plusTipTracker MT解析ソフトウェアを開発するために、これらの研究に用いられる蛍光cDNA構築物の多くの、そしてキャサリンアップルゲートとGaudenz Danuserを提供するための指導や議論のための博士クレアM.ウォーターマン、ミシェル・ベアードとマイク・ダビッドソンに感謝します。この作業は、部分的には、国立心臓肺血液研究所（NHLBI）と国立衛生研究所（NIH）からKAMへの助成金によって、サポートされていました。 （グラント：4K22HL113069）。

The authors declare that they have no competing financial interests.

形態と移行実験でのHUVECを使用します。 HUVECを内EB3標識MT成長ダイナミクスの生細胞のイメージングは​​、それらが次にECMシグナリングキューに割り当てることができるように、MTの成長及びHUVECの形態の変化を測定し、評価するために適切で再現可能な細胞培養条件を必要とします。 HUVECを、細胞の形状と運動性を研究するための優れたモデルを表します。彼らは両方の可溶性および物理的なシグナリングの合図に応答して劇的な形態を呈し、蛍光標識cDNAでのトランスフェクションに非常に適している、と彼らは、適切な細胞培養条件65-70を提供する際、血管管の中に自分自身を整理する能力を維持します。などのHUVECのような初代細胞培養物は、細胞が健康であることを保証するために、彼らは実験中に正常に動作することを慎重な取り扱いと細胞継代数の監視を必要とします。例えば、cytoskeleを調べる実験を行いますHUVECをは一般的に15に通路12の周囲に不均一な形態を表示するために始めるとトンおよび/または細胞形態は、HUVECを、第十細胞培養継代を超えた実験のために使用すべきではありません。 細胞密度はまた、HUVECの健康と増殖の重要な調節因子です。調査を分岐HUVEC（上記プロトコル10.1から10.4を参照）は、ECMと相互作用して、分枝状突起を拡張するために、細胞を物理的空間を提供するために、比較的低い細胞密度培養物を使用します。これとは対照的に、（プロトコルの10.5から10.8を参照）創傷縁の移行研究において、HUVECを前に創傷に、単層培養されています。このように、創傷縁HUVECを、比較的非分岐形態を示し、先端の突起を拡張し、それらが創傷に遊走するようにそれらのすぐ隣との細胞間相互作用を示します。 リビングのHUVECにおけるトラッキングMTダイナミクスの注意事項とメリット。 ディスク顕微鏡を回転することに優れたアプローチであります高時間分解能での共焦点画像の鮮明さを必要とする実験的な仮説をテストします。適切なカメラとレーザモジュールと、この顕微鏡法は、低放射蛍光に敏感であり、蛍光顕微鏡の他のタイプと比較して低減退色するのを助けることができます。異なる種々の細胞型において、EB3標識アプローチを使用して、MTの増殖動態の包括的測定値を生成するために必要とされる重要なことに、このアプローチは、高時間分解能イメージング中程度によく適しています。 標識成長MTプラス端のEB3方法は、蛍光標識MTの他の方法に比べて顕著な利点を有するが、それはまた、固有の欠点を有します。例えば、積極的に分解MTの集団と安定、非ダイナミックのMT 71-74の集団の両方を含む、任意の時点で成長していないMT配列の割合があります。 EB3は、MTのこれら2つの集団にラベルを付けないであろうとしたがって、これら2つの集団の貢献は、実験データの分析には含まれません。全体MTのアレイを評価するための代替方法は、MTの全ての集団に組み込まれており、成長縮小、および安定MTの識別を可能にする、蛍光標識チューブリンの発現に焦点を当てています。しかし、全体MT配列を標識微小管組織化中心（MTOC）にセルの中心と隣接する周辺MTアレイの比較的高い密度の細胞の近くにはないMTの端部の画像解析を行う際に不都合を作成周辺75-77。生細胞内の蛍光チューブリンと蛍光EB3とMTの2色同時標識を用いた実験は、チューブリン標識MTの大半はまたEB3標識78であることを、定性的に明らかにしました。さらに、蛍光チューブリンで標識されたMTの自動追跡の効率的な方法がなかったです。これは、そのデータcol​​lec手段蛍光チューブリンを発現する細胞におけるションとMTダイナミクスの測定は、個々のMTの手の追跡、エラーが発生しやすいと面倒なプロセスを必要とします。その結果、EB3標識MTの自動化コンピューター分析は、それが多くの細胞タイプで、実験計画35,79の種々内MT動態実験に適用することができるように、MT動態を測定するための好ましい方法となっています。 HUVEC形態および移行にMT成長ダイナミクスのリンク。 細胞骨格の研究者の観点から、plusTipTracker自動追跡分析の1極めて有用な適応は、全細胞およびMTの成長ダイナミクスの地域変化の両方を測定し、評価する能力です。偏光になるため、細胞のための要件は、指向性細胞遊走に不可欠な前提条件です。このように、偏光シグナルキューが長い方向の細胞遊走のための重要な駆動因子として知られている30,31,51,54,56,80,81 </SUP&gt;。例えば、VEGFのような水溶性のシグナル伝達分子は、アクチン重合および内皮細胞型2,82-87におけるVEGFキューに向かってMTの成長を誘導します。さらに、（例えば、コンプライアンス及び次元mechanosensing用）ECMとの物理的相互作用に応答して、HUVECを局所的にMAPが分岐状突起を伸長内のMTの成長を促進するために調節することにより、それらのMT動態を調節し、これは方向にHUVECの移動を案内しますキュー5,31,88。したがって、細胞外シグナル伝達の合図に応答して、分極が細胞骨格の動態の局所的変化の実験的評価の必要性を強調しています。 （EB3アプローチを使用して）MT成長動態およびHUVEC細胞の遊走の同時生細胞画像化は、MTSは、秒の時間スケール上に成長するので、細胞の形態及び方向移動の変化が時間の時間スケールで発生しながら、行うことが非常に困難です。しかし、両方のプロセスが密接リンケですD。また、第2タイムスケール上で蛍光標識EB3の連続的な、迅速な画像化はEB3信号の光退色をもたらします。 EB3（1〜2分取得シリーズ）30分ごとに成功しているの短いイメージングシリーズを行うことにより、この問題を克服しようとする試みが、唯一EB3の最適な発現を持っていたECの少数で達成することができ、それが有害表示されませんでした繰り返しレーザー照射5への影響。 MT成長ダイナミクスは、細胞の形態と遊走の変化に寄与するかの解釈を可能にする別のアプローチは、関心のplusTipTracker領域（ROI）ツール35（プロトコル6.6を参照）です。全細胞MT成長がMT成長トラックは次いで、抽出し、分析することが可能なユーザ定義の領域に副分割するトラックのこの方法は可能にします。例えば、セルの「非分岐」領域に対する「分岐」の比較は、MTSがより多くのを成長させることを明らかにしました低いより永続的分岐した領域内の非分岐状細胞外周5と比較して。偏創傷縁のHUVECでは、前縁及び後縁のMT成長ダイナミクスの比較はMCAKに誘導されるMTの解体後縁を前縁内で特異的に阻害するが、されていないことを明らかにしました。先頭およびRac1の、および/またはMCAKのリン酸化変異体を発現たHUVECにおけるエッジMT成長ダイナミクスを末尾の地域内の評価はさらに、オーロラキナーゼのRac1の誘導活性化を具体的かつ局所的にHUVECの偏光と方向性のある移動を駆動するために、前縁内MCAKの活性を阻害することが明らかとなりました31。このように、MTの成長のダイナミクスと分枝状突起および/または創傷縁HUVECの前縁内のMT​​成長ダイナミクスの地域評価の自動追跡の組み合わせは、私たちはHUVECの形態および移行にMTの成長のダイナミクスをリンクすることができました。 記載されているプロトコルは、デザイン性ありdはHUVECの文化や実験的調査のため、一般的に簡単で、再現性の高い方法を提供します。それにもかかわらず、プロトコルの詳細の多くは、今度は、実験的な方法論を実施するのエラーや困難のための機会を提供し、複雑で時間がかかります。それは、プロトコルを通じて潜在的な問題に対処しようとしたが、ここではあまり一般的ではないか、そうでなければ方法論のプロトコル内のノートと略記されている潜在的な問題の追加、詳細なトラブルシューティングが提供されます。 ポリアクリルアミド基板（プロトコル2.2）で被覆カバーガラスに関連して、発生する一般的な問題は、カバーガラスを活性化ガラスにポリアクリルアミドを結合する、ポリアクリルアミドを活性化し、その後、ポリアクリルアミドにECMを結合する複雑な性質です。一つの特に困難と潜在的に問題のステップは、ポリAの曝露後のフィブロネクチン/ポリアクリルアミドゲル上のHUVECを培養され、2 mMのスルホ - SANPAHにcrylamideコーティングしたカバースリップ（上記のステップ2.2.2.6）。これは、スルホ - SANPAHが完全にECMの共役以下の実験システムから削除され、これらの基板上でのHUVECの培養の成功に不可欠です。これは、最良のddH 2 Oで洗浄し、一晩振盪機上でのddH 2 O中でカバースリップをインキュベートすることによって達成することができます。ポリアクリルアミドのECM上で培養した細胞は生存する、または生存率が予想よりも小さい場合、フィブロネクチン（ステップ2.2.2.9）への結合体化の後にスルホ - SANPAHの洗濯を増加させ、繰り返されない場合は、潜在的にこの問題を軽減することが推奨されます。 プロトコル3（カバースリップ上のcDNAのトランスフェクションおよびHUVEC文化）に関連して、エレクトロポレーション手順の成功に大きな影響をプラスチックフラスコからそれらを削除するには、両方の細胞のトリプシン処理中に、HUVECの取り扱いである、との結論を以下エレクトロポレーションは（上記、3.3から3.4ステップ）。気にすることが重要です完全にトリプシンでながらたHUVECを監視し、フラスコ（通常は1~2分）の表面に「切り上げ」に細胞に必要な時間を超えません。トリプシンでの過度の時間は、典型的には、細胞は、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ（ステップ3.4）上にプレーティングされるまでに実現した後、基板に取り付けられるように失敗していないHUVEC死の主要な原因です。 エレクトロポレーション緩衝液中で長い時間のために中断したときに同じような重要なのは、HUVECを（最も主要な細胞型は）うまくいきません。ユーザは、エレクトロポレーションを必要とする5つ以上の状態を有する場合、より大きな規模の実験の間、例えば、1つずつ、個々のチューブ（トランスフェクションあたり1管）でペレット化した細胞を維持するために、それらを混合した方がよいです、エレクトロポレーションの前にすぐにエレクトロポレーションバッファーインチこのアプローチは、エレクトロポレーションバッファーと最大化HUVECの生存にインキュベーション時間を最小限に抑えます。さらに、完全培養培地中の即時の救助もCRでありますitical以下のエレクトロポレーション。レスキュー1分の遅延または複数、次のエレクトロポレーションは、ほぼ完全なHUVECの死に至ることができますので、避けるべきです。 関連細胞遊走アッセイ（プロトコル9）、極めて高い密度でHUVECを培養する技術は、フィブロネクチンコーティングしたカバースリップの乾燥を必要とする（プ​​ロトコル3を参照）、従来のHUVEC細胞培養法の（ステップ9.2に記載の）臨界変形に依存しますカバーガラスの非常に小さな領域にHUVECの培養を可能にするためです。カバーガラスが完全に乾燥されていない場合、またはフィブロネクチンとカバーガラスのコーティングの前には（2.1または2.2ステップ）効率的でなかった場合、多くの場合、カバーガラス上に置かれているメディアを含む細胞は、その表面張力を失い、に拡大しますそれにより、カバースリップ上の細胞の密度を減少させるカバースリップの縁、。この潜在的な問題を解決する一つの方法は、その後、カバーガラスからメディアを吸引することであり、5-10分間のバイオセーフティキャビネットの背面に（まだ35ミリメートル皿で）カバースリップを配置。この適応は、皿を乾燥させるのを助けるために、キャビネット内の空気の流れを可能にするように助けることができます。目に見える液体が空気乾燥した後、カバーガラス上に残っている場合、液体スポットを吸引し、再び生物学的安全キャビネットの中5-10追加分間風乾させます。完全にこの潜在的な問題を回避する方法がないことに注意することは重要ですが、それはプロトコルの反復練習の問題のあまりになるん。これは、余分なカバースリップを準備し、道に沿って問題が発生した場合には、すぐに行く余分たHUVECを持つように、（一般的に、または任意のアッセイ）細胞遊走アッセイのためにカバースリップを準備するときようにしても、トラブルシューティングの推奨事項です。 念頭に置いてこれらのトラブルシューティングの考慮事項と、議論のプロトコルおよび将来の細胞生物学研究におけるその意味の有用性を強調することも重要です。 polyacrへの適用イルアミドアプローチは、広範囲であり、（上述の）細胞ECMの関与の二次元の研究だけでなく、三次元の調査5だけでなく、。このアプリケーションは、HUVECを、生理的環境での細胞の形状および遊走を調節する方法の我々の理解を高めることに重要であると研究者らに細胞骨格の変化に調整されているかの形態学的変化の基本的な理解を提供する必要があります。ここで説明するプロトコルは、MTの増殖動態の測定に焦点を当てているが、プロトコルの大部分は、細胞 - ECM相互作用の他の微視的測定可能な態様の任意の数を測定するように適合されるべきであることができます。 MTダイナミクスに関しては、提示されたプロトコルを使用して調べることができ、少なくとも14キネシン89の家族、HUVEC極性と向かう移行に貢献する潜在的な役割を持つ各、すべてのを含め、多数のMAPがあります。 今後の捜査すべきLSO疾患状態正常対に細胞ECMの関与を対象とします。ここで提示HUVECプロト​​コルは少数を示すために、正常な血管恒常的プロセスの調査に、だけでなく、心臓病、網膜症、腫瘍の増殖と転移を含む疾患状態に適用可能です。顕微鏡的研究と従順準拠のコンジュゲートする目に見えて透明のECMおよびポリアクリルアミドの基板は、内皮細胞の血管の血管新生が高い空間分解能と時間分解能で監視することができるような細胞ECMエンゲージメント研究のためにできるようになります。実験的アプローチのこれらのタイプは、すでに重要な内皮細胞形状の違い、極性、遊走、及びこれらのプロセス5,31,90を調節するタンパク質の影響を明らかにするために始めています。今後の取組みは、ECMのコンプライアンスと次元mechanosensingの組み合わせが局所的に標的とし、細胞骨格の動態を調節するタンパク質を制御する働きをすることができる方法を特定することを目指すべきです。

血管新生は、分極方向の特異性と移行、および血液供給を必要とする組織に新しい血管系を形成するために、内皮細胞（EC）を促進する細胞外シグナリングの合図によって誘発されます。血管新生を駆動するために考え要因は、細胞外マトリックス（ECM）からの信号です。物理的な合図に応答して、電気部品は、血管網1,2の形成方向移動を案内する方向特異性を有する新しいブランチを拡張します。 ECの形態および分岐のアーキテクチャは、アクトミオシン収縮3の調節に調整されている方法で、微小管（MT）細胞骨格の局所的な規制によって定義されます。形成するために、ECの枝ためには、ミオシンIIは、局所的にローカライズされた膜の突起部4で、その結果、ダウンレギュレートされなければなりません。同時に、細胞内の同じ場所に、MTの成長のダイナミクスは、分岐エロンを促進するために遅く、持続的なMTの成長で得られた修飾になりますゲーションと安定性5。このコーディネート細胞骨格の調節は電気部品が指向性の移行を容易にするために、それらの形態を分極することができます。 偏細胞形態の開発は、偏MTアセンブリ6が必要です。上皮細胞の移行では、MTが特に細胞7-9の先端でゆっくりと持続的に成長します。ニューロンにおいてながら、軸索や樹状突起の開始および伸長は、MTSがないだけで存在していることが必要ですが、彼 ​​らは、動的に組み立ておよび分解10-15のプロセスを受けていること。このように、MTの成長ダイナミクスの局所的な制御は、細胞の構造を決定したECは、そのECMをナビゲートとして細胞形態の急速な改造を可能にします。 MT成長ダイナミクスは、分子モータータンパク質と非モータータンパク質の家族によって規制されている、微小管結合タンパク質または微小管相互作用タンパク質（以下REFEと呼ばれます）のMAPとRRED。 MAPは、ローカルに典型的には、細胞- ECMインタフェース16,17で開始シグナル伝達カスケードを介して、アクティブまたは不活性化することができます。 MTに結合し、MTの組立・分解の動態を変化させることによって、一度アクティブ、MAPの機能。これにより、局所的に細胞の形状や極性18-20を促進するために、MTのダイナミクスを調節するように機能します。有糸分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）はMTの終了やカップルMTの解体21-23へのATP加水分解に特異的に結合するキネシン13家族のMAPです。 MCAKのこの機能的役割は、紡錘体24-28内の重要なだけでなく、相間29,30の間にあることが知られています。間期のEC内では、MCAK媒介MTの分解はRac1の低分子量GTPaseの活性化を誘導し、エッジを創傷に応答して、MCAKのローカライズされたオーロラ誘導リン酸化によって調節されます。このシグナル伝達カスケードの結果はルに向かって偏MTの成長の結果、ECの立ち上がりでMCAKの阻害であります電気部品31の移行の後縁のエッジとMCAKに誘導されるMTの分解をading。 MTの成長動態を測定するための従来の方法は、典型的には、蛍光標識されたチューブリンまたは、より最近では、蛍光標識されたMTエンド結合タンパク質1または3（それぞれEB1またはEB3）のいずれかの手の追跡を使用しています。蛍光チューブリンアプローチは全体MT配列を標識するという利点を有します。有糸分裂細胞型の大部分は相間8,32,33中のMTの半径方向の配列を維持するためしかし、中心体周辺のMTは非常に緻密であり、その結果、蛍光チューブリンとMTの成長および分解を追跡することは、通常、周辺に限られていますセル領域。これらの制限のために、蛍光標識されたEBタンパク質（EB1またはEB3）の利用はMTのダイナミクスを測定するためのより一般的なアプローチとなっています。 EBをのみMTの成長に加えて、両端にラベルを付けているので、彼らは明るい蛍光が来て、（1-3μm）のような小さい表示されますTS、極めて限定されたバックグラウンド蛍光34-37でMT重合の容易に識別可能なマーカーを提供します。 MT配列のサブセットのみのEBラベルがEBアプローチの主要な強さを表しているという事実は、それはまた、1つの重要な制限を強調しているが、その非成長のMTは、EB3アプローチによって標識されていません。それにもかかわらず、測定し、時間をかけてEB3彗星を追跡し、サブセルラー領域内のMTの成長を視覚化する能力は、MTの組織の地域の評価を必要とするアプリケーションのために、このアプローチに最適です。 MTの成長動態を測定するための従来の方法のもう一つの重要な制限は、非常に大きなデータセットとデータ分析に必要な時間でした。この制限は、高時間分解能でのEBの彗星の数百の手の追跡のための必要性に由来します。また、これらの測定は、細胞の統計的に有意な数で行い、また、コントロールとexperimeの様々な環境下で実行される必要がありますNTAL条件。最近では、これらの制約は、生細胞35にタイムラプス顕微鏡を用いて具体的に追跡EB3彗星に向けコンピュータ解析技術によって克服されました。適切に使用される場合、この計算手法は、MTの重合を測定するハイスループット方法を提供することに加えて手追跡に関連付けられた人的ミスの可能性を制限するの両方に役立ちます。 MatLabのベースのソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerを使用して、MTダイナミクスの計算分析、蛍光標識されたEB3彗星5,31,35,38を追跡することによって、MTの成長の測定を可能にします。また、plusTipTrackerソフトウェアが成長しているMTのトラック内EB3彗星の消失に基づいて、MTの破局イベント（ 別名解体）の計算を可能にし、興味のあるユーザ定義領域内のMT成長ダイナミクスのサブセルラー（ 別名地域）分析を可能にします。私たちの研究のために、MTの成長ダイナミクスは内比較しました非分岐の領域対、または細胞立ち下がりエッジに対するリードする内分岐鎖状の領域。 plusTipTrackerソフトウェアから出力されたデータは、個々の細胞および細胞下領域のカラーコード化されたトラックオーバーレイを生成するために使用することができます。 ここでは、MTの成長のダイナミクスと形態と方向性のある移動を分岐ECの規制にこのMT分解酵素の寄与を調節するのにMCAKの役割を調査するために使用する方法を説明します。我々のアプローチは、簡単に培養し、プラスミドcDNAの電気穿孔によって誘発される、一過性トランスフェクションに非常に適している初代ヒト細胞株、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、使用していました。私たちは、その後、高解像度を使用し、タンパク質3（EB3）と分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）特異的cDNAのバインディングMTエンドでトランスフェクトしたHUVECのタイムラプス蛍光顕微鏡は、MTのダイナミクスへの影響はHUVECをトランスフェクト評価するために構築します。 EB3のPlusTipTrackerベースの計算画像解析MTプラス端はMT成長ダイナミクスの実験操作の効果を測定し、比較するために、タイムラプス画像でMTの成長速度とMT成長寿命を測定することであった標識。この方法論は、MTのダイナミクスの研究とサブセルラー領域内のMTダイナミクスの規制が分岐ECおよび移行の血管形成過程にどのように寄与するかを、ローカライズの同定を可能にします。これらの技術は、蛍光生細胞中で標識し、発現させることができる任意のMAPの調査に適用可能です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K ビュー.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

ヒト臍帯静脈内皮細胞の単離（HUVEC）

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

生物学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...