We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universita&#776;t Go&#776;ttingen.

<ol>
	<li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+revolution+in+bacteriology:+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li><li>Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF-MS-based+species+identification+and+typing+approaches+in+medical+mycology.">MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology.</a> Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).</li><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+a+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+multilocus+sequence+typing-based+Campylobacter+jejuni+subgroups+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> BMC Microbiol. 13, 247 (2013).</li><li>Reil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Clostridium+difficile+PCR-ribotypes+001,+027+and+126/078+using+an+extended+MALDI-TOF+MS+system.">Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).</li><li>Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discrimination+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhi+from+other+serovars+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).</li><li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+fingerprinting+allows+for+discrimination+of+major+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+lineages.">MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages.</a> Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).</li><li>Josten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrum+of+Staphylococcus+aureus+identifies+mutations+that+allow+differentiation+of+the+main+clonal+lineages.">Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages.</a> J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).</li><li>Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+biomarker+discovery+for+identification+of+methicillin-resistant+and+vancomycin-intermediate+Staphylococcus+aureus+strains+by+MALDI-TOF.">Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF.</a> Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).</li><li>Novais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+the+discrimination+of+high-risk+Escherichia+coli+clones+from+phylogenetic+groups+B2+(ST131)+and+D+(ST69,+ST405,+ST393).">MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393).</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).</li><li>Matsumura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Escherichia+coli+ST131+and+ST405+clonal+groups+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry.">Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).</li><li>Christner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+Strain+Typing+during+a+Large+Outbreak+of+Shiga-Toxigenic+Escherichia+coli.">Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).</li><li>Zautner, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+multilocus+sequence+typing:+universal+characterization+of+bacteria+from+domain+to+strain.">Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain.</a> Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).</li><li>Suarez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+proteins+as+biomarkers+for+bacterial+identification+by+mass+spectrometry+in+the+clinical+microbiology+laboratory.">Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory.</a> J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+of+Pseudomonas+putida+strains+by+MALDI-MS+using+ribosomal+subunit+proteins+as+biomarkers.">Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers.</a> Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).</li><li>Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+Rhodococcus+erythropolis+based+on+the+variation+of+ribosomal+proteins+as+observed+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-mass+spectrometry+without+using+genome+information.">Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information.</a> J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).</li><li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+on-target+lysis+(YOTL),+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts.">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li><li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay.">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

MSPPスキームの確立に最も重要なステップは、バイオマーカーイオンアイデンティティの明確な遺伝的決意です。それは間違いなくバイオマーカーを同定することが可能でない場合、それはスキーム13から除外されるべきです。 C.ジェジュニ SSP。doylei方式は、14の異なるバイオマーカーイオンを含んでいます。これらは、5以下Cに比較され、検出可能なCの間ジェジュニ SSP。 ジェジュニ MSPPスキーム13【選択最も大きな違いジェジュニ SSP。 ジェジュニとC.ジェジュニ SSP。doyleiバイオマーカーは、L31（-M）およびL35（-M）13の場合のアミノ末端メチオニンの翻訳後除去しました。 試験Cに示すようにジェジュニ SSP。doyleiコレクションを分離、MSPPは、すべての7つの異なるMLSTシーケンスの種類を識別することができました。これは、すべての試験された分離株は、特定のMSPPのsequに属していることを意味しますレンスタイプ。また、MSPPは、Cの間の亜種の分化を可能にしますジェジュニ SSP。 ジェジュニとC.ジェジュニ SSP。doylei。 一般には、MSPPによって以下のひずみレベルでの分離株を区別する可能性がMLSTのようなDNA配列に基づく方法に比べて低くなっています。十分に確立されたアイソフォームデータベースを仮定すると、細菌の分離株のサブタイプは、DNA配列決定法4、13と比較してはるかに速く、非常に安価です。 このような主成分分析（PCA）4、10、28またはバイナリピークマッチングの比較結果の数学的マトリックスのUPGMA分析プロファイル29,30を使用するなどICMS-スペクトルの階層的クラスタリング手法と比較してMSPPの最大の利点高い固有の再現性があります。一方、このような異なるculturなど異なる文化的諸条件電子メディア、異なる寒天料金、異なるインキュベーション温度、および異なるインキュベーション期間が大幅にPCAによって計算phyloproteomic関係に影響を与え、彼らはMSPP演繹関係6、13には影響を与えません。この高い再現性の主な理由は、一般的な13のピーク強度と質量スペクトルの質の独立性です。単離物の質量スペクトルでMSPP関連するピークは間違いなく識別することができない場合は、再度、個々の単離物の質量スペクトルを記録する必要があります。 MSPPの方法は、すべての微生物種を、原則的に、適合させることができます。特に、 クロストリジウム・ディフィシレ 、 大腸菌 、 黄色ブドウ球菌 、およびサルモネラ菌 SSP。 エンテリカのような臨床関連する微生物種のサブタイプは、潜在的な将来のアプリケーションです。毒性因子または耐性遺伝子の発現は、PHYLと相関している場合oproteomic関係、MSPPは、日常の臨床診断において革新的なツールになることができます。それによって検出可能なピークとMSPP方式に含まれるバイオマーカーイオンの数の数は、潜在的に、特に真菌31の場合には、特定の抽出及び/又は溶解プロトコルを使用することによって増加することができます。 最近使用されたMALDI-TOF技術は、主にのみ非常に豊富なリボソームタンパク質を検出することができます。これらの非常に豊富なタンパク質は、質量スペクトルにおける毒性因子としてほぼすべての他のより小さなタンパク質を妨害します。小さなタンパク質は、ESI-TOF-MS（飛行質量分析のエレクトロスプレーイオン化時間）及びHPLC（高速液体クロマトグラフィー）32を連結することによって検出することができました。しかし、現在、この方法は、より大きな分離株のコホートを特徴づけるには余りにも労力とコスト集約的です。

過去十年間の間に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）は、臨床微生物学1,2における微生物の属および種の同定のための非常に価値の標準的な方法であることが進んでいます。種の同定は、無傷細胞または細胞溶解物の小タンパク質フィンガープリントの記録に基づいています。日常的な臨床微生物学で使用される質量分析計のための典型的な質量範囲は2-20 kDaです。さらに、得られたスペクトルは、以下の種と下記亜種のレベル3での株を識別するために使用することができます。初期の先駆的な研究では、 カンピロバクター・ジェジュニ 4株の特定のサブグループ、 クロストリジウム・ディフィシル 5、 サルモネラ菌の SSPの特定のバイオマーカーイオンを同定しました。エンテリカ血清型チフス 6、 黄色ブドウ球菌 7から9、およびE12 - scherichiaは10コリ 。 対立遺伝子のアイソフォームに対応するいくつかの変数バイオマーカーの質量の組み合わせは、より深いサブタイプのオプションを提供しています。以前は、我々が正常にCに質量分析ベースphyloproteomics（MSPP）と呼ば有意義かつ再現性のphyloproteomic関係に質量プロフィールにおけるこれらの変化に変換する方法を実装しましたジェジュニ SSP。 ジェジュニ分離株のコレクション13。 MSPPは、多座配列タイピング（MLST）のようなDNA配列に基づくサブタイピング技術と質量分析と同等に使用することができます。 カンピロバクター種は、世界中で、細菌性胃腸炎14、15の主要な原因です。カンピロバクター感染後後遺症の結果として、すなわち、ギラン・バレー症候群、反応性関節炎および炎症性腸疾患は、16を生じる可能性があります。感染症の主な供給源であります鶏、七面鳥、豚、牛、羊、アヒル、牛乳と表面水15、17からの汚染された家畜の肉。したがって、食品の安全性の文脈における定期的な疫学的サーベイランス研究が必要です。 MLSTは、 カンピロバクター種18のための分子タイピングの「ゴールドスタンダード」です。サンガーシーケンシングベースのMLST法は、労働集約的であるため、時間がかかり、比較的高価な、MLSTタイピングは、比較的小さな分離株コホートに制限されています。したがって、安価で高速サブタイピング方法に対する必要性が存在します。この必要性は、MSPPのような質量分析法によって満たされる可能性があります。 本論文では、分離株doylei。 カンピロバクター SSPのコレクションを使用してMSPPタイピングのための詳細なプロトコルを提示し、MLSTとその可能性の比較。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1348">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:663px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">34967</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoflex III TOF/TOF 200 system</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">GT02554 G201</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">bacterial test standard BTS</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">604537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">BioTools 3.2 SR1</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>263564</td>
			<td>Software Package</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Bruker IVD Bakterial Test Standard</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">8290190</td>
			<td>5 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG8843</td>
			<td>ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG9143</td>
			<td>Goossens Z90</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG7790</td>
			<td>ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG9243</td>
			<td>Goossens N130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG8871</td>
			<td>NCTC A603/87</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG9255</td>
			<td>Goossens B538</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG8870</td>
			<td>NCTC A613/87</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Columbia agar base&#160;</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">1.10455 .0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Compass for FlexSeries 1.2 SR1</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>251419</td>
			<td>Software Package</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">defibrinated sheep blood&#160;</td>
			<td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany</td>
			<td>SR0051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">02854 Fluka</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HCCA matrix</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">604531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Kimwipes paper tissue</td>
			<td style="width:663px;">Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MALDI Biotyper 2.0</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>259935</td>
			<td>Software Package</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mast Cryobank vials</td>
			<td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">CRYO/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MSP 96 polished steel target</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>224989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAamp DNA Mini Kit&#160;</td>
			<td style="width:663px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:119px;">51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">water, molecular biology-grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtyping of campylobacter jejuni ssp. doylei isolates using mass spectrometry-based phyloproteomics (mspp)

MALDI-TOF MSは、ひずみレベルで、種や亜種のレベルではなくても、以下にするだけでなく、いくつかの細菌を区別する可能性を提供しています。検出可能なバイオマーカーイオンの対立遺伝子のアイソフォームを単離固有の質量シフトをもたらします。質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）ゲノムと比較して、分離株、特定の質量シフトからphyloproteomic関係の控除は、参照株の配列決定を可能にする方式では、質量分析検出可能なバイオマーカーの質量を組み合わせた新規な技術です。推定アミノ酸配列は、その後、MSPPベースの樹状図を計算するために使用されます。 ここでは、 カンピロバクター・ジェジュニの SSPを入力してMSPPのワークフローを説明します。doyleiは 7株のコレクションを分離します。すべての7株は、それらの遺伝的多様性を実証したヒト由来と多座配列タイピング（MLST）でした。 MSPPタイピングは、十分にそのPHYを反映して、7つの異なるMSPPシーケンスの種類をもたらしましたlogenetic関係。 C.ジェジュニ SSP。doylei MSPP方式は、14の異なるバイオマーカーイオン、2〜11キロダルトンの質量範囲内の大部分はリボソームタンパク質を含んでいます。 MSPPは、原則として、拡張質量範囲を有する他の質量分析プラットフォームに適合させることができます。従って、この技術は、ひずみレベル微生物タイピングのための有用なツールになる可能性があります。

以前は、我々が正常にCのMSPPスキームを確立しますジェジュニ SSP。 ジェジュニ 13。ここでは、兄弟の亜種Cにメソッドを拡張することを目的としましたジェジュニ SSP。doylei。この特定の設定では、7 C.ジェジュニ SSP。doylei分離株は、微生物/微生物学UGent BCCM / LMGゲント、ベルギーの研究室のベルギーのコレクションから取得しました。私たちの分析に使用されるすべての7分離株は、ヒト由来のものでした。元々下痢と2歳のオーストラリア人の子供の糞便から単離されたゲノム配列を決定菌株ATCC 49349（LMG 8843）は、参照を務めました。コレクションから、6つの追加の株が利用可能であった：LMG 9143、LMG 9243、およびLMG 9255は、子供の下痢に苦しんで、ブリュッセル、ベルギーに住んでいるの糞便から分離されました。ドイツからの個々の胃生検試料から単離されたLMG 7790（ATCC 49350）;そして、LMG 8870（NCTC A613 / 87）だけでなく、LMG 8871（NCTC A603 / 87）、南アフリカの子どもたちから引き出された異なる血液試料から単離し両方。 すべてのC.ジェジュニ SSP。doylei分離株は、5％O（新たに各分析のために解凍し、微好気性条件下で37℃で48時間、5％ヒツジ血液およびインキュベーションを補ったコロンビア寒天ベースを使用して培養し、精子バンクストックとして-80℃で保存しました2、10％CO 2、85％のN 2）。 CのMSPP技術の確立とは対照的に、 ジェジュニ SSP。 ジェジュニ 13は、より大きな配列コレクション由来のアイソフォームのデータベース上のメソッドをベースにすることはできませんでした。単一のC.ジェジュニ SSP。エントリをdoyleiは rMLSTデータベースに存在し、これは参照株C.に対応しましたジェジュニ SSP。doylei ATCC 49349 27。したがって、各バイオC.株と比較して検出されたマーカの質量シフトジェジュニ SSP。doylei ATCC 49349は、アイソフォームのデータベースに新しいエントリだったとサンガー配列決定によって再確認する必要がありました。 得られたCの多様性を分析するために、 ジェジュニ SSP。doylei分離株、MLSTを行い、7を含むMLSTベースUPGMA-デンドログラムはCを調べジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。（ 図1）を計算外集団としてジェジュニ株81から176まで。各C.ジェジュニ SSP。doylei分離株は2サブクラスタに落下、異なるMLST配列型に属していました。残りのCに比べて歪みLMG7790は最長の系統発生的距離を持っていましたジェジュニ SSP。doylei分離株。 C.の記録MALDI-TOF基準質量スペクトルジェジュニ SSP。doylei </em&gt; ATCC 49349は、参照スペクトルと計算された分子量の比較（ 図2）によって識別することができた14単独で帯電したバイオマーカーイオンを含有していました。 152939117、S20-M、およびS15-M（ 図3）|コレクション内では、様々なアイソフォームは、L32-M、L33、架空のGIによってコードされたタンパク質を検出しました。バイオマーカーイオンに割り当てられ、残りの質量が試験されたCで不変でしたジェジュニ SSP。doylei分離株。質量シフトに対応するアミノ酸置換は、PCR増幅および表3に記載されたプライマーを用いて、特定の遺伝子のサンガー配列決定により同定された。 表4 MSPPスキームに含まれる全てのバイオマーカーイオンのアミノ酸配列、ならびに検出された対立遺伝子のアイソフォーム。 MSPPベースphyloproteomic UPGMA-ツリー（ 図4）は、同じ7 C.について計算しましたジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。参照株におけるそれらの分子量のために、すべての14のバイオマーカーイオンの連結されたアミノ酸配列を用いて、外集団としてジェジュニ菌株81から176。各分離株は、個々のMSPPシーケンスの種類を表します。得られphyloproteomic関係はMLST、Cによって得られたものと完全に同一ではありませんでしたが、 ジェジュニ SSP。doyleiは再び2のサブクラスタに配置された分離株。 1番目のサブクラスタは、MLST解析で見られるように、LMG 8843、LMG 8870、およびLMG 9243、LMG 9255、LMG 9143、LMG 8871およびLMG 7790.によって、第2によって形成されたLMG7790はMSPP-で最長phyloproteomic距離を示した分離株分析。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig1.jpg" /> 図 1：MLST-BAsedの系統発生UPGMAツリー。バランスMLSTベースUPGMA-樹状図7 C.から構築ジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。 ジェジュニ株81から176まで。ひずみカラーコード：LMG 8843（黒）、LMG 8870（グレー）、LMG 9243（青）、LMG 9255（ターコイズ）、LMG 9143（緑）、およびLMG 8871（ピンク）、LMG 7790（黄色）、および81- 176（白）。 MLST配列型は、各分離株の名前の後ろに与えられています。すべてのC.ジェジュニ SSP。doyleiは隔離異なるMLST配列型に属します。 X軸は、結合距離を示します。ひずみLMG 7790は、残りの6つの分離株に比べ最長系統発生的距離を示しています。菌株LMG 8843、LMG 8870、およびLMG 9243と同様にLMG 9255、LMG 9143、およびLMG 8871形C.内の二つの異なるサブクラスタジェジュニ SSP。doyleiクラスタ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </A&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig2.jpg" /> 図 2：Cのゲノム相関の仮割り当て ジェジュニ SSP。doylei 観測されたバイオマーカーの大衆に ATCC 49349（LMG 8843）。C.の全ゲノム配列から予測したORFの計算塊（平均同位体比）に基づいて、 ジェジュニ SSP。ATCC 49349株をdoylei、バイオマーカーの質量はコード配列に対応するタンパク質に割り当てられていました。リボソームサブユニットL31（MW = 7315ダ）、S17（MW = 9549ダ）、およびS18（MW = 10285ダ）、ならびにそれらのデmethioninatedアイソフォーム（インセットのm / zのためしかし、測定範囲内で、バイオマーカーの塊= 7,000-7,200 Da）で明確に割り当てることができませんでした。したがって、L31、S17、およびS18は、Cに含まれていませんでしたジェジュニ SSP。MSPPスキームをdoylei。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig3.jpg" /> 図 3：Cの具体的なバイオマーカーの質量ピーク ジェジュニ SSPは。MSPP スキームをdoylei。各パネルでは、すべての7の質量スペクトルは、Cをテストしました。 ジェジュニ SSP doylei分離株（ 図1のようにカラーコード）特定のMSPPタイプに対応するには、原因対立遺伝子のアイソフォームにバイオマーカーの質量シフトを示すために重ねてきた：（A）L36 + H +; （B）L34 + H +。 （C）L32-M + H +。 （D </strong&gt;）L33 + H +。 （E）S14-M + H +。 （F）L29 + H +、L28、M + H +、およびL35-M + H +。 （G）L24-M + H +。 （H）GI | 152939117 + H +; （I）L27-M + H +。 （J）S20-M + H +。 （K）S15-M + H +。 （L）S19-M + H +。 （M）リボソームタンパク質S18の可変潜在的なバイオマーカーのピークを不明瞭に強烈な質量。 （N）、S20-M + 2H +。 （O）L15-M + 2H +。 X軸：質量[ダ]・チャージ1の比率、スケール200ダ。 Y軸：強度[任意単位]はスペクトルが個別の低強度ピークのより良い視覚化のための同等の騒音レベルに調整しました。リボソームサブユニットの名前の後に「-M」は、デmethioninatedアイソフォームを示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig3large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>eは、この図の拡大版を表示します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig4.jpg" /> 図 4：MSPPベースphyloproteomic UPGMA木描かphyloproteomic UPGMA木が同じ7 Cを含んでいます。 ジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。 図1のようにジェジュニ株81から176まで。着色されたスポット（ 図1のようにカラーコード）は、各菌株を示しています。より良い比較のための分離株は、MLSTベースの木から得られた順であった入力順に配置されています。デンドログラム以下の軸が連携距離を示しています。得られphyloproteomic関係は系統発生MLSTベースのツリーと完全に同一ではありませんが、全体像は同等です。人口は二つのグループに分割：3はLMG 8843、LMG 8870、およびLMG 9243形1 CLUSTを分離しますえー、LMG 9255ながら、LMG 9143は、LMG 8871およびLMG 7790は、第2のクラスタを形成します。このクラスタLMG 7790は、このサブクラスタのLMG内LMG 9255、LMG 9143、およびLMG 8871.によって形成されたサブクラスタに比べて最長phyloproteomic距離を示している内に9143あっても、それぞれが表す隔離MSPP法を使用して、しかしLMG 9255.との関係で位置を切り替えます個々のMSSP-シーケンスタイプ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 表 1：C.のすべての注釈付きのORFの計算大衆 ジェジュニ SSP。ATCC 49349 株をdoylei。Cで符号化された各タンパク質の全ての計算されたモノアイソトピック分子量の一覧ジェジュニ SSP。doylei ATCC 49349ゲノム。 ExPASyバイオインフォマティクスリソースポータルは、特定の分子量の計算に使用しました。 C列がデmethioninatedアイソフォームの一覧を示し、一方、列Bはmethioninatedアイソフォームが一覧表示されます。バイオマーカーの質量はCに含まれますジェジュニ SSP。doylei MSPP方式は、赤色で強調表示されます。注：バイオマーカータンパク質L36は、Cのゲノム配列に注釈を付けていませんジェジュニ SSP。ATCC49349をdoylei。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table1_calculated_masses.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 表 2：単一のSNPに起因する、アミノ酸の変化によって誘発される質量変化は、すべての潜在的な一塩基多型は、標準的な遺伝コードを使用して得られたアミノ酸交換を調べました。すべてのサイレント変異は破棄され、非同義変異は、RESUと一緒にコンパイルされました質量変化lting。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table2_mass_changes.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 表 3：Cの配列決定のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー ジェジュニ SSP。MSPP-スキームに含まれる遺伝子を doylei <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table3_Cjd_MSPP_Primer02.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 表 4：Cに含まれる全てのアイソフォームの概要 ジェジュニ SSP。doylei MSPP-方式。すべてのバイオマーカーイオンはCに含まれる。この表は、 ジェジュニ SSP。doylei MSPPの皮下ヘム。参照株ATCC 49349のアミノ酸配列が完全に与えられています。さらに、検出可能なアイソフォームの場合は、唯一の特定のアミノ酸置換が記載されています。アミノ酸番号付けは、常に、開始メチオニンを含みます。質量分析法が存在しないことを示す場合には、ブラケット（M）に書き込まれます。各アイソフォームの分子量は、質量差が示されているアイソフォームのデータセット内の株ATCCに49349アイソフォームおよび周波数を参照する。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table4_MSPP_Cjd-isoforms_V03.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）は、 カンピロバクター・ジェジュニ SSPのコレクションを入力するために使用された。doylei多座配列タイピング（MLST）と比較して、歪みレベルで分離します。

のサブタイピング<em&gt;カンピロバクター・ジェジュニ</em&gt; SSP。<em&gt; doylei</em&gt;質量分析ベースのPhyloProteomics（MSPP）を使用して分離株

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

subtyping-campylobacter-jejuni-ssp-doylei-isolates-using-mass

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

8.5K ビュー.  Universitätsmedizin Göttingen. 質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）は、 カンピロバクター・ジェジュニ SSPのコレクションを入力するために使用された。doylei多座配列タイピング（MLST）と比較して、歪みレベルで分離します。 

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Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (LC/ESI-MS) is described. DNA extraction is carried out using a silica membrane-based DNA extraction kit. After the PCR amplification using a detergent-free PCR buffer, restriction enzymes are added to the solution without purifying the reaction solution. A reverse-phase silica monolith column and a Fourier transform high resolution mass spectrometer having a modified Kingdon trap analyzer are employed for separation and detection, respectively. The mobile phase, consisting of 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, 15 mM triethylamine (pH 7.9) and methanol, is delivered at a flow rate of 0.4 ml/min. The cycle time for LC/ESI-MS analysis is 8 min including equilibration of the column. Deconvolution software having an isotope distribution model of the oligonucleotide is used to calculate the corresponding monoisotopic mass from the mass spectrum. For analysis of oligonucleotides (range 26-79 nucleotides), mass accuracy was 0.62 &#177; 0.74 ppm (n = 280) and excellent accuracy and precision were sustained for 180 hr without use of a lock mass standard.

An improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method for genotyping pufferfish species by liquid chromatography/mass spectrometry is described. A reverse-phase silica monolith column is employed for separating digested amplicons. This method can elucidate the monoisotopic masses of oligonucleotides, which is useful for identifying base composition.

液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

遺伝学

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

5 Bromouridine ラベルと免役沈降法を用いた RNA 合成の検討

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly being extended to integrative studies to enhance the understanding of molecular dynamics within cells. Current tools for the visualization and integration of proteomics with other omics datasets are inadequate for large-scale studies. Furthermore, they only capture basic sequence identify, discarding post-translational modifications and quantitation. To address these issues, we developed PoGo to map peptides with associated post-translational modifications and quantification to reference genome annotation. In addition, the tool was developed to enable the mapping of peptides identified from customized sequence databases incorporating single amino acid variants. While PoGo is a command line tool, the graphical interface PoGoGUI enables non-bioinformatics researchers to easily map peptides to 25 species supported by Ensembl genome annotation. The generated output borrows file formats from the genomics field and, therefore, visualization is supported in most genome browsers. For large-scale studies, PoGo is supported by TrackHubGenerator to create web-accessible repositories of data mapped to genomes that also enable an easy sharing of proteogenomics data. With little effort, this tool can map millions of peptides to reference genomes within only a few minutes, outperforming other available sequence-identity based tools. This protocol demonstrates the best approaches for proteogenomics mapping through PoGo with publicly available datasets of quantitative and phosphoproteomics, as well as large-scale studies.

Here we present the proteogenomic tool PoGo and protocols for fast, quantitative, post-translational modification and variant enabled mapping of peptides identified through mass spectrometry onto reference genomes. This tool is of use to integrate and visualize proteogenomic and personal proteomic studies interfacing with orthogonal genomics data.

翻訳後修飾とバリアントの高速、定量的な方法はペプチドのゲノムへのマッピングを有効に

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...