この研究は、Li Ka Shing財団、中国の自然科学財団（http://www.nsfc.gov.cn/助成金番号30971665、広東省高水準大学プロジェクト「海洋産業のためのグリーンテクノロジー」） 81172894、81370925）、広東省の教育部（http://www.gdhed.edu.cn/助成金番号cxzd1123）を参照してください。

8〜12週齢のBALB / cマウスをShanghai Experimental Animal Center（上海、中国）から購入し、特定の病原体および空調された動物施設で飼育した。動物のケアおよび実験手順は、汕頭大学によって設立された実験動物の使用およびケアのためのガイドラインに従っていた。 1.装置の組み立て<ol><li>無菌性を確保するために、使用前に組織培養フードのUV光を30分間点灯させます。 </li><li>使い捨ての25 mmフィルターユニットを外し、75％エタノールで満たした200 mLのガラスカップにユニットのキャップと底部を30分間浸します。ユニットは医療グレードのポリプロピレン製です。 </li><li>鉗子を使用してキャップとユニットの底部を持ち上げ、残りのエタノールを手で振り落とし、部品をフード内で10分間空気乾燥させます。 </li><li> PBSで19 mmのポリカーボネート膜を湿らせ、ボトムの支持マトリックスの上に注意深く置きますユニットのm。ポリマーフィルムは滑らかで平坦な表面を有し、トラックエッチングされた3μmの孔を有する。 </li><li>キャップを底部にしっかりとねじ込むことによってユニットを組み立て直します。メンブレンが中心から外れていないことを確認してください。 </li><li> 1mLインスリン注射器の針を外し、1mLのPBSを採取する。シリンジをフィルターユニットに取り付け、PBSをユニットに押し込んでアセンブリを濡らし、漏れがないかどうかをテストします。 </li></ol> 2.血漿膜小胞（PMVs）の生成<ol><li> Nemeth らによって報告されているように、BMSC培養を確立する。 15 ％のFBSおよび1％のペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地中で培養した。 37℃で5％CO 2を含む加湿インキュベーター内で6ウェルプレート中で細胞を培養する。 </li><li>細胞を増殖させるために、培地を除去し、0.5mLのカルシウムフリーPBSでウェルをすすぐ。 </li><li> 0.5mLの0.25％トリプシン-EDTAを添加し、細胞を37℃でインキュベートする3分間。細胞の剥離を容易にするために、プレートを手のひらに対して数回タップします。 1 mLの培地を加えて消化を停止する。 </li><li> 15mLコニカルチューブに細胞を集め、卓上遠心分離機で200×gで2分間回転させる。 4mLの培地に細胞を再懸濁し、細胞を6ウェルプレートの2つのウェルに分注する。 注：通常、細胞は約24時間でコンフルエンスに達する。 </li><li> PMVを生成するために、6ウェルプレートの1つのウェル（約5×10 5細胞）からトリプシン消化によって細胞を回収し、細胞を0.5mLの培地中に単分散する。 </li><li>インスリンシリンジに細胞をロードし、それをフィルターユニットに取り付け、プランジャーを素早く押して細胞をフィルターに押し込みます。内部には少数のPMVしかなければならないので、押出された媒体を捨てる。 </li><li>シリンジにさらに0.5 mLの培地をロードし、すばやくフィルターに通します。第2の押出物の媒体を回収した。様々なサイズのPMVがある。 </li><li>収集した培地150μLを35mmのガラス底の皿にロードし、PMVを約10分間底に沈降させる。 20倍の対物レンズを使用してCCDカメラを備えた倒立位相差顕微鏡下でPMVを検査する。 </li></ol> 3.共焦点顕微鏡を用いたPMV内の内容の検討<ol><li> BMSCでトランスフェクションを行うには、50μLの無血清DMEMに2μgのスーパーコイルプラスミドDNAと6μLのカチオントランスフェクション試薬（ 例えば PolyJet）を希釈します。ボルテックスしてよく混合し、チューブの側面から液体をすべて集めるために短時間回転させます。 </li><li>希釈した溶液（ステップ3.1から）を希釈したDNA溶液に滴下し、強く1分間ボルテックスし、短時間回転させ、室温で10分間インキュベートする。 </li><li>約30％のコンフルエンスで一晩播種したBMSC上の古い培地を新鮮な培地2mLで交換し、DNトランスフェクション混合物を滴下する。 </li><li>トランスフェクションの12時間後に2 mLの新鮮な培地と交換する。 </li><li>細胞質に局在するタンパク質を追跡するために、上記のように、EGFP発現カセット（pEGFP-N1）を含むプラスミドで細胞をトランスフェクションする。上記のように、PMV生成のためのトランスフェクションの48時間後にトリプシン消化により細胞を回収する。 </li><li>ミトコンドリアを追跡するために、ミトコンドリア色素（1μM、MitoTracker）を用いて37℃で30分間新鮮な培地で細胞を染色する。 </li><li> ミトコンドリアの膜電位を検出するために、シアニン色素JC-1（5,5 &#39;、6,6&#39;-テトラクロロ-1,1&#39;、3,3&#39;-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージド）（10μg / mL）を37℃で30分間インキュベートした。 <ol><li>上記のように、0.5mLのPBSで細胞を3回洗浄し、PMV生成のためにトリプシン消化によって細胞を回収する。 </li><li>採取したメディウム150μLを負荷するiumを35mmのガラス底の皿に入れ、PMVを約10分間底に沈降させる。 100倍の油対物レンズを使用して共焦点顕微鏡下でPMVを検査する。 </li></ol></li><li> EGFPまたはミトコンドリア色素を検出するには、488 nmレーザーをオンにし、505〜530 nmでシグナルを収集します。 JC-1を検出するには、488 nmおよび543 nmレーザーをオンにし、505〜530 nmと560〜615 nmの信号を収集します。ピンホール値を約1.4に設定します。 </li></ol> 4.遠心分離による濃縮PMVの調製<ol><li>トリプシン消化により細胞を回収し、0.5mLの培地中で上記のようにPMVを生成する。 </li><li>室温で5分間、卓上遠心分離機で1200xgでPMVを回転させる。慎重に上清を吸引し、穏やかな渦巻きで100μLの培地にペレットを再懸濁する。 </li><li> 35mmのガラス底のディッシュに50μLのPMVをロードし、約10分間室温で沈降させる。 PMVを調べる40倍の油対物レンズを用いた共焦点顕微鏡下で測定した。 </li><li>一連の希釈ポリエチレンイミン（PEI）溶液をBMSC培養液に1時間加え、細胞傷害性の兆候がないかチェックする。 注：BMSCでは毒性の兆候が検出されなかったので、ここでは2μg/ mLのPEIを選択した。 </li><li>トリプシン消化で細胞を採取し、2μg/ mLのPEIを1時間加えて凝集を防ぐ手段として細胞膜を充填する。上記のように、0.5mLの培地中でPMVを生成する。上記のように、PMVを濃縮し、共焦点顕微鏡下でそれらを調べる。 </li></ol> 5.腓腹筋にPMVを注入する<ol><li>膜を染色するために、CM-DiI（クロロメチルジアルキル - インドカルボシアニン）（10μM）色素を1mLの新鮮培地にBMSCに30分間添加する。 </li><li>トリプシン消化により細胞（約5×10 5 ）を採取し、0.5mLの培養培地にそれらを再懸濁する。 1に対してPEI（2μg/ mL）を添加するh。上記のように、PMVを生成し、100μLの培地に濃縮する。 </li><li>絶食の12時間後にナトリウムバルビタール（10mg / kg）を注射してBALB / cマウスを麻酔する。 </li><li> 75％エタノールで腓腹筋の外側をきれいにする。 30Gインスリン注射器を用いて腓腹筋にPMV（100μL）をゆっくりと注入する。 </li><li>麻酔を施した後、実験期間中、目の上にぬれたガーゼを置き、起きるまで白熱灯でマウスを暖める。個々の換気ケージにマウスを単独で収容する。 </li><li>手術12時間後に腓腹筋を採取するには、頚椎脱臼によりマウスを殺す。 </li><li>腓腹筋に75％エタノールを振りかけ、はさみで皮膚を開き、両端の腓腹筋全体を切り取ってください。 </li><li> PBSで筋肉をすすぎ、20倍の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡下で調べます。 </li><li>筋肉をトリムするシャープなカミソリの刃は、蛍光のない部分を取り除きます。強い赤色の蛍光を発する部分を約9 mm 3の立方体に切断します。 </li><li>各キューブを最適な切断温度媒体（OCT）に埋め込み、5分間液体窒素に浸し、使用するまで-20℃の冷凍庫に保存します。 </li><li>クライオスタットを用いて凍結切片を20μmの厚さに切断し、各切片をガラススライドに接着させる。 PBSで1回洗浄します。 </li><li>染色サークルペンで切片の周りに円を描き、100μLのDAPI（1μg/ mL）を加える。暗所で室温で10分間インキュベートした後、DAPI溶液を吸引し、PBSで3回洗浄する。 </li><li>試料の上に油を落とし、ガラススリップで覆い、マニキュアでスライドを密封する。 100倍の油対物レンズを使用して、共焦点顕微鏡下のセクションを調べます。 </li><li> CM-DiIを検出するには、543 nmレーザーをオンにし、560-615 nmでシグナルを収集します。 DAPIを検出するには、405420〜480nmで信号を収集する。ピンホール値を約1.4に設定します。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigorated to provide a long-lasting effect. Additionally, exogenous mitochondria might have a faster proliferation rate, as indicated in our previous study12. The replacement of damaged mitochondria is essential because mitochondrial dysfunction has been linked to many senescent diseases11. In addition, unlike stem cells, the enucleated PMVs are not be able to proliferate; thus, it is unlikely to raise the concern of cancer development. Lastly, the lack of nuclear DNA in PMVs also reduces the risk of genome damage by DNA random integration. 
Cultivated cells produce a variety of membranous extracellular vesicles (EV) under normal or stress conditions. Exosomes originate from late endosomes and are released by most mammalian cells as extracellular vesicles of 30-120 nm in diameter16. Larger EVs, called microvesicles, have a size ranging from 0.1-1 &#181;m and are directly shed from the plasma membranes of cells17. Microvesicles and exosomes may have overlapping cellular constituents and functionalities in tissue repair. On the other hand, giant plasma membrane vesicles18,19 and similarly, plasma membrane spheres20 about 30 &#181;m in size can be generated from multiple cell types by chemical induction or cell swelling. However, the application of these cell-size vesicles in therapeutics is still largely undeveloped. In any event, the production of EVs are time consuming, and, unlike PMVs, the contents within EVs are limited by the obviously absent cellular organelles. 
This manuscript describes the use of PEI to prevent the aggregation of PMVs after centrifugation. PEI is a potent non-viral gene delivery carrier due to its capability of condensing DNA using multiple positively charged amino groups. A concentration of 2 &#181;g/mL of PEI, which showed no sign of cytotoxic effect, was chosen to positively charge the cell surface and consequently resulted in the superior dispersion of PMVs. Moreover, the binding of PEI to the surface might help with the endocytosis of PMVs. Once inside of the cells, the further protonation of the amino groups in low pH can lead to endosomal swelling and bursting21. 
However, the PMVs generated here are far from perfect. The 10-fold reduction in diameter, for example, from 30 &#181;m (BMSCs) to 3 &#181;m (PMVs) could theoretically lead to a 90% loss of cellular content. Even worse, a large fraction of PMVs have a diameter smaller than 3 &#181;m. Furthermore, substantial cellular debris was detected during the squeezing process, probably due to the stiffness of the cell membrane, which was caused by the presence of integrated membrane proteins and lipids such as cholesterol. It is possible, however, that the flexibility of the cell membranes could be improved by incorporating fatty acids with short side chains, such as Octyl-beta-Glucoside. 
Another reason for the generation of cellular debris is the presence of the cytoskeleton, which may also hinder the inclusion of organelles into the PMVs. This might explain that some of the PMVs, even those that have a diameter of 3 &#181;m or larger, have no detectable mitochondria. Since most of the organelles are attached to the polymerized cytoskeleton, it would be interesting to test if blocking the polymerization of the cytoskeleton could improve the encapsulation of organelles. 
In addition, the in vivo application of PMVs must overcome a myriad of hurdles. For example, to target hepatocytes, PMVs must avoid being captured, not only by the scavenger system in the circulation, but also by Kupffer cells that line the sinus of the liver. A method to facilitate the migration of PMVs from the circulation to target tissues may also be required. Nonetheless, in the face of these many caveats, the advantage of using PMVs for therapy is outstanding. We showed that PMVs were readily endocytosed into the myofiber of the gastrocnemius muscle after an intramuscular injection. We are currently testing to see if a dystrophic gastrocnemius muscle induced by hydrogen peroxide can be recused by PMV medication.

<html>遺伝子、酵素および細胞置換療法のためのアプローチを確立することに多大な努力が注がれてきた。これは大きなブレークスルー、さらには臨床応用1,2,3をもたらしました。最近、核移植技術に基づいた議論の余地のあるミトコンドリア補充療法が、高齢の女性または致死的ミトコンドリアDNA突然変異を有する女性の体外受精に適用された 4 。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病、および癌を含む、年齢関連疾患に見られる欠陥は、通常多面的である。脂質液滴の蓄積が報告されている。アミロイドタンパク質の沈着;小胞体における折り畳まれていないタンパク質の保持;オートファゴソーム、およびミトコンドリアの欠陥が、これらの疾患の発症または悪化に寄与する&quot;xref&quot;&gt; 5,6,7,8,9,10,11。現在、老化および老化表現型を引き起こす細胞質および細胞小器官における機能不全の直接修復を目的とした利用可能なメカニズムは存在しない。 私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的な押し出しによる原形質膜小胞（PMVs）の生成について報告しています12 。核を除いて、膜または細胞質ゾル（タンパク質およびRNAを含む）ならびに細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）の成分が、PMVにおいて見出された。本質的に、PMVは小型除核細胞とみなすことができる。さらに重要なことに、PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。これは、最初の報告書です。潜在的に効率的な細胞質補充療法のアプローチを提案している。 骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、骨髄から日常的に生成され、培養において容易に増殖する多能性前駆細胞である。胚性幹細胞マーカーOct4、Nanog、およびSOX2は、MSCsにおいて低レベルで検出されている13 。テロメラーゼ活性も測定可能である。さらに、MSC上での共刺激分子およびヒト白血球抗原（HLA）クラスII分子の不在および低HLAクラスI発現は、それらを同種異系または「既製品」使用のための理想的な細胞にする再生医療と免疫調節アプリケーションの両方14 。 ここでは、3μm孔のポリカーボネート膜を介した押し出しによるマウスBMSCからPMVを調製する方法、ミトコンドリアの存在を決定する方法、およびコンポックを用いてPMVにおける膜電位の維持を調べる方法を説明する遠心分離によって濃縮されたが凝集していないPMVを調製し、マウスの腓腹筋にPMVをインビボで注入する。

<table><tbody><tr><td>IsoporeTM membranes</td><td>Millipore</td><td>TSTP04700</td><td>3 mm pore</td></tr><tr><td>Disposable filter unit</td><td>Xinya, Shanghai, China</td><td>25 mm</td><td>Medical grade polypropylene</td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>BD</td><td>328446</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>pN1-EGFP</td><td>Clontech</td><td>&amp;nbsp;6085-1</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker</td><td>Molecular Probes</td><td>M7514</td><td>Green FM, 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Beyotime, Haimen, China</td><td>C2006</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Beyotime, Haimen, China</td><td>C1036</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td>Mn = 75,000</td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE 2000</td><td>With CCD camera</td></tr><tr><td>Confocol Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SigaGen</td><td>SL100688</td><td>For cell transfection</td></tr></tbody></table>

preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy

私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的押出しによる原形質膜小胞（PMV）の生成について報告してきた。 PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病および癌は、様々な細胞型の細胞質ゾルおよび細胞小器官における複数の機械的および機能的欠陥に関連すると報告されている加齢性疾患である。骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、多能性を維持しながら自己再生能力を有する骨髄由来の独特の細胞集団を表す。 PMVの融合を介した自己BMSCからの若い細胞質による老化細胞の補充は、加齢に関連する表現型を改善する、または逆転させる有望なアプローチを提供する。このプロトコルは、押出によってBMSCからPMVをポリカーボネート膜を介して3つミオソンドリアの存在を判定し、共焦点顕微鏡を用いてPMV内の膜電位の維持を調べ、遠心分離によってPMVを濃縮し、マウスの腓腹筋にPMVのインビボ注入を行う。

PMVをうまく調製するための鍵は、1mLのPBSをメンブレンに通して試験することができるフィルターユニット（ 図1 ）の正しい組み立てに大きく依存します。漏れが発生した場合は、フィルタユニットを再度組み立て、再度テストしてください。しかし、漏出は、細胞が膜を通って押し出されたときにのみ確実に試験することができる。 10倍の対物レンズを使用する通常の顕微鏡下で少数のPMVしか検出されない場合、またはPMVのサイズが主に約1μmである場合、不正確な組み立てのために細胞の大部分がユニット内に閉じ込められることを示す。直径約3μmの範囲のサイズを有するPMVは、20倍対物レンズ（ 図2 ）を用いて位相差顕微鏡下で検査したときに優勢であった。ナノメートルサイズのPMVは容易に可視化されなかったので、PMVの数の点での割合は低かった。シリンジをすばやく押して再起動すると便利です明らかに球状PMVを形成することができない膜破片の量を増加させる。さらに、より小さいサイズ（1μm未満）のPMVが第1の押出媒体中に見出され、より大きなPMVが第2の押出において回収された。 PMVのもっともユニークな側面は、核から離れた細胞成分の封入であった12 。 PMV調製に使用する前に、BMSCをEGFPの発現カセットで48時間トランスフェクションした。結果は、細胞質に局在したEGFPタンパク質をPMVに封入することができることを示している（ 図3A ）。ミトコンドリアの囲いは、ミトコンドリア色素の染色によって証明され、大部分のPMVにミトコンドリアを示す緑色蛍光ドットが含まれることを示した（ 図3 ）。 PMVの中には、直径が3μmのものも含めて、ミトコンドリアを含有しているという証拠は示されておらず、いくつかの機械的制約によって、PMVへのミトコンドリアのカプセル化が妨げられる可能性がある。ミトコンドリアの膜電位はJC-1染色によって検出され、これはミトコンドリアが正常な電位を有する場合に赤色の蛍光を発する。この結果は、PMVにおいて赤色蛍光が実際に検出されたが（ 図3 ）、緑色蛍光は検出できず（データは示さず）、PMV内のミトコンドリアが機能的であることが示唆された。 PMVの濃縮プロセスは、特に、 インビボでの適用のために、容積を減少させると共に、押出しの間に放出される細胞成分を除去するために必要である。室温で1,200×gで5分間遠心分離した後、上清にはより小さなサイズのPMVがほとんど見られなかった。ペレットの再懸濁を促進するために、2mL丸底チューブを遠心分離に使用した。しかし、PMVの大部分はペレット中に凝集しており、特にPより小さなサイズのMV（ 図4 ）。これはおそらく膜上の接着分子によるものであろう。したがって培地には顕著な細胞傷害性がないように濃度を調整したPEI（2μg/ mL）を補充した。細胞膜に付着したPEIの正電荷は、遠心分離の間にPMVの凝集を妨げた（ 図4 ）。 最後に、BMSCの膜をPMVの調製前にCM-DiI色素で標識した（ 図5 ）。濃縮後、PMVをマウスの腓腹筋に注入し、12時間後に採取し、共焦点顕微鏡下で検査した。腓腹筋の凍結切片を、筋線維内で検出された赤色蛍光の存在について調べ（ 図5 ）、PMVがおそらくエンドサイトーシスを介して細胞質に送達されたことを実証した。赤色の蛍光（データは示されていない）、これは、PMVの大部分がエンドサイトーシスされていないか、または注入後12時間でエンドサイトーシスの開始時であったことを示す。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55741/55741fig1.jpg" /> 図1：フィルタユニットの組み立て。 （ A ）市販のポリカーボネート膜。 （ B ）20μmの対物レンズを備えた光学顕微鏡下で観察した直径3μmのトラックエッチドポア。スケールバー=50μm。 （ C ）膜を使い捨てフィルターユニットの支持マトリックスの上に置いた。 （ D ）内部に膜を有する組み立てられたフィルタユニット。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55741/55741fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55741/55741fig2.jpg" /> 図2：BMSCからのPMVの生成。 （ A ）マウス由来のBMSCを6ウェルプレートで培養した。 （ B ）BMSC（5×10 5 ）をトリプシン消化により回収し、500μLの培地で単分散させた。付着および再懸濁したBMSCの画像を、20倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡下で撮影した。 （ C ）細胞をフィルターユニットに取り付ける前にインスリン注射器に充填した。 （ D ）BMSCから生成されたPMVを35mmのガラス底皿に入れ、20倍の対物レンズを用いて倒立位相差顕微鏡下で検査した。スケールバー=40μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55741/55741fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> les / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：共焦点顕微鏡によるPMV含有量の検出。 PMVは、（ A ）ミトコンドリアの存在を追跡するためにミトコンドリア色素（1μM）で染色されたBMSC、または（ C ）ミトコンドリアの存在を追跡するために、（ A ）48時間、pEGFP-N1でトランスフェクトされたBMSCs、 BMSCをJC-1（10μg/ mL）で30分間染色して、ミトコンドリアの膜電位を確認した。 BMSCから生成されたPMVを35mmのガラス底のディッシュに載せ、100倍の油対物レンズを用いた共焦点顕微鏡検査によって検査した。スケールバー=10μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55741/55741fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55741/55741fig4.jpg" /> 図4：PMVの濃度<html> sで遠心分離する。トリプシン消化によりBMSC（5×10 5 ）を収集し、2μg/ mLのPEIを補充した0.5mLの培地に再懸濁した。生成したPMVを1,200gで5分間回転させ、100μLの培地に再懸濁し、40倍の油性対物レンズを備えた共焦点顕微鏡下で検査した。 （ A ）おそらく遠心分離後の接着分子の相互作用によって引き起こされるPMV凝集の模式図。 （ B ）PEIで荷電した後の単分散を維持するPMVの概略図。 （ C ）遠心分離後の凝集PMV。 （ D ）PMVは、PEIによる正荷電による遠心分離後の凝集が少ないことを示す。スケールバー=10μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55741/55741fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> gure 5 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55741 / 55741fig5.jpg &quot;/&gt; 図5：腓腹筋へのCM-DiI標識PMVの送達。 5×10 5の BMSCからPMVを生成し、100μLの容量に遠心分離して濃縮し、BALB / cマウスの腓腹筋にゆっくりと注入した。 （ A ）PMV注入の略図。 （ B ）CM-DiIで標識されたBMSC;スケールバー=20μm。 （ C ）CM-DiI標識BMSCから生成され、共焦点顕微鏡検査によって検査されたPMV;スケールバー=10μm。 （ D ）手術後12時間に採取した腓腹筋。スケールバー=20μm。 （ E - H ）共焦点顕微鏡で調べた腓腹筋の凍結切片;スケールバー=10μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55741/55741fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

加齢性疾患は、細胞質成分の複数の欠陥に関連している。ここでは、骨髄間葉系幹細胞から原形質膜小胞を調製するためのプロトコールを提示する。この技術は、加齢に関連した表現型を改善する、またはそれを逆転させるための細胞質置換療法の手段として潜在的に使用することができる。

潜在的細胞質置換療法のための骨髄間葉系幹細胞からの血漿膜小胞の調製

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

preparation-plasma-membrane-vesicles-from-bone-marrow-mesenchymal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K ビュー.  Shantou University. 加齢性疾患は、細胞質成分の複数の欠陥に関連している。ここでは、骨髄間葉系幹細胞から原形質膜小胞を調製するためのプロトコールを提示する。この技術は、加齢に関連した表現型を改善する、またはそれを逆転させるための細胞質置換療法の手段として潜在的に使用することができる。 

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

発生生物学

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

医学

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

自家条件で間葉系幹細胞の培養および配信：整形外科アプリケーションのためのスマートなアプローチ

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

生物工学

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

組換えコラーゲン ペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Isolation and Identification of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and their Derived Extracellular Vesicles

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of pluripotent stem cells, are favored for their instant availability and proven safety. It has been reported that transplantation of BM-MSCs is of great benefit to repairing injured tissues in various diseases, which might be related to modulating the immune and inflammatory responses via paracrine mechanisms. Extracellular vesicles (EVs), featuring a double-layer lipid membrane structure, are considered to be the main mediators of the paracrine effects of stem cells. Recognized for their crucial roles in cell communication and epigenetic regulation, EVs have already been applied in vivo for immunotherapy. However, similar to its maternal cells, most of the studies on the efficacy of transplantation of EVs still remain at the level of small animals, which is not enough to provide essential evidence for clinical translation. Here, we use density-gradient centrifugation to isolate bone marrow cells (BMC) from porcine bone marrow at first, and get porcine BM-MSCs (pBM-MSCs) by cell culture subsequently, identified by the results of observation under the microscope, induced differentiation assay, and flow cytometry. Furthermore, we isolate EVs derived from pBM-MSCs in cell supernatant by ultracentrifugation, proved by the techniques of transmission electron microscopy (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting successfully. Overall, pBM-MSCs and their derived EVs can be isolated and identified effectively by the following protocols, which might be widely used in pre-clinical studies on the transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

This article elaborates a method to isolate and identify porcine bone marrow mesenchymal stem cells (pBM-MSCs) and extracellular vesicles (EVs) derived from them, providing a methodological basis for the pre-clinical evaluation of transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

潜在的細胞質置換療法のための骨髄間葉系幹細胞からの血漿膜小胞の調製

要約

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ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

自家条件で間葉系幹細胞の培養および配信：整形外科アプリケーションのためのスマートなアプローチ

組換えコラーゲンペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

Isolation and Identification of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and their Derived Extracellular Vesicles

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