This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB: Jeder der folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, wie für Säugetierzellkultur erforderlich. Darüber hinaus gelten die allgemeinen Richtlinien für die optimale sterile Zellkultur, z. B., Tipps jederzeit verwerfen sie zu Kreuzkontaminationen führen kann, die Verringerung der Menge an Zeit , Zellen der Luft ausgesetzt werden , wenn ganze Medienwechsel durchführen, richtig , aber vorsichtig alle Rühren Zellsuspensionen ihre homogene Pipettieren, um sicherzustellen, etc. Darüber hinaus Einsätze eine Art von Plastikmaterialien, die eine besondere Behandlung erfordern. Erstens, wenn Einsätze manipuliert werden, vermeiden die zerbrechliche Membran berührt, die sich leicht reißt und damit das Experiment gefährden könnten. Auch ist es nicht geeignet Vakuumabsaugung des Zellkulturmedium durchzuführen, da die Gefahr der Perforation der Membran oder Dissoziieren adhärenten Zellen ist. Als nächstes hängen Einsätze lose in der Multi-Well-Gewebekulturplatte und somit Vorsicht, wenn mo eingesetzt werden müssenving die Kunststoffgeschirr oder wenn dissoziierenden anhaftenden Zellen zu vermeiden Pipettieren. Zusätzlich wird, wenn Einsätze mit großen Porengrößen verwendet werden, ist es eine Möglichkeit, dass das Zellkulturmedium durch die Membran eindringt, und daher ist es wichtig, das Niveau der Flüssigkeit häufig überwachen. Schließlich ist zu beachten, dass das folgende Protokoll für adhärente Zellen konstruiert und erfordert geringen Modifikationen, um für Suspensionszellen geeignet. 1. Allgemeine Richtlinien für die Durchführung von Einsatz Co-Kultur-Experimente <ol><li> Seeding Zelltyp # 1 in Einsätze <ol><li> Packen Sie die Einsätze aus der Verpackung. </li><li> Legen Sie die Einsätze in einem leeren Multi-Well-Gewebekulturplatte von der richtigen Dimension. Dazu greifen die oberste Kante des Einsatzes mit einer Pinzette. </li><li> Um die Anlage zu verbessern und die Verbreitung von anhaftenden Zellen, bedingen die Einsätze mit Zellkulturmedium vor der Aussaat. Dazu deckt die gesamte Oberfläche der Membran mit Zellkultur medium mit einer Mikropipette. HINWEIS: Tun Sie dies für so viele Einsätze wie erforderlich. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation für mindestens 1 Stunde oder O / N unter den gleichen Bedingungen ( in der Regel 37 ° C, 5-10% CO 2). </li><li> Wenn die Einsätze bedingt sind, entfernen alle Zellkulturmedium mit einer Mikropipette. Entsorgen Sie das verwendete Medium. </li><li> Seed Zelltyp # 1 in frischem Zellkulturmedium in der gleichen Weise wie in einer Multi-Well-Platte. Dazu ziehen so, ein geeignetes Volumen der Zellsuspension mit einer Mikropipette und verzichtet die Flüssigkeit im Einsatz. HINWEIS: Bereiten Sie so viele Einsätze wie erforderlich. </li><li> Nach der Aussaat alle Einsätze, schaukeln sanft die Platte links und rechts, dann hin und her, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Vermeiden Sie kreisförmige Bewegungen zu machen, da dies die Zellen bewirkt, dass in der Mitte der Einsätze zu akkumulieren. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation, wie nach zellulären Anforderungen angegeben (in der Regel 37 ° C, 5-10% CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Seeding Zelltyp # 2 in Multi-Well-Gewebekulturplatten <ol><li> Seed Zelltyp # 2 in frischem Zellkulturmedium gemäß § 1. </li><li> Bereiten so viele Vertiefungen wie für die Anzahl der Einsätze erforderlich. Rock die Platte wie in Schritt 1.1.7), um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation unter den gleichen Bedingungen ( in der Regel 37 ° C, 5-10% CO 2). </li></ol></li><li> Erfrischende Medium in Einsätze <ol><li> Mit einer Mikropipette, entfernen einen Teil oder die gesamte Zellkulturmedium, in den Einsätzen enthaltenden Zelltyp # 1. Entsorgen Sie das verwendete Medium. </li><li> Zeichnen Sie ein entsprechendes Volumen an frischem Zellkulturmedium. die Spitze an der Innenwand des Einsatzes sanft ruhen und langsam die Zellkulturmedium verzichtet werden kann. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation gemäß Schritt 1.1.4. </li></ol></li><li> Erfrischende Medium in Multi-Well-Gewebekulturplatten <ol><li> Mit Hilfe eines MICROPIPette, einen Teil oder alle Zellkulturmedium in den Vertiefungen, die Zelltyp # 2 zu entfernen. Entsorgen Sie das verwendete Medium. </li><li> Zeichnen Sie ein entsprechendes Volumen an frischem Zellkulturmedium. Ruhen die Spitze an der Innenwand des Schachts und abzugeben langsam das Zellkulturmedium. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf der Platte und Inkubation nach vorher etablierten Zellkulturprotokolle. </li></ol></li><li> Übertragen Einsätze Zelltyp # 1 bis Multi-Well-Gewebekulturplatten, enthaltend Zelltyp # 2. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt, wenn beide Zelltypen die entsprechende Wachstumsstadium erreicht haben. <ol><li> Vor der Einsätze in die Vertiefungen übertragen, nehmen Sie alle notwendigen Änderungen Medium, wie dies zuvor in den Schritten 1.3) und 1.4). HINWEIS: An diesem Punkt ist es wichtig, die entsprechenden Volumina der Medien in den beiden Kammern zu verzichten, wie durch den Einsatz Anweisungen des Herstellers angegeben. </li><li> Mit einer Pinzette greifen die oberste Kante eines Einsatzes enthält Zelle typ 1 # und vorsichtig in die entsprechende Vertiefung mit Zelltyp # 2 einzustufen. </li><li> Nachdem alle Einsätze übertragen, überprüfen Sie das Vorhandensein von Luftblasen unter der Membran von Einsätzen. HINWEIS: Luftblasen verhindern jeglichen Austausch über die Membran des Einsatzes und können das gesamte Experiment gefährden. </li><li> Wenn Luftblasen vorhanden sind, heben Sie sehr vorsichtig, den Einsatz von den gut mit einer Pinzette und zurück in die Zellkulturmedium stürzen. Die Blasen werden verschwinden. Wenn sie noch vorhanden sind, versuchen sanft Einsätze wieder in das Zellkulturmedium in einem Winkel eintaucht. HINWEIS: Verwenden Sie klopfen nicht oder Einsätze rühren anhaftenden Zellen zu vermeiden, distanziert. </li><li> Nach dem Entfernen der alle Luftblasen und Überprüfung, dass die Volumina der Medien in den beiden Abteilen, auf der Platte des Deckels legen und inkubieren. </li></ol></li><li> Refreshing Medien in einem Co-Kultursystem Hinweis: Obwohl die Membran leicht Medienaustausch zwischen dem Einsatz und auch ermöglicht, das Aktualisieren des Mediums erfolgt inbeide Fächer seit der Zeit allein ziemlich lang sein kann, zu erreichen Gleichgewicht in der oberen und unteren Kammern durch Diffusion erforderlich. <ol><li> Refreshing Medium in Inserts enthalten Zelltyp # 1 wird in der gleichen Weise wie in Schritt 1.3). </li><li> So aktualisieren Sie Medium in Vertiefungen, die Zelltyp # 2, schieben Sie den Einsatz an der Seite einen Raum breit genug zu schaffen, um eine Pipettenspitze aufzunehmen. Aktualisieren Sie das Medium wie in Schritt 1.4). </li><li> Überprüfen Sie das Vorhandensein von Luftblasen und überprüfen Sie die Volumina gemäß Schritt 1.5.3) bis 1.5.5). </li></ol></li></ol> 2. Beispiel: Messung der Wirkungen der Cytokine sezerniert durch LPS-aktivierte Mikroglia N9 auf neuronale PC12 - Zellen HINWEIS: Die folgenden Schritte sind für bestimmte Kolben ausgelegt, gut und Parabolgrößen. Jedoch kann das Protokoll für alle Kunststoffgeschirr Dimensionen angepasst werden. Für die Medien und die Zusammensetzung siehe Materialien Tabelle. <ol><li> Säen und Differenzierung PC12-Zellen in MultiWell-Gewebekulturplatten <ol><li> Warm Routine PC12 Zellkulturmedium, PC12 Differenzierungsmedium und Trypsin-EDTA in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Verwenden Sie PC12 - Zellen bei 60-80% Konfluenz aus einem 75 cm 2 Kolben. </li><li> Mit einem 15 mm Pasteur-Pipette, führen Vakuumabsaugung des gesamten Zellkulturmedium in den Kolben. </li><li> Spülen Sie vorsichtig die Zellschicht mit 5 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pasteur-Pipette. Seien Sie vorsichtig, nicht Zellen in diesem Schritt zu distanzieren. </li><li> Decken Sie die Zellschicht mit 3 ml Trypsin-EDTA und Inkubation für 2-3 min bei 37 ° C. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Zellen unter einem Mikroskop abgelöst werden. Wenn nur sehr wenige Zellen schweben, für maximal 5 Minuten für einen längeren Zeitraum inkubiert. </li><li> 10 ml Routine PC12 Zellkulturmedium, um die Trypsin-EDTA zu inaktivieren. </li><li> Mit einer 10 ml Pipette, verreiben sanft gleichzeitig aber dafür sorgen, dass die meisten Zellen vom Boden gelöst sind of den Kolben. Vermeidung von Luftblasen in der Zellsuspension zu schaffen. </li><li> Mit dem gleichen 10 ml Pipette die Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie für 1 min bei 3.200 xg </li><li> Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette Pasteur, während darauf geachtet nicht das Pellet zu stören. </li><li> 10 ml Routine PC12 Zellkulturmedium mit einer 10 ml Pipette. Hinweis: Dieses Volumen eingestellt werden kann, wenn das Pellet ungewöhnlich klein oder groß ist. </li><li> Man reibt mit dem gleichen 10 ml Pipette das Pellet zu homogenisieren. PC12-Zellen verklumpen oft zusammen, so dass mindestens 20 Pipettieren und downare notwendig. HINWEIS: Während kräftige Verreiben notwendig ist, vermeiden Sie Luftblasen in der Zellsuspension zu schaffen. </li><li> In einem 1,5-ml-Röhrchen, eine geeignete Verdünnung der Zellsuspension in Trypanblau vorzubereiten. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Zählkammer nach zuvor festgelegten Protokollen 74. </li><li> In einem separaten 50-ml-Röhrchen, teilen Sie die Zellsuspensionmit PC12 Differenzierungsmedium eine verdünnte Zellsuspension geeignet für Aussaat Brunnen von einer 24-Well - Platte (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml pro Vertiefung gemäß dem Protokoll des Herstellers) zu erhalten. HINWEIS: Die 24-Well - Platte muss vorher mit Kollagen beschichtet werden , wie 75 von zuvor festgelegten Protokolle festgelegt wurden . </li><li> 0,6 ml der Zellsuspension verteilen pro Vertiefung einer Mikropipette. </li><li> Wenn alle Vertiefungen ausgesät sind, schaukeln sie die Platte wie in Schritt 1.1.7). </li><li> Die richtige Differenzierung von PC12 - Zellen zu ermöglichen, bei 37 ° C in einem 5% CO 2 feuchten Atmosphäre in PC12 Differenzierungsmedium 15,16 die 24-Well - Platten für 7-9 Tage brüten vor Co-Kulturexperimente durchgeführt werden . </li><li> Führen jeden zweiten Tag Mediums ändert die Hälfte der Flüssigkeit entfernt und mit einem gleichen Volumen von frischem PC12 Differenzierungsmedium ersetzt. </li></ol></li><li> Aussäen N9 Mikroglia in den Einsätzen und der Behandlung mit LPS <ol><li> Einen Tag vor der Co-Kultur-Experimente durchführen, vorzubehandeln PTFE 0,4 um Poreneinsätze mit Routine N9 Zellkulturmedium die Zellhaftung zu optimieren, folgende Schritte 1.1.1) bis 1.1.4) </li><li> Warm Routine N9 Zellkulturmedium und Trypsin-EDTA in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Inzwischen wiegen etwa 10 mg LPS in einem 1,5-ml-Röhrchen für eine spätere Verwendung. HINWEIS: Da LPS ist ein potenter proinflammatorischer Endotoxin und erfordert besondere Sicherheitsvorkehrungen, Brille, Handschuhe und ein einatmen werden dringend empfohlen. </li><li> Verwenden Sie N9 Zellen bei 80-90% Konfluenz aus einem 75 cm 2 Kolben. </li><li> Führen Sie die Schritte 2.1.3) bis 2.1.14). Verwenden Sie immer Routine N9 Zellkulturmedium anstelle von Routine PC12 Zellkulturmedium. Beachten Sie auch, dass N9 Mikroglia nicht verklumpen, so viel wie PC12-Zellen zu tun, so dass weniger Pipettieren nach oben und unten kann in Schritt 2.1.13) erforderlich sein. </li><li> In einem separaten 50-ml-Röhrchen, teilen Sie die Zellsuspension mit N9 Zellkulturmedium zu obtain einer verdünnten Zellsuspension geeignet für Aussaat Einsätze konzipiert in 24-Well - Platten (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml pro Einsatz nach dem Protokoll des Herstellers, für Membranoberfläche , Hersteller Informationen) zu halten. ANMERKUNG: Diese Einsätze sind bereits mit Kollagen vom Hersteller beschichtet und für Zelladhäsion optimiert. </li><li> mit einer Mikropipette 0,05 ml der Zellsuspension pro Platte verteilen. </li><li> Wenn alle Einsätze ausgesät sind, schaukeln sie die Platte wie in Schritt 1.1.7). </li><li> Führen Reihenverdünnungen von LPS N9 Behandlungsmedium unter Verwendung von 4 &amp; mgr; g / ml zu erhalten, 2 ug / ml und 1 ug / ml Arbeitslösungen. </li><li> Pipette 0,05 ml der 4 ug / ml Arbeitslösung in einem der Satz von Einsätzen, um eine endgültige Verdünnung von 2 pg / ml zu ergeben. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.2.10) für die beiden anderen Arbeitslösungen in verschiedenen Sätzen Einsätzen, wodurch man Endverdünnungen von 1 ug / ml und 0,5 ug / ml. </li><li> Imcubate die Platten , die Einsätze für 24 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 enthaltenden feuchten Atmosphäre N9 Mikroglia - Aktivierung mit LPS zu ermöglichen , bevor die Co-Kultur - Experimente durchführt. </li></ol></li><li> Co-Kultivierung von neuronalen PC12-Zellen mit N9 Mikroglia <ol><li> An 7-9 Tagen von PC12-Zellen differenzieren, aktivieren Sie die N9 Mikroglia nach 24 Stunden Inkubation mit LPS durch warme N9 Behandlungsmedium und PC12 Behandlungsmedium in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Führen Sie eine Gesamtmediumwechsel für N9 Mikroglia, wie in Schritt 1.3), das gesamte verwendete Medium durch 0,1 ml N9 Behandlungsmedium zu ersetzen. Tun Sie dies für alle insert.This ist notwendig, um alle Spuren von LPS zu entfernen, nur dann aktiviert N9 Mikroglia in den Einsätzen zu verlassen. </li><li> Führen Sie eine Gesamtmediumwechsel für neuronale PC12-Zellen, wie in Schritt 1.4). Übertragen , um die Einsätze in die 24-Well - Platten , wie in Schritt 1.5) .Incubate die N9-PC12 Kokulturen für 24 h oder 48 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 feuchten Atmosphäre. </li><li> nach 24h oder 48 h, ernten Sie den Überstand und / oder die auf Zytotoxizität, Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA), Western Blot oder andere Tests. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Der kritischste Schritt jedes Einsatzes Kokultursystem Experiment verweilt tatsächlich in der richtigen Einsatz Wahl zu verwenden. Die Porengröße und Membranmaterial muss in gründliche Rechnung getragen werden, ohne zu vergessen, die Art der Zellen zu betrachten, und der Zweck des Experiments ausgesät werden. Beispielsweise Kontaktchemotaktische Assays können die gleiche Art von Membran als Zell Kokulturen verwenden, um Zellverhalten Modulationen analysieren induziert durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell. Jedoch erfordern beide Arten von Experimenten unterschiedlichen Porengrößen: größeren für die ersteren, Zellmigration zu ermöglichen, und kleinere für letzteren, Zellmigration und Zell-Zell-Kontakt zu verhindern. Für die Auswertung von zellulären Veränderungen von sezernierten löslichen Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt vermittelt wird, Porengrößen von 0,4 &amp; mgr; m bis 3 &amp; mgr; m sind in der Regel geeignet, da sie für große Moleküle erlauben, wie Proteine, zu überqueren, aber die meisten Zellen verhindern tun damit. MembranMaterial hängt weitgehend von dem Zelltyp und die Techniken am Ende des Zellkulturprotokoll verwendet werden. Kurz gesagt, bieten PET-Membranen gute Zell Sichtbarkeit, da sie klar sind, aber nicht Kollagen beschichtet, was ein Problem für anhaftenden Zellen sein können, die für die notwendige Unterstützung zu behandeln. Sie haben auch die beste chemische Beständigkeit gegen Fixierungen, die neben ihrer guten optischen Eigenschaften, wodurch sie ideal für histologische Untersuchungen macht. Auf der anderen Seite, PC-Membranen bieten schlechte Zelle Sichtbarkeit, da sie durchscheinend sind und nicht Kollagen beschichtet. Aber sie besitzen die höchste Dichte der Poren und die am stärksten diversifizierte Verfügbarkeit von Porengrößen. Schließlich sind PTFE-Membranen deutlich, wenn nass, aber nur die Visualisierung von Zelle erlauben, in dem Mikroskop skizziert. Als großer Vorteil werden sie beschichtet Kollagen, das macht sie auch ein wenig dicker. Es ist wichtig, dass die Beschichtung PET oder PC Membraneinsätze mit Kollagen zu beachten, können die Poren blockieren und den Durchtritt von löslichem facto behindernrs. In jedem Fall bieten die meisten Einsatz Hersteller umfassende Führer Forscher dabei zu unterstützen, den richtigen Einsatz auswählen. In unserem speziellen Paradigma, die Wahl der Plattierungsdichte, Medien, Serumkonzentration, Tage der Differenzierung, Tage der LPS - Aktivierung, Konzentrationen von LPS und Beschichtung der Kolben für PC12 - Zellen über Jahre wurden mit diesen Arbeits Co-Kultur - Systeme optimiert 15 , 16. Bemerkenswert wurde bei 60.000 ¢ / cm 2 gewählt , um die Beschichtungsdichte von N9 Mikroglia in den Einsätzen der Beginn der Co-Kultur und damit 40-50% Konfluenz in dem Moment zu erhalten, ihnen Raum zu geben , bei deren Aktivierung zu vermehren durch LPS. Andere Bedingungen, wenn optimiert kann auch zufriedenstellende Ergebnisse ergeben, wie Kollagen durch L-Lysin in den Flaschen, die für nativen PC12 Wartung ersetzt wurde. Um die Nachhaltigkeit der Ergebnisse, verschiedene Kontrollen durchgeführt werden, zu erhöhen. Beim Versuch, die lösliche Faktoren zu beweisenfür die beobachteten Effekte verantwortlich sind, sollten direkte Zell-Zell-Kontakt und konditioniertes Medium Experimente manifestiert Mischkulturen parallel durchgeführt werden. Darüber hinaus wird ein spezifisches sekretierten Faktor zu neutralisieren Verwendung von Antikörpern Herstellung helfen, das Molekül verantwortlich für die parakrine Wirkung bei der Identifizierung, die wahrgenommen wird. Wenn möglich, Block einen Rezeptor oder einen Teil seiner Signalwegs die genaue Identität des Rezeptors zu identifizieren aktiviert wird. Wenn ein Molekül verwendet, um eine Zellpopulation vor der Cokultur Experiment mit einem zweiten Zelltyp, wie in dem Beispiel zuvor beschrieben zu aktivieren, ist es wichtig, die Gegenwart des Moleküls in dem System zu berücksichtigen. Als erste Option sollte das Medium vollständig vor dem um Kokultur Experiment verändert werden, um sicherzustellen, dass das Molekül von dem System überhaupt nicht vorhanden ist. Als zweite Option sollte eine Bedingung hinzugefügt werden, in dem allein das Molekül mit dem zweiten Zelltyp inkubiert, um aufseine Wirkung in Abwesenheit des ersten Zelltyps zu bewerten. Wenn es keine Wirkung des Moleküls auf der zweiten Zelltyp ist, wird es nicht nötig sein, das Medium zu ändern, bevor die Co-Kultur Experiment. Ebenso, wenn beide Zelltypen, die nicht in der gleichen Zellkulturmedium gewachsen sind, müssen ähnliche Vorkehrungen sicher zu achten, dass die Unterschiede in der Zusammensetzung des Mediums nicht zu beeinflussen oder die andere Zellpopulation. Obwohl beide Medien werden zunächst durch den Einsatz Membran getrennt werden, wird die Diffusion gebunden, um sicherzustellen, dass sie über längere Inkubationszeiten mischen. Darüber hinaus können mehrere Probleme aus anomale Störung des löslichen Faktor-Rezeptor-Beziehungen entstehen. Unter mehreren Fehlerursachen, die übermäßige Verwendung von enzymatischer Spaltung und die Anwesenheit von wichtigen Konzentrationen von Serum kann mit Zelloberflächenrezeptoren stören. Andere Ursachen für Fehler in Insert Kokultur Systeme umfassen, sind aber nicht auf 1) unsachgemäße Zellkulturtechniken beschränkt, wie beispielsweise die Gesamtheit der Zelle zu entfernenKulturmedium in zu viele Kavitäten gleichzeitig Zellen zu verursachen, um zu trocknen, 2) eine Monoschicht, die in dem Einsatz zu konfluent wird, verantwortlich für den Einsatz Membran abdichtet und apikal-sekretierte Moleküle verhindern, dass das untere Kompartiment zu erreichen, und 3) verstellt Zellkonfluenz, die physiologisch irrelevante Ergebnisse oder Fehlen jeglicher Effekt führt eine Über- oder Unterexpression von löslichen Faktoren verursacht. Während nur ein Szenario von Einsatz Kokultur hier vorgestellt wurde, gibt es zahlreiche Möglichkeiten, die Verwendung dieser sehr vielseitige Technik zu machen. Hier wurde ein Zelltyp, vorbehandelt mit einem Molekül verantwortlich für die Induktion der Sekretion eines löslichen Faktor, der, beim Überführen der Einlage zu dem Bohrloch, um das Verhalten des zweiten Zelltyps betrifft. Es ist auch möglich, die beiden Zelltypen miteinander in einem Co-Kultursystem zu inkubieren, bevor sie zum Nachweis der erhöhten Anfälligkeit oder Resistenz von einer oder beiden Zellpopulationen zu einer entfernteren Behandlung trennt. However, wenn seine elementarsten Form Berücksichtigung dieser Technik kann zusammen ohne Behandlung inkubiert Verwendung von zwei Populationen von Zellen zu machen, mit dem Ziel, basal parakrine reziproke Signal zu beurteilen. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist , dass sehr kurzlebig molekulare Einheiten wie reaktive Sauerstoffspezies nicht überleben die Distanz, die die Zellpopulation wächst in der oberen Kammer und dem in der unteren Kammer 82 trennt. Die neueste Entwicklung in Co-Kultur - Techniken hat versucht , dieses Problem zu beantworten , indem eine mikrostrukturierte Kultursubstrat der Lage , unter Verwendung von 83 zwei Zellpopulationen in mikroskaligen Nähe zu halten. Zusätzlich zu all den Vorteilen des Einsatzes Kokultur Systeme wie populationsspezifische Erkennung von Veränderungen und bidirektionale Signalisierung trägt, diese mikrofabrizierten Bildschirm war auch möglich, die Erkennung von Kurzstrecken-Wechselwirkungen zu machen, die nicht gezeigt vor d warenetectable aufgrund des Zerfalls von löslichen Faktoren über Entfernungen. Diese Zellkultur-Plattform ist die neueste Innovation in der Zelle Co-Kultur und verspricht unravel Signalmechanismen zwischen Zellen zu helfen, die vor übersehen wurden.

Die Untersuchung von Geweben, Organen oder Systemen in vitro ist ein Versuch , die sehr komplexen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zellsubtypen bestehenden zu vereinfachen , die mehrzellige Organismen umfassen. Tatsächlich in - vitro - Studien ermöglichen es , ein detailliertes Verständnis der einzelnen Zellpopulationen zu erwerben. Es gibt zwei Hauptvorteile von in vitro Experimenten Durchführung: 1) zellulare Wechselwirkungen reduziert, und 2) die Fähigkeit, leicht die zelluläre Umgebung manipulieren. Daher haben diese beiden Vorteile erlaubt, das Verhalten von spezifischen Zelltypen in vivo vorherzusagen, zu der Fähigkeit führen Ergebnisse der extrinsischen Einflüsse in ganzen Organismen zu regulieren. In diesem Sinne arbeitet in - vitro - Zellkultur oft als Brücke zwischen Grund- und Lebenswissenschaften angewendet. Dennoch gibt auch mehrere Nachteile der Arbeit in vitro sind, die wichtigste ist , daß eine gewisse Vorbehalte in der physiologischen wohnenal Relevanz der beobachteten Phänotypen. Tatsächlich, wenn ein Zelltyp ist, in einem Gefäß aufgewachsen, die Kultur verliert, in unterschiedlichem Umfang, dessen Zell-Zell-Verbindungen mit anderen Zelltypen, ihren Beitrag zur humoralen Umgebung aus dem Gewebe und Herkunftsorganismus und den Anker innerhalb das Gewebe, das es ermöglicht, eine bestimmte dreidimensionale Struktur manchmal entscheidend für die Zellfunktion aufrecht zu erhalten. Die Frage nach der Zell-Zell-Beziehungen wurde durch die Entwicklung der Mischkultur-Techniken gerichtet. In diesem Verfahren werden zwei oder mehr Zellpopulationen miteinander in dem gleichen Kulturgefäß gezüchtet. Allerdings tragen diese Mischkulturen wichtige Nachteile. Einerseits nicht physisch miteinander in dem Ursprungsgewebe und verlassen sich ausschließlich auf parakrine Kommunikations getragen von sezernierten löslichen Faktoren und in der Nähe Rezeptoren interagieren einige Zellsubtypen. Dies ist der Fall für mehrere entzündliche Prozesse, die auf proximalen Cytokine Signaling abhängen. In gemischten cultures, physikalische Wechselwirkungen sind unvermeidbar und es unmöglich machen, parakrine Kommunikation in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakte zu studieren, die veränderten Ergebnisse liefern kann. Auf der anderen Seite wird, ohne die Verwendung von ätzenden Trenntechniken undurchführbar zellspezifische Interpretationen aus einer gemischten Population zu erzielen, die deutlich Ergebnisse beeinflussen könnten. Um diese wichtige Probleme zu lösen, wurde die Verwendung von konditionierten Medien wurden als eine Technik entwickelt, so dass für compartmentalized Kulturen und das Studium der parakrinen Signalisierung. Dieses Verfahren erfordert den Transfer des Überstands eines Zelltyps, so konditionierte Medium benannte in die Vertiefungen einer anderen Population von Zellen enthält. Noch ein wichtiger Nachteil ist, dass kurzlebige Moleküle überleben nicht lange genug in dem konditionierten Medium zu den Vertiefungen der zweiten Population von Zellen zu übertragen. Auch langlebige Moleküle stark im Laufe der Zeit wird durch Diffusion verdünnt. Außerdem sind sowohl ZellPopulationen teilnehmen nur in einer Richtung parakrine Kommunikation statt in aktive bidirektionale Kommunikation. Dies führt zur Abwesenheit von Rückkopplungssignalisierung , die in Neuer genaue vielzelligen Beziehungen wichtig ist , da sie in vivo existieren. Als Folge und durch die Notwendigkeit , in der in vitro Zellumgebung haben , um besser simulieren die ursprünglichen in - vivo - Bedingungen angetrieben wird , mehrere Fortschritte in der Zellkulturtechniken wurden im Lauf der Jahre erreicht. Einer der bedeutendsten Fortschritte hat Kompartimentierung Zellkulturen, die Verwendung von durchlässigen Träger mit mikroporösen Membranen wurden zum ersten Mal von Grobstein 1953 1 verwendet. Solche permeable Träger über die Jahre zugeschnitten wurden zahlreiche Zelltypen zu unterstützen und zu verwende in verschiedenen Anwendungen. Heute existieren diese Träger als Hohl Einsätzen, die in den Vertiefungen von einer Multi-Well-Gewebekulturplatte ruhen sollen oder in circular Speisen. In einem Co-Kultursystem, enthält der Einsatz einen Zelltyp , während die Vertiefung oder Schale enthält die anderen Zellpopulation, um den Beitrag von zwei verschiedenen Populationen von Zellen auf ihrer humoralen Umgebung zu studieren ermöglicht (Figur 1). Als Ergebnis erhalten bleibt Zellpolarität (basolaterale vs apikal Sekretion oder Signalempfang), so dass Einsatz Co-Kultur-Systeme einen wichtigen Vorteil gegenüber Mischkulturen und konditioniertes Medium Techniken verleihen. Verschiedene Arten von Membranmaterialien zur Verfügung, die gebräuchlichsten sind Polyester (PET), Polycarbonat (PC) oder Polytetrafluorethylen (PTFE) mit Kollagen beschichteten und sie existieren in verschiedenen Porengrößen von 0,4 &amp; mgr; m bis 12,0 &amp; mgr; m reichen. Diese Sorten von Materialien und Porengrößen bieten ein Spektrum von Einsätzen variable relevanten Merkmale optischen Eigenschaften, Membrandicke und Zellhaft ausübt, die sie praktisch auf unterschiedlichen Ebenen für den folgenden machen Verwendungen nicht beschränkt auf: -studyingZelldifferenzierung, die embryonale Entwicklung, Tumormetastasen und Wundreparatur durch chemotaktische Assays durchlässige Membranen; -Bewertung Wirkstoffpenetration durch den Transport durch epitheliale oder endotheliale Monolayern Beurteilung kultiviert auf durchlässigen Träger, und; -Beim Ausführen Zelle Kokulturen Modulationen Zellverhalten, induziert durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt zu analysieren. Der Zweck dieses Artikels ist allgemeinen methodischen Richtlinien beschreiben die dritte Funktion oben angegeben zu erfüllen, die die zelluläre Veränderungen von sezernierten löslichen Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt unter Verwendung eines Einsatzes Co-Kultursystem vermittelt zu bewerten ist. Mehrere verschiedene Forschungsbereiche nutzen Einsatz Co-Kultursystemen, um Fragen, die die Wirkung von sekretierten löslichen Faktoren auf Populationen von Zellen zu beantworten. Tatsächlich parakrine Signalisierung, die auf verschiedenen Ebenen Zellverhalten moduliert ist relevant in allen Gewebenund Systeme, die Insert-Co-Kultursystemen macht unentbehrliche Fortschritte in diesen Bereichen zu gewährleisten. Umgekehrt kann die Verwendung von Einsätzen, welche die Signaltransduktion bestätigen ist durch direkte Zell-Zell-Kontakt und nicht durch sekretierte Faktoren. Eine der wichtigsten Anwendungen von Einsätzen ist in Entzündungsstudien 2-14 , wo der Effekt von sekretierten Zytokinen in verschiedenen zellulären Immunität Spieler ausgewertet wird. Insbesondere hat die Untersuchung der Entzündung im zentralen Nervensystem (ZNS) profitiert sehr von Insert Kokultur Studien, die besser erlaubt haben , die zu dem unterscheidbaren parakrine Funktionen von Neuronen und Mikroglia Definition in 15-21 neuroinflammation fahren. Diese Systeme wurden auch die entzündungshemmende Potential von Molekülen zu untersuchen entwickelt , die auf ihrer Fähigkeit beruht zu verringern oder die Sekretion von entzündungsfördernden Faktoren 22-26 hemmen. Betreffend Forschung insbesondere zur Krebs 27-31, die zugrunde liegenden Mechanismen der Angiogenese 32-34 und inflammatiauf 35-42 in tumorigenesis, profitiert auch von Insert - Co-Kultursystemen. Darüber hinaus sind lösliche Faktoren von zentraler Bedeutung in den Prozessen , die verwendet wurden Einsätze Differenzierung und mehrere Studien treiben 43-50 Fragen in diesem speziellen Bereich zu beantworten. Im ZNS, wie Nervengewebe zu sehen , hat eine sehr begrenzte Erneuerungspotential, das Studium der neurotrophism und Neuroprotektion ist von grundlegender Bedeutung und 51-56 durch die Verwendung von Stammzellen in Kokultur Systemen weit sichergestellt ist. Darüber hinaus Einsätze sind auch in so unterschiedlichen Bereichen wie der Nephrologie 57,58, endotheliale Wechselwirkungen und Angiogenese 59-62, Apoptose Signalgebung 63-65, Entzündung bei Adipositas und metabolisches Syndrom 22,23,66-67, Innenohrhaarzellschutz genutzt 68,69 und sogar in Pilz Virulenz 70,71 und Parasitologie 72,73. Dieser Artikel bietet allgemeine methodische Leitlinien, um eine Experim einzurichtenent angesichts von sezerniert löslichen Faktoren unter Verwendung eines Einsatzes Co-Kultursystem vermittelte zelluläre Veränderungen zu bewerten. Insbesondere werden wir unsere Aufmerksamkeit auf die Nervenzelle Co-Kulturen und deren Anwendung bei der Untersuchung neuroinflammatorische Prozess konzentrieren. das sehr breite Spektrum von Experimenten gegeben, die Piloten ermöglichen, einfügt, ist es unerträglich, jeden Aspekt dieser Zellkulturtechnik zu decken. Als Beispiel für ein bestimmtes Protokoll die Wirkungen von Zytokinen sezerniert messen Lipopolysaccharid (LPS) -aktivierten wird N9 Mikroglia auf neuronale PC12-Zellen detailliert, ein konkretes Verständnis der Einsatz Kokultur Methodologie bietet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8755</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6421</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2040</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;">MultiCell</td>
			<td style="width:119px;">80350</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N0513</td>
			<td style="width:328px;">Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&#8211;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Lipopolysaccharides from&#160;Escherichia coli&#160;055:B5</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2880</td>
			<td style="width:328px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Cell culture inserts for use with 24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353095</td>
			<td style="width:328px;">0.4 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">TrueLine</td>
			<td style="width:119px;">TR5002</td>
			<td style="width:328px;">Coat with collagen before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Routine PC12 cell culture medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Routine N9 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 85% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 90% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 differentiation medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N9 treatment medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 50 ng/mL nerve growth factor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 treatment medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Die Verwendung von Einsatz Co-Kultursystemen ist besonders relevant bei der Untersuchung von neuroinflammatorischen Prozesse, die parakrine Beziehungen zwischen verschiedenen zellulären Spieler des ZNS zeigen. Immunität im ZNS erfolgt in erster Linie von den ansässigen Zellen genannt Mikroglia, die ihre Umwelt in ihrem Ruhezustand verästelten (2A) zu überwachen und sind von Sensorstörungen fähig das könnte Probleme der sehr wertvollen Homöostase notwendig für die richtige neuronale Funktion 76-78. Mikroglia - Aktivierung, durch die Annahme einer Amöbenform (2B) und die Vermehrung der Zellpopulation gekennzeichnet bezeichnet Mikrogliose (Abbildung 3), gefolgt von der Freisetzung von pro-inflammatorischen Mediatoren, wie Zytokine, bildet den Hauptaspekt neuroinflammation 79 . Zytokinausschüttung dient dem edlen Zweck der Neuronen vor schädlichen Angriffen zu schützen und ist closely überwacht. Wenn jedoch neuroinflammation diese strenge Kontrolle entzieht, nimmt es eine destruktive Natur und das ZNS ernsthaft verletzen kann. Insofern als neuronales Gewebe eine sehr begrenzte Erneuerungspotential haben, ist das CNS umso anfälliger für solche autodestruktiven Entzündungsreaktionen. Das Studium des Übersprechens, besteht, dass zwischen den Neuronen und Mikroglia ist zwingend notwendig, in den zugrunde liegenden Mechanismen der neuroinflammation Aufklären. Im Gegensatz zu Mischkulturen, einfügen Co-Kultur-Systeme ermöglichen die Ermittler zu identifizieren, welche Zellpopulation, die toxischen Effekte zu erzeugen und was betroffen ist. Hier unterscheiden PC12-Zellen für 7-9 Tage mit Nervenwachstumsfaktor wurden cokultiviert mit LPS-aktivierten Mikroglia N9 mit dem Ziel quantifyingthe schädlichen Wirkungen von entzündungs ​​abgeleiteten löslichen Faktoren auf Neuronen. Dazu wurden neuronale PC12-Zellen in 24-Well-Platten kultiviert, während N9 Mikroglia in Einsätze ausgesät. N9 microglia wurden für 24 h mit LPS, ein sehr potenter proinflammatorischer Endotoxin besteht in den äußeren Membranen von gram-negativen Bakterien behandelt. LPS ist bekannt , so Toll-like - Rezeptor zu aktivieren 4 eine robuste entzündliche Reaktion in einer Vielzahl von Effektorzellen des Immunsystems Zellen hervorrufen, einschließlich der verewigte murine Zelllinie N9 Mikroglia 80,81. Die folgenden repräsentativen Ergebnisse zeigen , dass N9 aktivierte Mikroglia mit LPS haben die Tendenz , ihre Population (3) zu erhöhen und löslichen proinflammatorische Zytokine, wie Interleukin-6 (IL-6), Interferon gamma (IFN-γ) zu sezernieren , und Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), die leicht die Membran der Kokultur Inserts kreuzen und zytotoxische Schäden an neuronalen PC12-Zellen wachsen in der unteren Kammer führen. Das wichtigste Anliegen vor der LPS-aktivierte N9 Mikroglia zu den Vertiefungen, die neuronalen PC12-Zellen übertragen besteht in der Bestätigung thaT die PC12 richtig unterschieden. Sieben Tage differenzierten PC12 - Zellen sollte offensichtlich neuronale Phänotypen zeigen, wie eine flachere Zellkörper, die manchmal mehrere lange Neuriten Projekte selbst Varikositäten (Abbildung 4) angezeigt wird . Sobald dieser Kontrollpunkt durchgeführt wird, N9 Mikroglia Einsätze frisches Medium ohne LPS enthalten, können in die Vertiefungen, die differenzierte PC12 übertragen werden. Nach einer Inkubationszeit von 24 h oder 48 h wurde der Überstand in der unteren Kammer geerntet und einem Cytotoxizitätstest, bezogen auf Lactatdehydrogenase Freisetzung 15,16 sowie einem 15 ELISA, Zytokine zu messen durchgeführt. Es ist wichtig, den Überstand in der unteren Kammer, um zu ernten, die Zytokine zu messen, die tatsächlich die permeable Membran durchquert haben, und die Rezeptoren auf der Oberfläche von PC12-Zellen aktivieren kann. Ergebnisse zeigen, dass LPS-aktivierten Mikroglia N9 von der oberen Kammer eine dosis- und zeitabhängige cyt erzeugenotoxic Wirkung auf die differenzierten neuronalen PC12 - Zellen setzen in der unteren Kammer (Abbildung 5). Die 0,5 &amp; mgr; g / mL LPS Bedingung ist jedoch nicht signifikant zytotoxisch bei 24 h oder 48 h. Ebenen der Zytotoxizität wurde gefunden, dass nahezu 100% in der 2 &amp; mgr; g / ml LPS 48 h Zustand erreichen. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass die Konzentration von entzündungsfördernden Zytokine IL-6, IFN-γ und TNF-α in dem Überstand erhöht sich gleichzeitig mit der beobachteten Zytotoxizität. Insbesondere werden IL-6 - Konzentrationen nach 24 Stunden deutlich erhöht nur für die 2 &amp; mgr; g / ml erhalten, während 1 &amp; mgr; g / ml LPS signifikant erhöhte Spiegel des Cytokins nach 48 h (6) ergibt. Mikroglia sekretieren IFN-γ, die die untere Kammer in einem signifikant erhöhten Weise erreicht , wenn sie mit 1 &amp; mgr; g / ml und 2 &amp; mgr; g / ml behandelt werden, und sind mit differenzierten neuronalen PC12 - Zellen inkubiert entweder 24 Stunden oder 48 Stunden (Abbildung 7). Die 0,5 &amp; mgr; g / mlLPS Zustand erneut nicht IFN-γ-Spiegel signifikant erhöhen. Schließlich TNF-α - Konzentrationen in der unteren Kammer wurden durch ELISA quantifiziert und die ergänzt durch LPS - Aktivierung der Mikroglia und erreichte Niveaus fast sieben-fach wichtiger als der Steuerzustand (Figur 8) gefunden werden. Insbesondere die beiden 24 h und 48 h Inkubationszeiten verursacht wichtige Erhöhungen der TNF-α-Spiegel im Überstand. Allerdings ergab die 1 ug / ml LPS Zustand einen signifikanten Anstieg von TNF-α Ebenen erst nach 48 h. Als Ganzes zeigen diese Ergebnisse, dass die sekretierten pro-inflammatorische Zytokine sind zumindest teilweise verantwortlich für die zytotoxischen Wirkungen in differenzierten neuronalen PC12-Zellen beobachtet nach einer 24 h oder 48 h Inkubation mit durch unterschiedliche Konzentrationen von LPS aktivierte Mikroglia. Einfügen Kokultur Systeme LPS-aktivierten Mikroglia N9 und PC12 Zellen gezeigt wurde,besonders nützlich sein bei der Untersuchung von neuroinflammation und Strategien bei der Ausarbeitung es entgegenzuwirken. Unsere Gruppe zeigte vor kurzem , dass LPS-aktivierten Mikroglia N9 in Zellkultur - Einsätze durch Kreuzung der Mikroporen des Einsatzes 15, 16 die Apoptose von Nervenwachstumsfaktor-differenzierten PC12 - Zellen zeigen gezüchtet erhöhte Transkription von pro-inflammatorischen Zytokinen, die wiederum induzieren. In der gleichen Paradigma, Vorbehandlung der Mikroglia-Population mit der polyphenolischen Verbindung Resveratrol (0,1 &amp; mgr; M, 3 h), verhindert die Transkription von pro-inflammatorischen Zytokinen und damit behindert Apoptose von differenzierten neuronalen PC12-Zellen durch Caspase-3-Aktivierung blockiert, und danach , DNA-Spaltung. Eine andere Gruppe wurde auch die neuroprotektive Wirkung von Vitamin E in einer N9-PC12 Kokultur 26 gezeigt. Neben N9-PC12 Kokulturen wurden verschiedene immortalisierte Zelllinien oder Primärkulturen auch in einem Kontext der Neuroinflammation eingesetzt. Beispielsweise diemurine Mikroglia BV2 Zellinie cokultiviert mit humanen Neuroblastom - SH-SY5Y - Zellen anscheinend durch seine entzündungshemmende Potential 17 vermittelt die anti-apoptotische Wirkung der Polyphenol Luteolin zu zeigen. Wie gut, BV2 von verletzten PC12 - Zellen aktivierte Mikroglia wurden 18 gezeigten anti-apoptotische Effekte in mesenchymalen Stammzellen auszuüben. Die wechselseitige Signalisierung wurde gezeigt , in der anti-apoptotische Mechanismen der primären Mikroglia Neuroprotektion verliehen auf primären zerebellären Körnerzellen 19 wichtig. Weiterhin wurden primäre hippocampale Neuronen kokultiviert mit primären Mikroglia durch sekretierte Amyloid Precursor Protein aktiviert , um die Freisetzung von Glutamat durch Cystein Austausch und die nachfolgende Abschwächung der synaptischen Funktion 20 zu bewerten. Schließlich zeigte eine Gruppe auch das Übersprechen zwischen primären Neuronen im Hippocampus und primären Mikroglia im Zusammenhang mit Fractalkine Signalisierung, ein Chemokin konstitutiv Expres existiertSed durch Neuronen im ZNS dessen Rezeptor auf der Oberfläche der Mikroglia 21 gefunden wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig1.jpg" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung eines Einsatzes Co-Kultursystem. Das obere Abteil des Einsatzes zusammengesetzt , die einen Zelltyp und ihrer apikalen humoralen Umgebung hält. Die untere Kammer besteht aus einer Vertiefung oder Schale der zweite Zelltyp enthält. Der Einsatz ruht auf den Kanten des Multiwell-Gewebekulturplatte oder Schale. Der Einsatz ist so konzipiert, gerade über dem Boden der Vertiefung zu liegen, um nicht die Population von Zellen unter wachsen zu berühren. Das Medium in der unteren Kammer in Kontakt sowohl mit der Grundfläche des ersten Zelltyp und der apikalen Oberfläche der zweiten Zelltyp. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um einen größeren vers anzuzeigen</a>Ion dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mikrophotogramme N9 Mikroglia. (A) Unbehandelte ruht N9 Mikroglia in Einsätze weisen eine verästelte Zellmorphologie so dass sie aktiv ihre Umgebung zu überwachen. (B) N9 Mikroglia in Einsätze behandelt mit Lipopolysaccharide (LPS) für 24 - Stunden - Anzeige eine Amöbenform typisch für die aktivierten Phänotyp. Diese Mikrophotogramm genommen wurde kurz vor dem Einsatz Übertragung dieser aktivierten N9 Mikroglia zu den Vertiefungen , die differenzierte PC12 - Zellen , wie in 4 dargestellt ist . Maßstabsbalken = 25 &amp; mgr; m enthält. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <imgalt = &quot;3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54356 / 54356fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. N9 Mikroglia Zelldichte nach der Behandlung mit Lipopolysaccharid (LPS). Die Wirkung von N9 Mikroglia mit verschiedenen Konzentrationen von LPS für verschiedene Zeitspannen der Behandlung wurde durch Abschätzen der Zahl der Zellen beurteilt unter Verwendung einer Zählkammer 69. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einwegvarianzanalyse festgestellt, gefolgt von Tukey post-hoc-Analyse mit der GraphPad Instat Programm, Version 3.06 für Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle Daten, auf dem 95% Konfidenz-Intervall analysiert, ausgedrückt werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus 3 unabhängigen Experimenten, in denen 10 Vertiefungen betrachtet wurden. Sternchen zeigen statistische Unterschiede zwischen der Behandlungs- und Kontrollbedingung (** p &lt;0,01). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig3large.jpg" target="_blank">eine larg anzuzeigen</a>er Version dieser Figur. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig4.jpg" /> Abbildung 4. Mikrophoto von differenzierten neuronalen PC12 - Zellen. Sieben Tage Nervenwachstumsfaktor differenzierte zeigen neuronale PC12 - Zellen offensichtlich neuronale Phänotypen wie lange Neuriten und Varizen. Diese Mikrophotogramm wurde genommen , kurz bevor die Einsätze enthalten , aktiviert N9 Mikroglia übertragen wie in Abbildung 2 dargestellt. Maßstabsbalken = 25 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig5.jpg" /> Abbildung 5. zytotoxische Wirkung von Lipopolysaccharid (LPS) -aktivierten Mikroglia auf differenzierte neuronale PC12 - Zellen.N9 Mikroglia mit verschiedenen Konzentrationen von LPS aktiviert wurden für 24 h, dann in die Vertiefungen überführt, die differenzierte neuronale PC12-Zellen für 24 h oder 48 h. Die Zytotoxizität wurde unter Verwendung eines Lactatdehydrogenase-Freisetzungs-Assay auf dem Überstand der unteren Kammer durchgeführt bewertet. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einwegvarianzanalyse festgestellt, gefolgt von Tukey post-hoc-Analyse mit der GraphPad Instat Programm, Version 3.06 für Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle Daten, auf dem 95% Konfidenz-Intervall analysiert, ausgedrückt werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus 3 unabhängigen Experimenten, in denen 6 Vertiefungen betrachtet wurden. Sternchen zeigen statistische Unterschiede zwischen der Behandlungs- und Kontrollbedingung (*** p &lt;0,001). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 6. Die Konzentration von i nterleukin-6 (IL-6) im Überstand nach N9 Aktivierung durch Lipopolysaccharid (LPS). N9 Mikroglia wurden für 24 h mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS aktiviert und dann in die Vertiefungen überführt , die differenzierte neuronale PC12 Zellen 24 Stunden oder 48 Stunden. IL-6-Konzentrationen in dem Überstand des unteren Abteils wurden unter Verwendung eines ELISA untersucht. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einwegvarianzanalyse festgestellt, gefolgt von Tukey post-hoc-Analyse mit der GraphPad Instat Programm, Version 3.06 für Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle Daten, auf dem 95% Konfidenz-Intervall analysiert, ausgedrückt werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus 3 unabhängigen Experimenten, in denen 6 Vertiefungen betrachtet wurden. Sternchen zeigen statistische Unterschiede zwischen der Behandlung und control Zustand (*** p &lt;0,001, ** p &lt;0,01 und * p &lt;0,05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig7.jpg" /> Abbildung 7. Die Konzentration von Interferon - gamma (IFN-γ) im Überstand nach N9 Aktivierung durch Lipopolysaccharid (LPS). N9 Mikroglia wurden für 24 h mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS aktiviert und dann in die Vertiefungen überführt , die differenzierte neuronale PC12 - Zellen für 24 h oder 48 Stunden. IFN-γ-Konzentrationen in dem Überstand des unteren Abteils wurden unter Verwendung eines ELISA untersucht. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einwegvarianzanalyse, gefolgt vom Tukey-post-hoc-Analyse mit der GraphPad Instat Programm, Version 3.06 ermitteltenfür Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle Daten, auf dem 95% Konfidenz-Intervall analysiert, ausgedrückt werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus 3 unabhängigen Experimenten, in denen 6 Vertiefungen betrachtet wurden. Sternchen zeigen statistische Unterschiede zwischen der Behandlungs- und Kontrollbedingung (** p &lt;0,01 und * p &lt;0,05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig8.jpg" /> Abbildung 8. Die Konzentration des Tumor - Nekrose - Faktor alpha (TNF-α) im Überstand nach N9 Aktivierung durch Lipopolysaccharid (LPS). N9 Mikroglia wurden für 24 h mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS aktiviert und dann in die Vertiefungen überführt , die differenzierte neuronale PC12 Zellen 24 h oder 48 h. TNF-αKonzentrationen in dem Überstand des unteren Abteils wurden unter Verwendung eines ELISA untersucht. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einwegvarianzanalyse festgestellt, gefolgt von Tukey post-hoc-Analyse mit der GraphPad Instat Programm, Version 3.06 für Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle Daten, auf dem 95% Konfidenz-Intervall analysiert, ausgedrückt werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus 3 unabhängigen Experimenten, in denen 6 Vertiefungen betrachtet wurden. Sternchen zeigen statistische Unterschiede zwischen der Behandlungs- und Kontrollbedingung (*** p &lt;0,001). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig8large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54356/54356fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

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Serie: Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Zwei Arten von Assays zum Nachweis von Frog Sperm Chemotaxis

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...