イメージングを行ったインディアナ センター博士ケン ・ ダン監督、インディアナ大学で生物顕微鏡用。脳定位固定装置は、設計、マーク Soonpaa、ウェルズ小児研究センターによって製作したプロトタイプです。この作品は NIH/R01DK097837-09 (NC) によってサポートされていた、NIH/R01HL068256-05 (NC)、NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC)、MPN 研究財団 (NC)、CTSI 共同プロジェクト IUSM/ノートルダム大聖堂 (NC)。

動物の使用を含むすべてのプロシージャを動物のケアおよび使用委員会のインディアナ大学医学部の承認を行った。行われる国の動物実験に関する法律を遵守することを確認します。
1. Mx1CreRBPJ-/-受信者のマウスの作製
<ol><li>Mx1-Cre+ RBPJlox/loxマウス10 Mx1 Cre を取得するマウスをクロス正RBPJlox/loxマウス12と Mx1 Cre 負 RBPJlox/lox同腹子コントロールとして使用します。PCR10遺伝子型を確認します。</li>
	<li>6-8 週を使用して-古い Mx1Cre+/RBPJlox/loxと Mx1Cre-/RBPJlox/loxマウス polyI:C 誘導を実行します。</li>
	<li>
PolyI:C 200 μ g i. p. Cre+と Cre-マウスでを挿入します。1 つの polyI:C 注入 3 日間最初の週の毎日を与えます。1 つの polyI:C 注入 7 日 (合計で 4 回の注射) の前の注入後第 2 週を与えます。
	<ol>
<li>RBPJKO を使用 (Mx1Cre を誘導+/RBPJ液体酸素/液体酸素) と RBPJWT (Mx1Cre を誘導-/RBPJ液体酸素/液体酸素) 最後の polyI:C 注射後 3 週間の受信者としてマウス。 注: 注射後 3 週間 pI: pC によるマウスを使用することをお勧めします。PolyI:C によって引き起こされるインターフェロン応答は HSC の肺浸潤拡大の結果、BM の重要な変化を誘導して末梢血16,17に成熟した前駆細胞の出力を減少します。造血のサブセットの表現は、正規化された 3 週間後に炎症の交絡影響せず利用できる注入とマウスです。この誘導のプロトコルは、RBPJ のために最適化されています。異なる遺伝子の削除、誘導プロトコルは、構成によって異なる場合があります、削除を検証する必要があります。合計 4 つ polyI:C 注射後 RT-PCR による loxP サイト間 RBPJ 地域の ~ 100% 削除を検証しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Lys EGFP ドナー骨髄細胞の移植のための準備
<ol><li>1 つの Lys EGFP マウス (頚部転位続いて二酸化炭素) を安楽死させる 1 または 2 の移植の前に h。</li>
	<li>70% エタノールで動物の体の表面をスプレーします。</li>
	<li>足首周りの両方の足で皮膚切開を行い、手術用鉗子を引いて離れて一緒にきれいな筋肉組織を公開する毛皮外科はさみを使用します。</li>
	<li>外科はさみを使用して、可能な限り足から同様に多くの筋肉を削除します。はさみを使用して、(膝・足関節の骨を切り取ってきれいに大腿骨と脛骨のガーゼを使用してから任意の残りの筋肉組織。DMEM に 10% を含む 6 ウェル プレートに (2 つの大腿骨および脛骨の 2 つ) の骨を置く政府短期証券。</li>
	<li>ピペット 10 mL 冷たい 2 mM EDTA PBS とモルタルで噛み砕く骨髄細胞単一細胞懸濁液に細胞をさせる。また、1 mL 注射器で各側面から 2 mM EDTA PBS 3 回で骨をフラッシュします。</li>
	<li>骨髄細胞を 15 mL 遠心管に 70 μ m フィルターを使用してフィルターします。2-3 ml の PBS のフィルターをすすいでください。460 x g で 10 分間ダウン セルをスピン、10 %10 mL の新鮮な DMEM に細胞を再懸濁します FBS。</li>
	<li>診断に骨髄細胞をカウントし、1.5 倍の 107セル/mL を IMDM の血清濃度を調整します。200 μ L のボリュームを持つ動物あたり 3 x 10 の6セルを使用します。合計 BM の約 1/3 セル骨髄性 GFP + セルです。注射の準備ができるまで、氷の上セルを残します。105セル × 0.5 を使用して、FACS9GFP 発現を確認します。</li>
</ol>3 RBPJKO マウスに Lys GFP 細胞骨髄移植
<ol><li>パイ ケージで受信者のマウスを抑制します。ガンマ放射の致命的な線量を持つマウスに照射 (1,200 Rad) Cs 137 照射に。分割投与プロトコルを使用: 夕方 900 ラドに続いて 300 ラド (離れて 16 h) 次の朝。</li>
	<li>致死的放射線照射した RBPJWT と RBPJKO の受信者マウス移植放射線の 2 回目投与後 5 〜 6 時間。BM を注入動物を介して尾静脈注射 (セクション 2 のセルを収穫の詳細を参照してください) あたり 3 x 10 の6セルの濃度リス EGFP マウスから採取した細胞。</li>
	<li>異なる時点での IVFM による移植マウスの独立したコホートのイメージ: 24 h のと週 2、4、6、前述の下で (4 </ol>4. 手術に備えて生体イメージング
<ol><li>手術器具を滅菌します。2 本の細い鉗子 (1 つストレート、角度の 1 つ)、1 組の高級はさみとニードル ホルダーの 1 つのペア。手続きに必要なすべての供給で術野を準備します。</li>
	<li>麻酔薬ケタミン カクテルの IP 注入マウスを与える (キシラジン 2.5-5 mg/kg + アセプロマジン 1.0 〜 2.5 mg/kg + ケタミン 90-100 mg/kg) 26-28 G 針の注射器を使用して。 動物のプロシージャの間に 15 分毎が監視され、元の用量の 1/4 で必要に応じて麻酔薬、補われます。</li>
	<li>適切な熱源 (37 ° C 加熱パッド、パッドを加熱との直接接触から保護動物) の上にマウスを置くし、視覚的に呼吸数を監視します。</li>
	<li>つま先を利用した反射がピンチの応答を確認します。確実に動物完全に麻酔、手術を開始する前に。</li>
	<li>使用 26 28 ゲージ与えるマウス蛍光血管マーカー (デキストラン、20 mg/mL の溶液 100 μ L) の尾静脈注射針注射器です。</li>
	<li>両方の目に獣医眼軟膏を適用されます。小さな電気バリカンで動物の頭の背側表面をクリップします。脱毛クリームを削除し、生理食塩水、すすぎを 5 分使用ガーゼ スポンジにクリームを適用します。綿棒を使用して 70% アルコールできれいな頭皮を準備します。</li>
	<li>微細鉗子、はさみを使用して小さな正中皮膚切開 (10-20 mm) を基になる背側頭骨表面を公開するのに頭皮に。5-0 外科シルクを使用すると、イメージングのため calvarium を公開するのにフラップを作成する、切開の各側に皮膚の縫合糸に宿泊 2 を配置します。</li>
	<li>自分の背中にマウスを置き、顕微鏡油で満たされたガラス底皿に露出した頭皮が水没します。多光子イメージング部屋に動物を輸送します。</li>
	<li>顕微鏡ステージ上目的上ガラス皿の上に配置 calvarium と動物を配置し、37 でカバーします° C 加熱パッド (動物は熱との直接接触から保護する必要があります)。</li>
</ol>5 体内マウス Calvarium の高分解能イメージング。
<ol><li>多光子イメージングの変更倒立共焦点システムを使用して (材料の表を参照してください)。次の製造元の指示調整 830 2 光子レーザー nm、20 の場所 X W、NA 0.95 顕微鏡鼻部分およびチェック レーザーのビーム配置の対物レンズ。 注: 正立顕微鏡システムはこれらの研究でよく使用が、反転の多光子吸収システムも利用できます。本研究では、カスタム設計された非外科的脳定位固定装置が使用されました。正立顕微鏡システムのいくつかの市販脳定位固定装置が市販脳定位固定装置マウス頭蓋骨のセキュリティ保護を目的とした倒立顕微鏡システムはありません。カスタムの脳定位固定装置に別の方法として、上記の安定性のための様々 なテープや接着剤の手法を活用して目的位置に頭蓋骨を保護できます。</li>
	<li>画像集録ソフトウェアを開きます。「設定の取得」パネルは、1 方向スキャン モードを選択した場合確認してください。4 μ s/ピクセル、512 × 512 ピクセルにフレーム レートのためにスキャンの速度を設定し、1.5 にズームします。レボルバで配置されているレンズに合わせて利用可能な対物レンズのリストから 20 X W Na 0.95 目的を選択します。</li>
	<li>「画像取得制御」パネルから「色素リスト」にアクセスし、、「光子」を選択します。「光パス & 染料」ウィンドウを開き、レーザー ユニット 2 のチェック ボックスをチェックすることによって DM690 980 励起 DM 2 P レーザー シャッターの開きを選択します。「顕微鏡コント ローラー」ウィンドウで RDM690 のミラーをを選択します。</li>
	<li>「エピ ランプ」を B/G エピ フィルター キューブを選択選択して血流と中心静脈 (a) と (b) (図 2 a) 冠状縫合の分岐を参照として使用して、calvarium 骨髄ニッチを視覚化する試料の上に目的に焦点を当てます。</li>
	<li>
非 descanned モードを使用して画像を収集します。外部検出器を選択: コラーゲンの SHG 信号を収集する PMT detector1 (排出フィルター - 430/100 nm)、収集の GFP 信号 (排出フィルター - 525/50) GaAsP detector2 と TRITC デキストランの信号を収集する GaAsP detector3 (排出フィルター - 605/90 nm)。
	<ol>
<li>光毒性を最小限に抑えるための平均で 4μs/ピクセルのスキャン レートでイメージングを実行します。一定のレーザー パワーと検出器のゲインが最小限の飽和検出器のダイナミック レンジを活用する調整で画像を収集します。</li>
		<li>Calvarium 骨髄の 6 地域から一連の組織 (60 × 1 μ m Z スタック) の深さによってセクションを収集します。ズーム 1.5 と 512 × 512 ピクセルのフレーム サイズ (423 μ x 423 μ m)、1 μ m のステップ サイズ設定を使用します。 注: 全体的に 1 つのマウスを画像に必要な合計時間は 1 〜 1.5 h です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 定量解析
<ol><li>製造元の指示に従って専用 3 D ・ 4 D 画像の定量化と可視化ソフトウェアを使用して画像の定量と 3 D 再構成を行う (表を参照)。対話的にアルファ ブレンドまたはシャドウ射影ボリューム レンダリング アルゴリズム最大強度投影法 (MIP) を利用した 3 D で Z スタックを視覚化します。</li>
	<li>セグメントの GFP の細胞を使用して、"スポット オブジェクト分割モジュール"。(これは緑と赤のチャンネルで強い蛍光を表示する骨細胞の信号を排除) GFP の細胞数の偽肯定的な排除するスタック算術処理 (チャネル減算) を適用します。</li>
	<li>曲面の分割モジュールを使用して血管と骨の表面の分割を実行します。必要な場合は、「表面にスポットの距離」と呼ばれるエックス テンション アルゴリズムを適用して細胞上の表面のいずれかへの距離を計算します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li><li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment.">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li><li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues.">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision.">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner.">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li><li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential.">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li><li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation.">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons.">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

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このプロトコルでは、生体の蛍光顕微鏡による造血細胞移植の動力学を調査するように最適化実験デザインについて説明します。本研究では WT BM または欠陥のある BM をシグナリング ノッチ骨髄前駆細胞の拡張追跡された骨 calvarium で次 Lys GFP 陽性骨髄性細胞によって BMT 後 RBPJWT または RBPJKO の受信者に。たとえばアドレス同様の質問に適用できるモデルとしてこのアプローチが提案されて: ...

生体多光子蛍光顕微鏡 (IVFM) は、高解像度、リアルタイム イメージングの深さを持つ組織の最大のことができる強力なイメージング技術によって組織の 1 mm。マウスの calvarium を適用すると、60-100 μ m11を非侵襲的な方法で BM 内造血細胞の挙動を観察が許可されます。このアプローチは、正規 Notch シグナルに欠けている BM の RBPJ ノックアウト マウスで通常の骨髄前駆細胞の生着の動態を決定するここで使用です。
私達のグループからの最近の作品は、その欠陥正規 Notch シグナルのような骨髄増殖性疾患12BM 微小環境リードを示した。Notch シグナルの損失は、RBPJ、下流正規 Notch シグナル、組換え10を誘発 Mx1 Cre を使用しての重要な転写因子の DNA 結合ドメインの条件付き削除によって得られました。本研究では Mx1-Cre/RBPJlox/loxマウス モデルが使用されました。RBPJ の DNA 結合モチーフの条件付き削除すべてのノッチの受容体から信号の損失で起因します。式は複数の臓器の間質成分のだけでなく、血液細胞のターゲット遺伝子欠失の誘導の結果 polyI:C の管理時にアクティブ Mx1 プロモーターによる Cre Mx1 Cre モデルで BM、脾臓と肝臓を含みます。
Mx1-Cre+/RBPJlox/loxと Mx1 Cre-/RBPJlox/loxマウス (ここに至って示される RBPJKO と RBPJWT、それぞれ) polyI:C による致死的照射し、正常な野生型造血細胞移植されました。移植後 4 週目から始まって、RBPJKO の受信者は脾腫に続いて重要な白血球を開発しました。RBPJKO マウスでは、移植後およびそれ以降の時点で BM の 8 週目骨髄前駆細胞の増加割合を提示、週 4 と 6 で BM の分析はコントロール RBPJWT と比較して、骨髄球系細胞内容に顕著な違いを明らかにしなかった受信者。この観測は、一緒に実際に Mx1 Cre が異なる造血臓器の単位があること提起した BM 微小環境骨髄増殖性の表現型の発生に直接的な影響を持っていたかどうか。
BM が病気の開発の重要な最初のサイトであるかどうかを判断するには、マウス calvarium の IVFM は BM の移植 (BMT)、RBPJ ノック アウト モデル系列のシステムを追跡との組み合わせで使用されました。特定リゾチーム プロモーター (Lys GFP)9の制御の下で EGFP を発現するトランスジェニック マウスを用いて BM BMT 後の画像の中に可視化することができるドナー細胞を入手します。リゾチーム発現は骨髄細胞に固有、Lys GFP が成熟した顆粒球13(CMP) 一般的な骨髄前駆細胞をマークします。
異なる時点で BM の IVFM を示した、Lys GFP の細胞同様に BM の RBPJWT と RBPJKO の受信者にホーム拡大や高速 RBPJKO BM 受信者の中にしみ込んでいます。この違い以前の時点 (2 週目) で劇的だったし、時間の経過とともに減少 (週 4 と 6)。しかし、これらの後の時点で PB で循環する骨髄細胞数の着実な増加を示した同じ受信者の造血のコンパートメントの評価、細胞の高められた出力を示す RBPJKO マウスの脾臓でローカライズ循環に BM。Lys GFP の細胞における局在の解析 BM 移植マウスの 6 週間では、骨髄細胞がコントロールにより RBPJKO 微小環境で血管系から遠い寝泊まりしていたことを明らかにしました。
総称して、これらの特定の動物モデルと IVFM の組み合わせは RBPJKO BM 微小環境における骨髄系細胞の生着の動力学の洞察力を提供されています。同じような質問に対処するため適用することができますパラダイムとして実験的なデザインとここで説明する定量的な手法を提案する.たとえば、RAG1 GFP14または15 Gata1 GFP マウスなどのモデルを追跡他のセルの特定の血統を使用する次のリンパの動作許可可能性がありますや赤芽球系前駆細胞、BM のそれぞれ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine cocktail</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:511px;">Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRITC dextran</td>
			<td style="width:167px;">Tdb Consultancy</td>
			<td style="width:139px;">TD150-100mg</td>
			<td>Other color dextran may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andis hair trimmer</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:139px;">CLP-323 75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">PK224</td>
			<td>4-ply, 2X2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair depilatory cream</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saline</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">RXSAL-POD1LT</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-826-79</td>
			<td>28g, 1/2cc</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">00108-11, 00109-11</td>
			<td>straight forcep, angled forcep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissor</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle holder</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">MV-682</td>
			<td>Other non-absorbable suture may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WillCo- glass bottom dish</td>
			<td style="width:167px;">WillCo</td>
			<td style="width:139px;">GWSt-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optical microscope oil</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxic stage insert&#160;</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;">Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus FV1000 confocal microscope system&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Zoo Med reptile heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Imaris 8.1 imaging software</td>
			<td style="width:167px;">Bitplane</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

増加する証拠は、その正常造血が特殊な細胞ニッチ重要な造血幹細胞 (HSC) 機能1,2を調節することを含む、BM の個別のアイソレータケージ手がかりによって規制されてを示します。確かに、造血微小環境のより詳細な画像は今浮上して、骨と血管内皮のニッチが正常 HSC とその子孫3,4,5 の規制の機能ユニットを形成.新しい研究は、血管周囲細胞、脂肪細胞、神経細胞の維持と HSC 機能6,7、8を規制することの重要性を明らかにしました。さらに、異なる系統、すなわち骨髄性とリンパ性細胞、家から細胞、骨髄微小環境の内で特定のニッチに存在する証拠があります。しかし、BM 微小環境とその居住者の完全なマッピングは、まだ進行中です。
トランスジェニック マウス系統系統固有蛍光マーカーあるいは BM のニッチの特定のセルに選択した分子を欠いた遺伝子改変マウスの表現ができます。ノックアウトと系列移植アプローチとの組み合わせで、モデルを追跡、HSC などの定義済みの造血集団の固有の「ニッチ」の役割に関する知識を絞り込むこと細胞 B 細胞、T 細胞、骨髄細胞、赤芽球系細胞。この戦略は、マージ、calvarium の 2 光子顕微鏡を使用することによってさらに増強することができます。体内の高分解能イメージングと BM calvarium の 3d レンダリングを提供することにより造血の特定のサブセットが BM のホームし、時間をかけて彼らは拡張の動態を評価の場所正確に今判断できます。ここでは、Lys GFP トランスジェニック マウス (骨髄細胞マーキング)9と RBPJ (正規 Notch シグナルに欠けている) ノックアウト マウス10はノッチ欠陥 BM の微小環境に骨髄系細胞の生着を確認する IVFM との組み合わせで使用されます。

2 RBPJKO、2 RBPJWT 受信者のコホートを異なる時点で各撮像セッションでイメージしました: 24 h、2、(ワークフロー、図 1 aに示されている) BM Lys GFP の細胞移植後 4 〜 6 週間。
各マウスの画像に(図 2 a、)中心静脈と冠動脈縫合 (図 2 a、b) の分岐に関連して彼らの位置によって識...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) が適用されます。

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

7.9K ビュー.  Indiana University School of Medicine. ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) が適用されます。

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

発生生物学

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

潜在的細胞質置換療法のための骨髄間葉系幹細胞からの血漿膜小胞の調製

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL による破骨細胞文化アッセイのマウス骨髄破骨細胞形成における mTORC1 の役割を調査するには

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

骨組織の再生にプレドニゾロンの効果を研究する大人のゼブラフィッシュ傷害モデル

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...