすることを可能にします。 </li><li>液体の半分を除去し、新鮮なPC12分化培地の等量それを置き換えることにより、一日おきに培地交換を行います。 </li></ol></li><li>インサートにN9ミクログリアを播種し、LPSで処理します<ol><li>一日の共培養実験を行う前に、1.1.4からステップ1.1.1）以下、細胞接着を最適化するためにルーチンN9細胞培養培地とPTFE0.4μmの細孔インサートを前処理） </li><li> 37℃の水浴中で暖かいルーチンN9細胞培養培地およびトリプシン-EDTA。 </li><li>一方、後で使用するために1.5mlチューブにLPSの約10mgの重量を量ります。 注：LPSが強力な炎症誘発性内毒素であり、特定の安全上の注意、メガネ、手袋、及び粒子状人工呼吸器を必要とするので、強く推奨されています。 </li><li> 75cm 2のフラスコから80〜90％のコンフルエンスでN9細胞を使用してください。 </li><li> ）2.1.14へのステップ2.1.3）に従います。常にルーチンN9細胞培養培地の代わりに、ルーチンのPC12細胞培養培地を使用します。また、N9ミクログリアが）ので、より少ないピペッティング上下がステップ2.1.13で必要になることがあり、一緒にPC12細胞がそうであるように同じくらいを凝集しないことに注意してください。 </li><li>個別の50mlチューブに、OにN9細胞培養培地で細胞懸濁液を分割24ウェルプレート中で保持するように設計されたインサート（60,000¢/ cm 2で、製造業者のプロトコルに従ってインサートあたりが0.05mL、膜表面積については、メーカーの情報を参照）を播種するための適切な希釈細胞懸濁液btain。 注：これらのインサートは、すでに製造者によって、コラーゲンでコーティングされており、細胞接着のために最適化されます。 </li><li>マイクロピペットを用いて、インサートあたりの細胞懸濁液の0.05ミリリットルを配布します。 </li><li>すべての挿入がシードされている場合、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li> 4μgの2 / mlの/ mlであり、1μgの/ mlの作業溶液を得るために、N9の処理媒体を用いて、LPSの連続希釈液を実行します。 </li><li>ピペットを2μg/ mlの最終希釈を得るために、インサートの1組で4 / mlのワーキング溶液0.05ミリリットル。 </li><li>それぞれを1μg/ mlおよび0.5μgの/ mLの最終希釈液を得た異なるセットのインサート内の他の2つの作業のソリューションのための手順を繰り返し2.2.10）。 </li><li>に共培養実験を行う前に、LPSとN9ミクログリアの活性化を可能にするために、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間のインサートを含有するプレートをcubate。 </li></ol></li><li> N9ミクログリアと神経PC12細胞を共培養します<ol><li> PC12細胞を分化の7-9日目に、37℃の水浴中で暖かいN9処理媒体とPC12の処理媒体によって、LPSとのインキュベーションの24時間後N9ミクログリアを活性化させます。 </li><li> N9の処理媒体の0.1ミリリットルによって全体の使用済み培地を交換し、ステップ1.3）のようにN9ミクログリアの総培地交換を行います。すべてのinsert.Thisのためにこれを行うインサートでのみアクティブN9ミクログリアを残して、LPSの痕跡をすべて削除する必要があります。 </li><li>ステップ1.4のように神経PC12細胞の総培地交換を行います）。ステップ1.5のように24ウェルプレートへの挿入を移し）、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間または48時間N9-PC12の共培養を.Incubate。 </li><li> 24後時間または48時間、細胞毒性、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、または他のアッセイのために上清および/または細胞を回収。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

任意の挿入共培養系の実験の最も重要なステップは、実際に使用するための適切な挿入を選択する際に宿ります。孔径及び膜材料が播種される細胞の種類および実験の目的を考慮し忘れることなく、十分な考慮しなければなりません。例えば、走化性アッセイは、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析するために細胞共培養物よりも膜の同じタイプを使用することができます。細胞遊走および細胞 - 細胞接触を防止するために、細胞遊走を可能にするために、前者のために大きいもの、後者のために小さいもの：しかし、実験の両方のタイプは、異なる孔サイズを必要とします。細胞間接触の不在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価するために、彼らはタンパク質のような大きな分子、を可能として、0.4ミクロンまたは3ミクロンの孔サイズは、通常は適切である、やってからほとんどの細胞を横切るが、防止しますそう。膜材料は、大部分の細胞型および細胞培養プロトコルの終了時に使用される技術に依存します。彼らは明確であるが、コラーゲンサポートは、治療するために必要な接着細胞のための問題になることができ、コーティングされていないように簡単に説明すると、PET膜は、良好な細胞の可視性を提供します。彼らはまた、良好な光学特性と一緒に、組織学的研究のために理想的、固定液に最高の耐薬品性を有しています。彼らは半透明であり、コラーゲンコーティングされていないとして、一方、PC膜は悪い細胞の可視性を提供します。しかし、それらは、細孔の最高密度および孔径の最も多様な利用可能性を有します。最後に、PTFE膜は、湿潤時にクリアされているだけのセルの可視化を顕微鏡で概説ことができます。主な利点として、彼らはまた少し厚めにそれらを作るコーティングされたコラーゲン、です。コラーゲンとPET又はPC膜インサートをコーティングする孔を妨げる可溶性事実上の通過を妨げることができることに留意することが重要なことですRS。いずれにせよ、ほとんどのインサートの製造業者は、適切なインサートを選択する研究者を支援するための総合的なガイドを提供します。私たちの具体的なパラダイムでは、播種密度、メディア、血清中濃度、分化の日、LPS活性化の日、LPSの濃度、およびPC12細胞用フラスコのコーティングの選択肢は、これらの共培養系15での作業の長年にわたって最適化されてきました、16。注目すべきは、挿入中N9ミクログリアの播種密度は、それらの活性化の際に乗算するために彼らにスペースを与えるために、このように、共培養を開始し、の瞬間に百分の40から50コンフルエンスを得るために、60,000¢/ cm 2に選ばれましたLPSによります。最適化された他の条件はまた、天然のPC12の維持のために意図されたフラスコ中で、L-リジンによるコラーゲンに置き換えとして満足な結果をもたらすことができます。 結果の持続性を高めるために、いくつかの異なるコントロールを行うことができます。その可溶性因子を証明しようとすると、直接細胞 - 細胞接触および馴化培地実験を発現混合培養を並行して観察された効果の原因で行われるべきであるています。また、特定の分泌された因子を中和する抗体を利用することは、知覚されるパラクリン効果に関与する分子を同定するのに役立つだろう。可能な場合は、活性化される受容体の正確な身元を特定する受容体またはそのシグナル伝達経路の一部を遮断。分子は、例えば、前述の例のように第二の細胞型と共培養実験の前に一つの細胞集団を活性化するために使用されている場合、それを考慮にシステム内の分子の存在を取ることが重要です。最初のオプションとして、媒体が完全に分子が完全にシステムに存在しないことを確実にするために、共培養実験の前に変更する必要があります。単独の分子がするために、第2の細胞型とインキュベートされる第二の選択肢としては、条件を追加する必要があります第1の細胞型の非存在下でその効果を評価します。第二の細胞型の分子の効果がない場合には、共培養実験の前に、培地を変更する必要はないであろう。両方の細胞型が同一の細胞培養培地中で増殖されていない場合は同様に、同様の注意が培地組成の違いは、1つまたは他の細胞集団に影響を与えないことを確認するために注意しなければなりません。両方のメディアが最初にインサート膜によって分離されるが、拡散は、それらが長いインキュベーション期間にわたって混合することを確実にするためにバインドされています。また、いくつかの問題は、可溶性因子受容体との関係の異常な混乱から生じ得ます。エラーのいくつかの原因の中でも、酵素的解離の過度の使用および血清の重要な濃度の存在は、細胞表面受容体を妨害し得ます。インサート共培養システムにおけるエラーの他の原因としては、1に限定されない）は、細胞の全体を除去するように不適切な細胞培養技術2）インサートメンブレンを密封し、下部コンパートメントに到達するために先端で、分泌された分子を防止するための責任を挿入すぎるコンフルエントである単層、および3）誤調整細胞を乾燥させると同時に、あまりにも多くのウェル中の培地、生理学的に関連性の低い結果または任意の効果の欠如につながる可溶性因子の過剰または過小発現を引き起こす細胞コンフルエンス、。 インサート共培養の一方のみシナリオがここに提示されたが、この非常に多目的な技術を利用する多数の方法があります。ここでは、一つの細胞型は、ウェルに挿入物を移す際に、第二の細胞型の挙動に影響を与える可溶性因子の分泌を誘導する責任分子で前処理しました。不純な治療に、一方または両方の細胞集団の増加脆弱性または抵抗を検出するためにそれらを分離する前に、共培養系で一緒に両方の細胞型をインキュベートすることも可能です。ホーその最も基本的な形を考慮した場合weverは、この技術は、基礎パラクリン逆数シグナリングを評価する目的で、任意の処理をせずに一緒にインキュベートした細胞の2つの集団を利用することができます。 この技術の最も重要な制限は、このような活性酸素種とし ​​て非常に短命の分子実体は、上部コンパートメントと下部コンパートメント82内の1つに成長している細胞集団を分離する距離を生存しないということです。共培養技術における最近の開発は、マイクロ近接83で2つの細胞集団を維持することができる微細加工培養基材を使用することによって、この問題に回答しようとしました。そのような変更および双方向シグナリングの集団特異的検出のような挿入の共培養系の利点の全てを有することに加えて、この微細加工画面も可能Dの前にはなかった短距離相互作用の検出を行うことが実証されました距離で可溶性因子の崩壊に起因するetectable。この細胞培養プラットフォームは、細胞共培養中に最新の技術革新であると前に見落とされた細胞間の情報伝達メカニズム解明に役立つことを約束します。

in vitroでの組織、器官またはシステムの研究では、多細胞生物を構成するいくつかの細胞のサブタイプの間に存在する非常に複雑な関係を簡略化しようとする試みです。実際、in vitro研究により、単一の細胞集団の詳細な理解を獲得することを可能にします。 1）細胞間相互作用を低減し、かつ容易に細胞環境を操作する2）能力：二つの主要なインビトロ実験で行う利点があります。したがって、これらの2つの利点が、科学者は、生物全体に外因性の影響の結果を調節する能力をもたらす、 インビボで特定の細胞型の挙動を予測することができています。その意味で、in vitroでの細胞培養は、多くの場合、基礎および応用生命科学を結ぶブリッジとして動作します。それにもかかわらず、in vitroでの作業のいくつかの欠点もありますが、最も重要なのは、特定の予約は、生理的に住むことがされていること観察された表現型のアルの関連性。実際には、単一の細胞型は、容器内で成長させた場合、培養物は、様々な程度に、失う、他の細胞型、組織および起源の生物、およびアンカー内から体液環境への貢献との細胞間接続細胞機能のために、時には重要な特定の三次元構造を維持することを可能にし、組織。 細胞間の関係の問題は、混合培養技術の開発によって対処されてきました。この方法では、2つ以上の細胞集団は、同一の培養容器中で一緒に増殖させます。しかし、これらの混合培養物は、重要な不具合を負うものとします。一方で、いくつかの細胞サブタイプは、物理的起源の組織で互いに相互作用しないと分泌可溶性因子と近くの受容体によって持続的なパラクリン通信のみに依存しています。これは、近位のサイトカインシグナル伝達に依存するいくつかの炎症過程の場合です。混合Cでultures、物理的な相互作用は不可避であり、それが不可能変更された結果を得ることができ、細胞 - 細胞接触の不在下でパラクリン通信を研究することを可能にします。一方、混合集団内の細胞特異的な解釈を達成することはかなりの結果に影響を与える可能性があり、過酷な分離技術を使用せずに実現不可能となります。 これらの重要な問題を解決するために、馴化培地の使用は、区画の文化とパラクリンシグナル伝達の研究を可能にする技術として開発されてきました。この方法は、細胞の他の集団を含むウェルに、従って培地馴化名前、一つの細胞型の上清の転送を必要とします。しかし、重要な欠点は短命分子が​​細胞の第二集団のウェルに転送する馴化培地中で十分に長く生存しないということです。でも寿命の長い分子が大きく拡散による時間をかけて希釈されます。さらに、両方のセル集団は一方向のみパラクリン通信ではなく、アクティブな双方向通信に参加しています。これは、 生体内に存在したように正確な多の関係を再作成に不可欠であるフィードバックシグナル伝達の欠如につながります。 結果として、より良いインビトロ細胞環境におけるインビボ条件で原稿をシミュレートする必要性によって駆動される、細胞培養技術におけるいくつかの進歩が長年にわたって達成されました。最も重要な進歩の一つは、1953年にGrobsteinによって初めて使用される細胞培養物を区画化するための微多孔膜と通気性支持体の使用であった1。このような透過性の支持体は、多数の細胞型に対応するために、使用することが長年にわたって調整されています複数の異なるアプリケーションインチ今日では、これらの支持体は、マルチウェル組織培養プレートまたはcircuのウェルに載るように設計されているように、中空のインサートを存在しますLAR料理。ウェルまたはディッシュが自分の体液性の環境（ 図1）上の細胞の二つの異なる集団の寄与を研究することができ、他の細胞集団が含まれているのに対し、共培養系では、インサートは、1セルタイプが含まれています。その結果、（頂端分泌または信号受信対側底）の細胞極性は、このように、インサート共培養システムを混合培養し、馴化培地技術より重要な利点を付与する、保存されています。膜材料のいくつかの種類は、ポリエステル（PET）、ポリカーボネート（PC）またはコラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が最も一般的なもので入手可能であり、それらは0.4ミクロンから12.0ミクロンの範囲の異なる細孔サイズで存在します。材料および細孔サイズのこれらの種類は、これらに限定されない使用し、以下のためのさまざまなレベルで、それらを実用的に光学特性、膜の厚さと細胞接着に関連する変数の機能を発揮するインサートのスペクトルを提供します。 -studying透過膜を介して、走化性アッセイによる細胞分化、胚発生、腫瘍転移および創傷修復。 透過性の支持体上で培養上皮細胞または内皮単層を通ってそれらの輸送​​を評価することによって、薬剤の浸透を-evaluating、と。 -performing細胞の共培養は、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析します。 この論文の目的は、インサート共培養系を用いて、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価することで、上述した第三の機能を果たすために、一般的な方法論のガイドラインを記述することです。研究のいくつかの異なるフィールドは、細胞の集団に分泌された可溶性因子の影響に関連した質問に答えるために、インサート共培養システムを利用します。実際、さまざまなレベルで細胞の挙動を調節パラクリンシグナル伝達は、全ての組織において適切ですインサート共培養システムを持つシステムでは、これらの分野の進歩を確保するために欠かせません。逆に、そのシグナル伝達を確認することができるインサートの使用は、直接細胞 - 細胞接触によってではなく、分泌された因子によるものです。インサートの最も重要な用途の一つは、炎症の研究分泌されるサイトカインの効果は、免疫の種々の細胞の選手で評価され2-14です。特に、中枢神経系（CNS）の炎症の研究は大きく、より良い神経炎症15-21を駆動におけるニューロンとミクログリアの明確なパラクリン役割を定義することができましたインサート共培養研究から利益を得ています。これらのシステムはまた、炎症誘発因子22〜26の分泌を低減または阻害する能力に依存している分子の抗炎症の可能性を研究するために考案されました。血管新生32-34のメカニズムとinflammati特に癌27-31に関連する研究、腫瘍形成における35-42に、また挿入共培養システムから利益を得ます。また、可溶性因子は、分化を駆動プロセスで最も重要であり、いくつかの研究は、その特定のフィールド43-50で質問に答えるためにインサートを使用しています。 CNSにおいて、神経組織は、非常に限られた再生能力を有しているように見て、neurotrophism及び神経保護の研究は基本的であり、広く共培養システム51-56における幹細胞の使用によって保証されています。また、インサートはまた、腎臓57,58、内皮相互作用及び血管新生59-62、63-65シグナル伝達、アポトーシス、肥満やメタボリックシンドローム22,23,66-67の炎症、内耳有毛細胞の保護といったさまざまな分野で利用されています68,69、さらには菌の病原性70,71と寄生虫72,73インチこの記事では、experimを設定するために一般的な方法論的なガイドラインを提供していますインサート共培養系を用いて、分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価した図で​​ENT。特に、我々は神経細胞の共培養し、神経炎症過程を研究する上でのそれらの使用上の注意を焦点を当てます。パイロットに可能に挿入された実験の非常に広大なスペクトルを考えると、この細胞培養技術のあらゆる側面をカバーするために耐え難いです。一例として、特定のプロトコルは、インサート共培養方法の具体的な理解を提供し、詳細に説明するリポ多糖（LPS）によって分泌されるサイトカインの効果は神経PC12細胞上N9ミクログリアを付活測定します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8755</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6421</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2040</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;">MultiCell</td>
			<td style="width:119px;">80350</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N0513</td>
			<td style="width:328px;">Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&#8211;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Lipopolysaccharides from&#160;Escherichia coli&#160;055:B5</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2880</td>
			<td style="width:328px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Cell culture inserts for use with 24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353095</td>
			<td style="width:328px;">0.4 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">TrueLine</td>
			<td style="width:119px;">TR5002</td>
			<td style="width:328px;">Coat with collagen before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Routine PC12 cell culture medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Routine N9 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 85% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 90% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 differentiation medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N9 treatment medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 50 ng/mL nerve growth factor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 treatment medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

インサート共培養システムの使用は、CNSの異なる細胞プレイヤー間パラクリン関係を披露神経炎症プロセスの研究に特に適切です。 CNSにおける免疫は彼らの安静分岐した状態（ 図2A）でその環境を監視し、検知乱れが可能であるミクログリアと呼ばれる常駐細胞によって主に達成される可能性がトラブルの適切な神経機能76-78のために必要な非常に貴重な恒常性。ミクログリアの活性化、アメーバ状の形状（ 図2B）の採用を特徴とした細胞集団の増殖は、サイトカインなどの炎症誘発性メディエーターの放出が続く、小膠細胞（ 図3）と呼ばれるが、神経炎症79の主側面を構成します。サイトカイン放出は、有害な攻撃に対してニューロンを保護する崇高な目的を果たすとCLOSですエリー監視しました。神経炎症は、この厳格な制御をエスケープするときしかし、それは破壊的な性質を採用し、真剣にCNSを傷つけることがあります。神経組織は非常に限られた再生能力を持っている限りは、CNSは、自動破壊的な炎症反応へのすべての影響を受けやすくなります。ニューロンとミクログリアの間に存在するクロストークを、研究することは神経炎症の発症機序の解明に不可欠です。混合培養物とは異なり、共培養システムは、毒性効果を生成していると、どちらが影響されている細胞集団を識別するために調査員を可能に挿入します。 ここでは、神経成長因子で7-9日間分化PC12細胞は、ニューロンの炎症由来の可溶性因子のquantifyingthe有害作用の目的でLPS活性化N9ミクログリアと共培養しました。 N9ミクログリアがインサートに播種しながらこれを行うために、神経PC12細胞を、24ウェルプレートで培養しました。 N9 microgliAは、LPS、グラム陰性菌の外膜に含まれる非常に強力な炎症誘発性内毒素で24時間処理しました。 LPSは、このように、不死化マウス細胞株N9ミクログリア80,81を含む免疫エフェクター細胞、多種多様で強固な炎症反応を誘発するToll様受容体4を活性化することが知られています。以下の代表的な結果は、LPSで活性化したN9ミクログリアは、その集団（ 図3）を大きくすると、インターロイキン6（IL-6）、インターフェロンγ（IFN-γ）とのような水溶性の炎症性サイトカインを分泌する傾向があることを示しています容易に共培養インサートの膜を通過し、下部コンパートメントに成長神経PC12細胞に対する細胞毒性損傷を引き起こし、腫瘍壊死因子α（TNF-α）。 神経PC12細胞を含むウェルにLPS活性化N9ミクログリアを転送する前に、一番の関心事は、股関節を確認することにありますPC12 tを適切に区別されています。 7日間分化したPC12細胞は、それ自体が静脈瘤（ 図4）を表示時には、いくつかの長い神経突起を投影する平坦細胞体、などの明白なニューロン表現型を示すべきです。このチェックポイントが実行されると、LPSの新鮮な培地を欠いを含むN9ミクログリアインサートは、分化PC12を含むウェルに移すことができます。 24時間または48時間のインキュベーション期間の後、下の区画で上清を回収し、細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出15,16、ならびにELISA 15に基づいて、サイトカインを測定するために行われます。実際に透過性膜を横断しており、それは、PC12細胞の表面上の受容体を活性化することができるサイトカインを測定するために、下の区画に上清を収穫することが重要です。結果は、上部コンパートメントからのLPS活性化N9のミクログリアは、用量および時間依存CYTを生成することを実証します下部コンパートメント（ 図5）に設定された分化した神経PC12細胞に対するotoxic効果。 0.5μgの/ mLのLPS条件は、しかし、大幅に24時間または48時間後に細胞毒性ではありません。細胞毒性のレベルを2μg/ mlのLPSで48時間の条件でほぼ100％に達することが判明しました。また、結果は、炎症性サイトカインIL-6、観察された細胞毒性と同時に上清が増加​​中のIFN-γおよびTNF-αの濃度。具体的には、IL-6濃度が有意にも大幅に48時間（ 図6）後のサイトカインのレベルを上げ利回りLPS1μg/ mlのに対し、わずか2 / mlの条件のための24時間後に増加しています。ミクログリアは、それらが1 / mlのおよび2μg/ mlので処理し、24時間または48時間（ 図7）のいずれかのための分化した神経PC12細胞とともにインキュベートされたときに有意に増加した様式で下部コンパートメントに到達するIFN-γを分泌します。 0.5 / mlのLPS条件は再び著しくIFN-γのレベルを増加させません。最後に、下側区画中のTNF-α濃度を、ELISAによって定量した、ほとんどの約7倍以上の重要な制御状態（ 図8）よりもレベルに達し、小膠細胞のLPS活性化により増強されることが見出されました。具体的には、両方の24時間および48時間のインキュベーション期間は、上清中のTNF-αレベルにおける重要な増加を引き起こしました。しかし、を1μg/ mlのLPSの条件は、48時間後のTNF-αレベルの有意な上昇をもたらしました。全体として、これらの結果は、分泌された炎症性サイトカインは、少なくともLPSの種々の濃度によって活性化ミクログリアで24時間または48時間のインキュベーション期間後に分化神経PC12細胞で観察された細胞傷害性効果のために部分的に関与していることを示しています。 に示されたLPS活性化N9ミクログリアおよびPC12細胞の共培養系を挿入します神経炎症の研究で、それに対抗するための戦略を練り上げる際に特に有用です。我々のグループは、最近16、今度はインサート15の微細孔を交配することによって、神経成長因子、分化したPC12細胞のアポトーシスを誘導する炎症性サイトカインの転写を増加させ、細胞培養で増殖させたLPS活性化N9ミクログリアが展示を挿入することが示されました。同じパラダイムでは、ポリフェノール化合物、レスベラトロール（0.1μM、3時間）でミクログリア人口の前処理は、前炎症性サイトカインの転写を防止し、したがってその後、カスパーゼ3の活性化を遮断によって分化神経PC12細胞のアポトーシスを阻害します、DNA切断。別のグループはまた、N9-PC12共培養26におけるビタミンEの神経保護効果を実証してきました。 N9-PC12の共培養に加えて、別の不死化細胞株または初代培養物はまた、神経炎症の状況において使用されています。例えば、マウスミクログリアBV2細胞株は明らかに、その抗炎症潜在17によって媒介されるポリフェノールルテオリンの抗アポトーシス効果を示すために、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞と共培養しました。同様に、損傷したPC12細胞によって活性化さBV2ミクログリアは、間葉系幹細胞18内の抗アポトーシス効果を発揮することが示されました。相互シグナリングは一次小脳顆粒ニューロン19に与え初代ミクログリアの神経保護の下にある抗アポトーシス機序に重要であることが実証されました。また、初代海馬神経細胞は、システイン交換とシナプス機能20のその後の弱体化によって、グルタミン酸の放出を評価するために分泌されたアミロイド前駆体タンパク質によって活性化初代ミクログリアと同時培養しました。最後に、一つのグループはまた、ケモカイン恒常EXPRES、シグナリングフラクタルに係る初代海馬神経細胞と初代ミクログリアの間に存在するクロストークを示しました受容体ミクログリア21の表面上に見出されるCNSのニューロンによりsedの。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig1.jpg" /> インサート共培養系の 1 概略 図 。上部コンパートメントは、1つの細胞型とその頂端体液環境を保持しているインサートで構成されています。下の区画は、第二の細胞タイプを含むウェルまたはディッシュから構成されています。インサートは、マルチウェル組織培養プレートまたは皿の縁に載ります。インサートは、以下に増殖する細胞の集団に触れないようにだけウェルの底部の上方に位置するように設計されています。下の区画内の培地は、第1の細胞型および第二の細胞型の先端面の基底面の両方に接触している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig1large.jpg" target="_blank">より大きな輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のイオン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig2.jpg" /> 挿入中の図 N9ミクログリアの 2 顕微鏡写真。（A）未処理の休息N9ミクログリアは、彼らが積極的に環境を監視することを可能にする分枝細胞の形態を示します。 （B）24時間表示、活性化表現型の典型的なアメーバ状形状のためのリポポリサッカライド（LPS）で処理されたインサートでN9ミクログリア。この顕微鏡写真は、ちょうど図4に示すように、分化したPC12細胞を含むウェルにこれらの活性化N9ミクログリアを含むインサートを転送する前に撮影された。スケールバー=25μmで。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <imgALT = &quot;図3&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54356 / 54356fig3.jpg&quot; /&gt; リポ多糖（LPS）で処理した後 、図3 N9ミクログリア細胞密度が異なるタイム・スパンのLPSの種々の濃度でN9ミクログリアの治療効果は、血球計数器69を使用して細胞数を推定することによって評価しました。群間の有意差は、Windowsのバージョン3.06（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）、グラフパッドINSTATプログラムとTukeyの事後分析に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。 10ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは、治療とコントロール状態との間で統計的な差を示す（** P &lt;0.01）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig3large.jpg" target="_blank">ラーグを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のERバージョン。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig4.jpg" /> 図 差別神経PC12細胞の 4 顕微鏡写真。七日間神経成長因子、分化した神経PC12細胞は、このような長い神経突起や静脈瘤などの明白なニューロン表現型を示しています。この顕微鏡写真は、ちょうど、図2に描かように活性化N9ミクログリアを含むインサートを転送する前に撮影された。スケールバー=25μmで。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig5.jpg" /> リポ多糖の 図5. 細胞毒性効果（LPS）は、分化神経PC12細胞にミクログリアを付活。N9ミクログリアは、24時間または48時間分化した神経PC12細胞を含むウェルに移し、24時間LPSの種々の濃度で活性化しました。細胞毒性は、下部コンパートメントの上清に対して行わ乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを用いて評価しました。群間の有意差は、Windowsのバージョン3.06（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）、グラフパッドINSTATプログラムとTukeyの事後分析に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは、治療とコントロール状態（*** P &lt;0.001）との間に統計的な差を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> リポ多糖（LPS）によってN9活性化後、上清中の I nterleukin-6（IL-6） の 図6 濃度 。N9ミクログリアは、24時間LPSの種々の濃度で活性化し、次いで分化神経PC12細胞を含むウェルに移しました24時間または48時間。下部コンパートメントの上清中のIL-6濃度は、ELISAを用いて評価しました。群間の有意差は、Windowsのバージョン3.06（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）、グラフパッドINSTATプログラムとTukeyの事後分析に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは、治療と詐欺の間に統計的な差を示しますントロール条件（*** P &lt;0.001、**はp &lt;0.01と* P &lt;0.05）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig7.jpg" /> リポ多糖（LPS）によってN9活性化後、上清中の インターフェロンγ（IFN-γ） の 図7 濃度は N9ミクログリアを24時間LPSの種々の濃度で活性化し、次いで24時間分化した神経PC12細胞を含むウェルに移しましたまたは48時間。下部コンパートメントの上清中のIFN-γ濃度をELISAを用いて評価しました。群間の有意差を、GraphPad INSTATプログラムとTukeyの事後解析、バージョン3.06に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。Windowsの（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）のために。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは。（**はp &lt;0.01と* P &lt;0.05）処理と制御状態との間に統計学的な差を示している<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig7large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig8.jpg" /> リポ多糖（LPS）によってN9活性化後、上清中の腫瘍壊死因子α（TNF-α） の 図8 濃度は 、N9ミクログリアを24時間LPSの種々の濃度で活性化し、その後のために分化した神経PC12細胞を含むウェルに移しました24時間または48時間。 TNF-α下部コンパートメントの上清中の濃度を、ELISAを用いて評価しました。群間の有意差は、Windowsのバージョン3.06（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）、グラフパッドINSTATプログラムとTukeyの事後分析に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは、治療とコントロール状態（*** P &lt;0.001）との間に統計的な差を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

27.6K ビュー.  University of Québec. In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

LIFの不在下で自己再生MESCをサポートするためのSC1（Pluripotin）の使用

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

接着細胞培養用の酸素挿入の作製と動作

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

カエル精子の化学誘引を検出するためのアッセイの二種類

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...