SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96-היטב ארוך פריימר PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא קדם 96-היטב קריר PCR במקפיא -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 10 מ&quot;ל, להכין מיקס מאסטר: 2,100 μl DDH 2 O, 105 μl PCR כיתה DMSO, 105 μl 10 מ&quot;מ dNTPs, 105 μl תבנית pPOT (25 ng / μl) 9 עבור בנפח כולל של 2,415 μl לכל צלחת . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 23 μl לבאר כל צלחת 96-היטב PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 100 מיקרומטר ונקוו פריימרים לכל טעון היטב בעזרת פיפטה רבה P20 12 ערוץ. חותם עם הסרט, מקום צלחת על קריר PCR מראש צונן ולאפשר להקפיא למשך תקופה מינימלית של 20 דקות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 10 מ&quot;ל, להכין מיקס מאסטר B: 2,048 μl DDH 2 O, 525 μl 10x חיץ, 52.5 פולימראז μl עבור בנפח כולל של 2,626 μl לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת קרירה PCR מהמקפיא -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצלחת עדיין על מקרר PCR, להוסיף 25 μl מיקס מאסטר B על גבי קפאn מיקס מאסטר A עבור נפח תגובה כולל של 50 μl. זהו זמן קריטי, ואת אמור להסתיים לפני לערבב יכול להפשיר. חותם צלחת עם סרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר Cycler תרמית כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואחריו תקופת הארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת ה- PCR לאחר הבלוק הגיע 94 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. אימות של 96-היטב ארוך פריימר PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עופרת 1% גדול (w / v) agarose ג&#39;ל טריס Acetate EDTA (TAE) הפעלת המאגר במסרקות 4 x 28-גם לתת ג&#39;ל עם 4 שורות של בארות. יישר שיניים חלופיות של המסרק בקצות טפטפו רב 12 ערוץ. בזהירות להטביע את ג&#39;ל בטאי הפעלת המאגר לאחר נתיבים נטענים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סולם DNA 1 טען kb לתוך -1 ו -28 th היטב של כל שורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב ערוצי P20 12 ערוץ, להעביר 2 μl של dir המוצר PCRectly לכל נתיב של (איור 1 א) ג&#39;ל. עשה זאת מהר כדי לצמצם את האפשרות של זיהום amplicons. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מוצרי ה- PCR משורה א &#39;של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי בעל מספר אי זוגי של השורה ה -1 של ג&#39;ל (A1 - מסלול 3, A2 - מסלול 5 ...... A11 - ליין 23, A12 - ליין 25) ולטעון את מוצרי ה- PCR משורה ב &#39;של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי הזוגיים של שורה 1 st של הג&#39;ל (B1 - מסלול 4, A2 - מסלול 6 ...... B11 - ליין 24, B12 - ליין 26). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מוצרי ה- PCR מן השורה C ו- D של הצלחת ה- PCR באמצעות אותו דפוס כפי שתואר לעיל, עם שורה C לתוך נתיבי האי-זוגיים ושורה D לתוך נתיבי הזוגיים. המשך דפוס טעינה זה עד היטב כל צלחת ה- PCR נטען על ג&#39;ל. חיץ טעינת ה- DNA אינו נדרש לטעון ג&#39;ל זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג&#39;ל לתוך הטנק ריצה למלא את המיכל עם TAE הפעלת המאגר עד ג&#39;ל הוא שקוע. הפעל ב -100 V למשך 30 דקות ולאחרלדמיין באמצעות transilluminator UV. ראה איור 1B עבור ג&#39;ל למשל. הערה: מוצרי ה- PCR יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני transfection </li></ol> 3. Transfection 96-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ט תא brucei טופס procyclic קו 10 SMOXP9 עבור הליך זה ולגדול התקשורת SDM-79 המכיל 10% 10 FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 x 10 7 תאים לכל transfection (סה&quot;כ 1.1 x 10 9 תאים) בעת תיוג על הקצה האמין של החלבון ו -2 x 10 7 תאים לכל transfection (סה&quot;כ 2.2 x 10 9 תאים) בעת תיוג על התחנה הסופית ג &#39; החלבון. לשמור על התאים ב-יומן באמצע (1.2 x 10 6 -1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל) במשך כמה ימים לפני transfection ו לקצור את התאים עבור transfection בצפיפות של 5-8 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מוצרי ה- PCR קפוא עבור transfection להפשיר בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות haemocytometer או נגד תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה נדרש מספר תאי צינורות 50 מ&quot;ל מספר 800 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה להשליך supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ&quot;ל cytomix שונה (0.8 מ&quot;מ EGTA, 24 KCl מ&quot;מ, 0.15 מ&quot;מ CaCl 2, 10 מ&quot;מ pH7.6 חיץ אשלגן פוספט, 25 מ&quot;מ HEPES-KOH pH7.6, 2.6 מ&quot;מ MgCl 2, 0.5% (w / v) גלוקוז, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA, 1 מ&quot;מ hypoxanthine, 144 סוכרוז מ&quot;מ) לכל צינור. להעביר את כל פתרונות לתא צינור יחיד ספין שוב ב 800 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להשליך supernatant ו resuspend התאים 23 מ&quot;ל של cytomix שונה ריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים ספינינג, להוסיף 1 מ&quot;ל של SDM-79 התקשורת היטב כל 4 x 24 גם צלחות בתרבית רקמה. לייבל צלחות לספירה ולהסיק טבעת סביב היטב A1 על כל צלחת בטוש לסייע להתמצאות צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המטפל הצלחת אל electroporator. על electroporaיחידת טור להגדיר את המתח ל -1,500 V, אורך הפולס ל -100 μsec ומספר פולסים עד 12 ואת המרווח הדופק ל -500 מילי-שניות. על מטפל הצלחת, להגדיר את ספירת הדופק ל -1 זה מבטיח כי electroporator יחול דופק יחיד בין 12 העמודים של צלחת electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב ערוצי ערוץ 12 P200, להעביר את התגובות PCR מהצלחת PCR על צלחות electroporation הפנויה 96-היטב, 4 מ&quot;מ הפער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים כבר הסתובב הם resuspended לריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל (שלב 3.7), להעביר למאגר מגיב. פיפטה 200 μl של פתרון התא לתוך הבאר כל צלחת electroporation באמצעות פיפטה רב ערוץ 12 P200, לערבב עם מוצר ה- PCR על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רקמות להסיר כל טיפות מהחלק העליון של הצלחת להימנע-קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בסרט איטום מסופק באריזה צלחת לראש צלחת electroporation, positioning זה כדי להשאיר את החורים עבור אלקטרודות שנחשפו בחלק העליון והתחתון של כל עמודה. הימנע מכסה את הנקודות שהועלו נהג להנחות את הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת electroporation לתוך מטפל הצלחת ולסגור את המכסה. &#39;דופק&#39; לחץ על יחידת electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation, במהירות ולהעביר את התאים מצלחת electroporation 96-היטב צלחות תרבית 4 x 24 גם רקמה. כדי להעביר את התאים, להשתמש פיפטה רב ערוץ 12 P200 עם כל הטיפ השני חסר כאלה כי 6 טיפים הנותרים ליישר קו עם 6 שורות על צלחת בתרבית רקמה 24 גם. העברת תאי electroporated ב צלחות electroporations 96-היטב תבנית מוגדרת מראש על הצלחות בתרבית רקמת 24 גם (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הטיפים פיפטה P200 - לכל transfection 96-גם להכין 2 קופסאות של 96 טיפים עם כל עמודה אחרים יוסרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 על צלחת electroporation 96-היטבצלחת שורת הצלחות תרבות 24 גם רקמות, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 לתוך שורה B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 לתוך שורה C ו- D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן נשטפים עם התקשורת מבארות מקביל 24- גם צלחת ואת לשטוף מועבר בחזרה אל בארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת B, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 לתוך שורה B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 לתוך שורה C ו- H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת &quot;טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 על צלחת electroporation 96-היטב לשורה C צלחת 24 גם, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 לתוך שורה B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 לתוך שורה C ו- D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מן 96 צלחת &quot;טוב לצלחת 24 באר, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן לשטוף עם התקשורת מבארות מקביל צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועבר לאחר מכן חזרה אל בארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת D, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 לתוך שורה B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 לתוך שורה C ו- H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת &quot;טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך, לבחון 1 היטב מכל עמודה לבדוק את התאים. יהיו תערובת של תאים חיים ומתים עםכמות משמעותית של פסולת התא. ניתן להבחין בתאי חיים מן התאים מתים משום שהם יהיו בהירים תחת מיקרוסקופ לעומת השלב יתקדמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את 24 גם צלחות בקופסא נקיה, פלסטיק עם מכסה המהווה חותם חזק. להניח את התיבה C חממה 28 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 6-8 שעות מאוחר יותר, להוסיף 1 מ&quot;ל של SDM-79 עם 10% FCS המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית 2x היטב כל אחד. מניסיוננו, שורות תאים שבם הגנים מתויגים על הקצה האמין עמידות ריכוזים גבוהים יותר של תרופה סלקטיבית. לכן, באמצעות blasticidin כדוגמא, תיוג על הקצה האמין דורש ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin ותיוג על התחנה הסופית C דורש ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin. הערה: שורות תאים מהונדסות תהפוכנה 9-10 ימים גלויים לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר לפחות פעמי תרופה טריה תקשורת לפני הניתוח. איור 2B מראה את התוצאות של transfe 96-היטב טיפוסיction לתיוג 96 חלבונים שונים על הקצה האמין. להעריך כל טוב על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לקבוע אם הוא מכיל תאים עמידים בריאים, סמים. באר בריא מכיל בעיקר (&lt;95%) תאים פעילים מאוד כי הם בהירים במיקרוסקופ חוזה שלב. ניתוח לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או כתם המערבי נדרש לקבוע אם החלבון תויג בהצלחה. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome.">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li><li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance.">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li><li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+enabling+efficient,+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids.">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197 (2015).</li><li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor.">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037 (2012).</li><li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li><li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שיפור דרמטי את הרגישות של חקר החלבונים ושיטות transcriptomics ב 5-10 השנים האחרונות סיפקה נתונים חשובים על אלפי גנים ומוצריהם. עם זאת, את הכלים כדי להתמודד עם תפקודם של חלבונים אלה לא עמדו בקצב. תיוג חלבון הופך לפשוט ניסויים רבים כדי לקבוע את תפקידו. לדוגמא, חלבון יכול להיות התמזג חלבון פלואורסצנטי במגוון צבעים שונים כדי להקל על מחקרי לוקליזציה שיתוף לוקליזציה. תגיות שפותחו עבור במיקרוסקופ אלקטרונים, כגון APEX2 או miniSOG 11,12, לאפשר לוקליזציה ultrastructural של החלבון המתויג. תגיות עבור ביוכימיה, כגון תג TAP, ו ProtC-TEV-ProtA (PTP) לתייג 7,13 לאפשר טיהור של מתחמים הקשורים החלבון לזיהוי שותפים מחייבים או מבחני ביוכימיים במבחנה. הצעדים הספציפיים הם קריטיים להצלחת protocol הוא: השילוב של DMSO לתערובת 1 מאסטר PCR, מקפיא של מיקס מאסטר PCR 1 לפני התוספת של מיקס מאסטר 2, השימוש פולימראז המסחרי מיקס מאסטר 2 ואת השינוי של חיץ electroporation cytomix. מניסיוננו, יש צורך להשתמש כפול ממספר תאים עבור transfections תיוג מסוף C ובאשר transfections תיוג מסוף N על מנת להשיג שיעור דומה של בארות חיוביות. לכן, כל הצעדים צריכים להתבצע כפי שתוארו. טכניקה זו עשויה היחידה להצליח כאשר transfecting trypanosome טופס procyclic חרקים. יש צורות דם יעילה transfection נמוך 14, יתר על כן הם צפויים למות במהלך בחירה בשל רעילויות צפיפות תלויה כי אינה קשורה לתרופה סלקטיבית. לכן, הפרוטוקול הקודם שלנו מייצג את הטכנולוגיה הטובה ביותר הנוכחית עבור תיוג של trypanosomes טופס דם 9. כמו כן סביר להניח כי טרנסיעילות fection תשתנה תלוי לבודד trypanosome הספציפי. פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות 927 SMOX צורות procyclic - זנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. צעדים שעשויים להגביר את סיכויי הצלחת כוללים: הגדלת הסכום של amplicon PCR, הגדלת מספר התאים הכלולים transfection. אנו מציגים שיטה שבה מאה חלבונים יכולים להיות מתויגות במקביל. זה יקל מחקרים בקנה מידה גדול על לוקליזציה ואינטראקציה, המשלימה מערכי נתונים גדולים קיימים ומתן מידע שלא יסולא בפז לקהילה. תבניות פריימר יימסרו לכל מבקש ורשימת תבניות פלסמידים זמין מ: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei הוא טפיל protozoan שגורמת trypanosomasis אדם אפריקאי nagana בבקר. ט brucei הוא אורגניזם אידיאלי לניתוח תפקוד חלבון עקב השילוב של הגנום באיכות גבוהה, פרוטאומיקה רב מערכי נתוני transcriptomics וכלים מולקולריים מפותחים 1-3. התקדמות פרוטאומיקה וסדר גרמה מערכי נתונים גדולים המדגישים גנים מעניינים פוטנציאל 4-6; יש עם זאת, גנים רבים מידע מינימאלי הקשורים בהם במסדי הנתונים הקיימים. לכן יש צורך שיטת תפוקה גבוהה כדי לסייע ואפיון חלבונים פונקציונלי. ביטוי של חלבון מתויג יכול לתת ריבוי תובנה הפונקציה של חלבון. לדוגמה, חלבון מסומן בחלבון או epitope ניאון יכול להיות מקומי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר נותן מידע על המקום ממנו protעין עלולה להיות הפעלת ההשפעה הביולוגית שלה. לחלופין, חלבון מתויג עם ברז 7, HaloTag 8 או התג שלו יכול להיות מטוהר עבור מבחני ביוכימיים ואיתור שותפי האינטראקציה שלה. אנחנו לאחרונה פתחנו מתודולוגיה תיוג חזקה ט brucei 9. זה זמן רב בשימוש פריימר PCR על מנת ליצור את ה- DNA עבור transfection ואפשר התיוג של עשרות חלבונים במקביל - שיפור משמעותי כדי פרוטוקולים קיימים. עכשיו שיפרנו את יכולת ההרחבה של פרוטוקול זה בצורות procyclic ידי סדר גודל. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו שבו אנחנו מבצעים את PCR ו transfection לתוך צלחות 96-היטב, עם ההתאוששות והבחירה המתרחשים 24 גם צלחות. צירופם של מאות חלבונים יכול עכשיו להיות מתויג במקביל שיטה זו מספקת חסכונית ריאלי שיטה תיוג הגנום trypanosome כולו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td style="width:167px;">desalt only (do not use additional purification)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">Included with the Expand HiFi pack</td>
			<td>Must be PCR grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP</td>
			<td style="width:115px;">any reputable</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand HiFi polymerase</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11759078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BTX ECM830</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HT-200 plate handler</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">HT-200</td>
			<td>Handles the 96-well eletroplates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MOS 96 ELECTROPLATE 4mm</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">45-0452</td>
			<td>Electroplate for the 96-well electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Melford</td>
			<td style="width:119px;">3513-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin b Gold</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phleomycin</td>
			<td style="width:115px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P0187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24 well culture plates</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Eppendorf&#174; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well Multiply&#174; PCR plate with lateral skirt</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.1979.203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

בשנת transfection נציג זה, פריימרים תוכננו באמצעות סקריפט perl תגית 9 ו מסונתז מסחרית. 96-גם PCR בוצע ומאומת כמתואר (איור 1 א); בדוגמה זו, 95/96 PCRs היו מוצלחים (איור 1B). מניסיוננו, חוזר תגובות נכשלו גם עם פריימרים המקורי או פריימרים-מסונתז מחדש לא לגרום PCR מוצלח. Amplicons הועבר לתוך צלחות electroporation 96-היטב עבור electroporation (איור 2 א) ולאחר מכן מועבר צלחות תרבות 24 גם להתאוששות ובחירה. אחרי מספיק זמן כדי לאפשר את הבחירה להתרחש, הבארות דורגו להישרדות לפני ניתוח נוסף. בדוגמה זו, 88/96 בארות (92%) היו חיוביות לאחר בחירת 15 ימים. <ialt מ&quot;ג = &quot;איור 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54,342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1: אימות של פריימר ארוך PCR (א) תבנית להעברת מוצרים PCR מ 96-גם צלחת PCR על ג&#39;ל agarose למתן תוקף של PCR.. (ב) ג&#39;ל אימות 96-היטב PCR נציג תיוג 95 גנים על הקצה האמין, ו -1 amplicon המכיל מס &#39;5 &quot;הומולוגית מיקוד לפעול כביקורת שלילית transfection. הדגימות הועמסו על 1% (w / v) agarose ג&#39;ל והחליטו ב -100 V למשך 30 דקות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> איור 2: 96-היטב electroporation ובחירה (א) תבנית להעברת תאי electroporated מ -96 היטב plat electroporation.דואר צלחות בתרבית רקמה 24 גם. (ב) סכימטי מראה ניקוד חי / מת בדרך כלל אחרי 15 ימים של בחירת 24 גם צלחות. הירוק מייצג transfection מוצלח, אפור מייצג היטב עם תאים מתים בלבד. בדוגמא זו, 88/96 (92%) של בארות כלולות טפילי transfected בהצלחה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Views.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Video: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

בחינת מבנה ה-G-הסככה הטלומרים ב Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...