We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

ヒトの血液は、国立清華大学の治験審査委員会、新竹、台湾からの事前の書面によるインフォームドコンセント及び承認を得て、健康なボランティアから採取しました。 大腸菌における組換えHP-NAPの1式大腸菌 <ol><li> H.からHP-NAPのDNA配列を含むプラスミドpET42a-NAPを準備ピロリ菌 26695株は、以前に16を説明しました。説明したように所望の点変異を有するHP-NAPのDNA配列を含むプラスミドを準備します（プロトコル、ステップ8を参照してください）​​。 </li><li> E.に上記DNAプラスミド10ngの変換42°C、50μg/ mlのカナマイシンを含有する寒天プレートストリークLB培地（LB）上の細胞を、で45秒間熱ショックにより大腸菌 BL21（DE3）コンピテント細胞および16時間、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li> 50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地の5ミリリットルを含む個々のチューブ内の単一のコロニーを接種し、3時前培養として、それらを育てます170 rpmで振とうしながら16時間7℃です。 </li><li> 1Lのフラスコ中で50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地200ml中に上記前培養細胞を2mlに接種。約0.4から0.5 / VIS分光光度計UVによって検出さに達した600nmの吸光度まで、170 rpmで振盪しながら37℃で2時間接種し培養フラスコをインキュベートします。 </li><li> HP-NAPの発現を誘導するために最終濃度0.4mMに上記培養物中に1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の80μLを加えます。約1.6から1.7に到達した600nmの吸光度まで3時間培養をインキュベートします。 </li><li>遠心分離上清を除去するために15分間、4℃で6000×gで細胞。精製まで-70℃で細胞ペレットを保管してください。 </li></ol> HP-NAPを含有する可溶性タンパク質画分の調製注：以下の手順は全て、4℃で行われます。 <ol><li>再懸濁細胞P ​​50mlのProtocolステップ1.6で調製さエレト20 20 mMトリス - 塩酸、pH9.0の、50mMのNaClを含有する0.13 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、0.03 mMのN-αトシル-L-リジンクロロメチルケトン（TLCK）、および0.03 mlの4℃でmMのNトシル-L-フェニルアラニクロロメチルケトン（TPCK）以前16に記載されているように 。 </li><li> 4℃で7回15,000 psiの20,000の範囲で作動高圧ホモジナイザーを通して細菌懸濁液を通すことによって細菌細胞を破壊します。 </li><li>遠心分離機は、1時間4℃で30,000×gで細胞溶解物を超遠心機を使用して、可溶性および不溶性タンパク質画分を分離します。ビーカーに可溶性タンパク質画分として上清を転送します。 </li><li>製造業者の説明書に従って、標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いて、市販のキットを用いてBradford法により、可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度を測定します。 </li><li>目の20ミリリットルに1 N HClを177.6μLを追加pH8.0にpHを9.0からそのpH値を調整するためにプロトコル工程2.3から得られた電子可溶性タンパク質画分。 </li><li>最終タンパク質濃度が0.5 mg / mlとなるようにするために、上記タンパク質溶液に20mMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaClを加えます。 </li></ol> E.からの組換えHP-NAPの3精製DEAEイオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる大腸菌 <ol><li> DEAE樹脂の15ミリリットルを準備します。 <ol><li> DEAE樹脂0.6gの乾燥粉末を秤量し、少なくとも1日間、室温でmMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaCl 20 30ml中に懸濁します。 </li><li>遠心分離万xにおける樹脂 1分間4℃でグラム。 </li><li>上清を除去し、廃棄します。 </li><li> 20mMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaClを15mlを加えます。 </li><li>繰り返し議定書は3.1.2より4 3.1.4回繰り返します。 </li><li> 15mlを、その後の使用のために4℃で樹脂（30中の50％スラリーmlのTris緩衝液）を決済格納します。 注：以下の手順のすべてをSは4℃で行われます。 </li></ol></li><li>追加プロトコルで調製した可溶性タンパク質を45 mlを2.6 mlの樹脂15のステップと1時間4℃でマグネチックスターラーを有するタンパク質/樹脂スラリーをかき混ぜます。 </li><li>活栓を取り付けたプラスチックまたはガラスカラムにタンパク質/樹脂スラリーを注ぎます。樹脂は重力下で沈降することができます。 </li><li>カラム内の液面がちょうど樹脂を超えるまでタンパク質溶液を重力流によってカラムを介して実行できるようにコックを開きます。精製されたHP-NAPが含まれている非結合画分として、フロースルーを収集します。 </li><li>カラムに氷冷20mMのトリス-HCl、pH8.0の、50mMのNaClを15mlを加えます。 </li><li>カラム内の液面がちょうど樹脂を超えるまで、洗浄緩衝液は、重力流によってカラムを介して実行できるようにコックを開きます。洗浄画分としてフロースルーを収集します。 </li><li>繰り返しプロトコルが追加の洗浄画分を収集するために、3.5以上の4〜3.6倍を繰り返します。 </li><li>カラムに氷冷20mMのトリス-HCl、pH8.0の、1 MのNaClを15mlを加えます。 </li><li>カラム内の液面がちょうど樹脂を超えるまで、溶出緩衝液は、重力流によってカラムを介して実行できるようにコックを開きます。溶出画分としてフロースルーを収集します。 </li><li>繰り返しプロトコルが追加の溶出画分を収集するために、3.8以上の4〜3.9倍を繰り返します。 </li></ol> 4.バッファー交換およびDEAE樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーで精製HP-NAPのエンドトキシン除去注：精製されたHP-NAPは、Eで表現大腸菌は、好中球を刺激する前に交換し、エンドトキシン除去をバッファに供される必要があります。 <ol><li>以前24に記載のように14キロダルトンの分子量カットオフを有する透析チューブを用いて、4℃で、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）、pH7.2に精製されたHP-NAPのバッファを変更するために透析を行います。 </li><li> syringを通して透析HP-NAPをフィルタリングエンドトキシンを除去するために、4℃で2.5から4ミリリットル/分までの流量で20ミリリットル使い捨て注射器に取り付けられた、正に帯電し、親水性膜付きの電子フィルター。 </li></ol>ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ウェスタンブロッティング、ネイティブ-PAGE、ゲルろ過クロマトグラフィー、および円偏光二色性分光法による精製された組換えHP-NAPの分子特性の5キャラクタリゼーション<ol><li>マウスモノクローナル抗体モノクローナル抗体16F4 25を含むハイブリドーマ培養上清とともにSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって精製された組換えHP-NAPを分析し、先24が記載されています。 </li><li>以前26に記載されているように 、そのオリゴマーの状態を調べるためにネイティブPAGEおよびゲル濾過クロマトグラフィーHP-NAPを分析します。 </li><li>以前に26を説明したように、その二次構造を調べるために、円偏光二色性分光法によって精製された組換えHP-NAPを分析します。 </li></ol> SDS-PAGEゲルの銀染色により、HP-NAPの純度の6評価<ol><li>銀染色キットを製造業者の指示に従って溶液、銀溶液、現像液、液を停止し、洗浄液を増感、定着液を調製します。 </li><li>銀染色キットを、製造業者の説明書に従ってSDS-PAGEゲルの銀染色を行います。 </li><li>イメージング・システムでのゲルの画像を取得します。 </li></ol> HP-NAPにより誘導される好中球からのROS生産の7測定<ol><li>以前に24を説明したように、密度勾配遠心分離し、デキストラン沈降により、ヒトヘパリン化血液からヒト好中球を分離します。 </li><li>好中球からのROS産生の測定は、ルミノール依存性化学発光アッセイを使用してHP-NAPで刺激しました。 <ol><li>プレートリーダーをオンにして、37℃に温度を設定。置きプレートリーダー室内の空の平底96ウェル白色プレートに、37℃に加温することを可能にします。 </li><li>存在下および非存在下で0.9ミリモルのCaCl 2、0.5mMのMgCl 2を、13.3μM5-アミノ-2,3-ジヒドロ-1,4-フタラジンジオン（ルミノール）を含むD-PBS、pHを7.2に刺激混合物を調製しますプロトコルステップ4.2から調製0.67μMのエンドトキシン除去HP-NAPの。 </li><li> 5 mMグルコースを含む、D-PBS、pHが7.2のProtocolステップ7.1〜2×10 6細胞/ mlから調製されたヒト好中球の濃度を調整します。 </li><li> 96ウェルながら、プレートの各ウェルへの好中球懸濁液の50μlのを追加します。 </li><li>ウェル当たり5秒の時間間隔でも含む好中にプロトコルのステップ7.2.2から調製された刺激の混合物の150μLを加えます。 </li><li>プレートリーダーを用いて3時間かけてウェル当たり5秒間化学発光の発光を測定します。 </li></ol></li></ol> 8。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNAプラスミド保有するHP-NAP変異体の構築は、サイトダイレクト突然変異誘発をベース注：「サイレント」な制限部位は、部位特異的変異誘発（SDM）-assistソフトウェア28によって突然変異誘発プライマーに導入されたことを除いて、以前に27を説明したように、PCRに基づく部位特異的変異誘発は、基本的に生成しました。 <ol><li> PCR反応を行います。 <ol><li>最終的に与えて、脱イオン水を含むPCRチューブに、プラスミドpET42a-NAP 10ngの、 表1に記載の変異誘発プライマー対の1μM、デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP類）の200μM、高忠実度PCR酵素ミックスの3ユニットを追加25μlの量。 </li><li> 95でPCRサイクルを開始します 10分間°CテンプレートDNAを変性させ、1分間95℃の12増幅サイクルで追従するように、T 1分間℃〜-5 全くmはなく 、6分間72 入出力 C。 </li><li>でPCRサイクルを終えます1分間のT m頁 -5 O Cのアニーリング工程及び30分間72℃での伸長工程。 </li></ol></li><li> 2時間、37℃でのDpn I制限酵素0.4μlのPCR産物15μLを治療した後、アガロースゲル電気泳動でのDpn Iで処理したPCR産物2μlの分析。 </li><li>画面の変異体。 <ol><li> E.にPCR産物2μlのトランスフォーム42℃で45秒間熱ショックにより大腸菌 DH5αコンピテントセル。 </li><li> 50μg/ mlのカナマイシンを含むLBプレート上で形質転換細胞を広げ、37℃で16時間プレートをインキュベートします。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って商業アルカリ溶解キットを使用して細菌コロニーからのプラスミドDNAを単離します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、所望のサイレント変異の存在を確認するためにXhoI制限酵素でプロトコルステップ8.3.3で単離されたプラスミドDNAを扱います。 </li><li>シーケンスプラスミドDNAを、製造業者のプロトコルに従って、HP-NAP変異体のコード配列の修正を確認するために、T7プロモータープライマーを用いてプロトコルステップ8.3.4によって確認しました。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Brunette, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Infectious+diseases+related+to+travel.">Chapter 3, Infectious diseases related to travel.</a> CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).</li><li>Bauer, B., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+gastric+pathogen+Helicobacter+pylori+its+association+with+gastric+cancer+and+ulcer+disease.">The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease.</a> Ulcers. 2011, 340157 (2011).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Helicobacter+pylori+infection--the+Maastricht+IV/+Florence+Consensus+Report.+Gut.">Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut.</a> Gut. 61 (5), 646-664 (2012).</li><li>Evans, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).</li><li>Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+applications.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications.</a> World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).</li><li>de Bernard, M., D'Elios, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+modulating+activity+of+the+Helicobacter+pylori+HP-NAP:+Friend+or+foe?.">The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?.</a> Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+an+intramuscular+Helicobacter+pylori+in+noninfected+volunteers:+a+phase+I+study.">Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study.</a> Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP-NAP+inhibits+the+growth+of+bladder+cancer+in+mice+by+activating+a+cytotoxic+Th1+response.">HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response.</a> Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+Th2+inflammation+in+ovalbumin-induced+allergic+asthma.">The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma.</a> Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).</li><li>Del Prete, ., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+of+TH2+responses+in+Trichinella+spiralis+by+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).</li><li>Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Helicobacter+pylori+in+expression+of+antigens+and+induction+of+antibodies.">Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies.</a> World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).</li><li>Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+evaluation+of+antibodies+against+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+in+patients+with+gastric+cancer.">Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer.</a> World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).</li><li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CagA-independent+cluster+of+antigens+related+to+the+risk+of+noncardia+gastric+cancer:+associations+between+Helicobacter+pylori+and+gastric+adenocarcinoma+explored+by+multiplex+serology.">A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology.</a> Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).</li><li>Kottakis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+activates+neutrophils+by+its+C-terminal+region+even+without+dodecamer+formation,+which+is+a+prerequisite+for+DNA+protection--novel+approaches+against+Helicobacter+pylori+inflammation.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation.</a> FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).</li><li>Thoreson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+surface-exposed+antigen+expression+between+Helicobacter+pylori+isolated+from+duodenal+ulcer+patients+and+from+asymptomatic+subjects.">Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).</li><li>Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+promotes+myeloperoxidase+release+from+human+neutrophils.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).</li><li>Iyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+surface+area+chromatography+for+flow-through+purification+of+viruses+and+virus+like+particles.">Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).</li><li>Wongchuphan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+rabbit+polyclonal+immunoglobulin+G+using+anion+exchangers.">Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers.</a> Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).</li><li>Lu, X., Zhao, D., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hemoglobin+by+ion+exchange+chromatography+in+flow-through+mode+with+PEG+as+an+escort.">Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort.</a> Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).</li><li>Brooks, S. P., Storey, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+protein+phosphatase+that+dephosphorylates+pyruvate+kinase+in+an+anoxia+tolerant+animal.">Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).</li><li>Gewirtz, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+translocates+flagellin+across+intestinal+epithelia,+inducing+a+proinflammatory+response.">Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response.</a> J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).</li><li>Levison, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+ion-exchange+column+chromatography+of+proteins:+Comparison+of+different+formats.">Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).</li><li>Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+chromatography:+Progress,+applications+and+future+perspectives.">Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives.</a> Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).</li><li>Yang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+purification+of+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+overexpressed+in+Escherichia+coli.">High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli.</a> BMC biotechnol. 15 (23), (2015).</li><li>Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+attenuated+measles+virus+engineered+to+express+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).</li><li>Shih, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis.">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+'silent'+restriction+sites.">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li></ol>

HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

ここで提示DEAE陰イオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーは、 大腸菌で過剰発現する組換えHP-NAPの精製に適しています。細胞溶解および精製の ​​工程において使用される緩衝液のpH値は、EでHP-NAPの溶解性を確保するために非常に重要です大腸菌溶解物およびそれぞれの宿主細胞不純物から組換えHP-NAPの効率的な分離。細菌細胞は、pH 9.0に溶解されるべきであり、負の精製は、高収率かつ高純度でHP-NAPを得るために、pH8.0で行われるべきです。 HP-NAPの典型的な回収率は90％であり、典型的な純度は95％で24です。 HP-NAPは、非結合画分中に存在するので、樹脂の最小が、十分な量の不純物を吸収するその最大容量を達成するために使用されるべきです。この例では、最大積載量は、Eからの可溶性タンパク質の1.5 mgでミリリットル樹脂あたりの大腸菌溶解物。 専らDEDプロトコルは、50ミリリットルE.から組換えHP-NAPの精製の ​​ために設計されています大腸菌の培養。HP-NAPの収量は約15 mgです。精製プロセスは、それに応じて縮小または拡大されたいずれかであり得ます。例えば、二つの組換えHP-NAP Y101HおよびHP-NAP E97GY101H変異体を1ml 大腸菌から精製しました。このネガティブモードバッチクロマトグラフィーを用いて大腸菌培養物95％より高い純度の両方のHP-NAP変異体は、非結合画分（ 図4）を収集することによって得ました。このネガティブモードバッチクロマトグラフィーはまた、860 mlの大腸菌からの組換えHP-NAPを精製するために適用されていますcoliの培養物。DEAEネガティブモードバッチクロマトグラフィーを用いて工程の回収率は90％よりも高い純度で97％に達しています。 HP-NAPはまた、正常にこのDEAEネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって精製された枯草菌 （ 枯草菌 ）で表さ1ステップ26インチ私たちのBの枯草菌の発現系は、HP-NAPの発現レベルが低いです。 HP-NAPは細菌溶解物からの全可溶性タンパク質の約5％を占めます。精製の対象HP-NAPは、少量で存在するにもかかわらず、90％より高い純度を有するHP-NAPを効率的にほとんどすべての内因性を除去するために、樹脂上にロードされた細胞溶解物からのタンパク質の量の割合を減少させることによって得ることができますB.からのタンパク質枯草菌 26。したがって、この方法は、他の細菌宿主中で発現された組換えHP-NAPを精製するために適用されてもよいです。 いくつかの方法がその天然型14-16における組換えHP-NAPの精製の ​​ために報告されています。しかし、追加のゲルろ過クロマトグラフィー工程は、高純度でHP-NAPを得るために必要とされます。この負のクロマトグラフィー精製を効率よく1ステップで純度の高い機能的な組換えHP-NAPを得ることができます。 additiで脱塩工程を伴う非結合画分中の低塩濃度を必要としません。バッチモードの精製は、列の必要性をなくすことができました。このように、DEAE樹脂を使用して、このネガティブモードバッチクロマトグラフィーは、高い収率および純度でその天然型でHP-HAPを浄化するための簡単​​かつ効率的な方法を提供しています。この方法によって精製されたHP-NAPは、さらにワクチン、新薬、およびH.のための診断法の開発のために利用することができますピロリ菌は、疾患または他の新しい治療用途のために-関連しました。

ヘリコバクター・ピロリ （ ピロリ菌）は、胃炎や消化性潰瘍の主な原因です。この細菌はまた、1994年にそれはHの有病率と推定されている、世界保健機関の一部、国際がん研究機関により、ヒトでの発がん性物質として分類されていますpylori感染は発展途上国では70％と先進国1 30〜40％です。たとえH.の感染率ピロリ菌は 、先進国ではH.の感染率を減少しています発展途上国でのピロリ菌は依然として高い2です。 H.を根絶するための標準的な治療法pylori感染は、プロトンポンプ阻害薬、PPI、および2種の抗生物質、クラリスロマイシンプラスアモキシシリンまたはメトロニダゾール3の投与からなります。 H.における抗生物質耐性のが、上昇ピロリ関連の潰瘍の治療は、Oを防止するための新しい戦略の開発を促しますrの感染症を治します。 H.に対する予防および/ ​​または治療的ワクチン接種の開発ピロリ菌は、H を制御するための別のアプローチを提供することができますピロリ感染。 ヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質（HP-NAP）、Hピロリ菌の主要な病原性因子は、最初のH.の水抽出物中で同定されました内皮細胞との反応性酸素種（ROS）4を生成するために付着する好中球を活性化する能力を有するピロリ菌 。 H.で見つかった胃粘膜の好中球の浸潤pylori-アクティブ胃炎に感染した患者は、胃の炎症および組織損傷をもたらす可能性があります。したがって、HP-NAPはさらに潰瘍またはH.を引き起こす胃の炎症を誘発するために、好中球を活性化することによって病理学的役割を果たし得ますピロリ菌は胃の病気を-関連しました。それにもかかわらず、HP-NAPは、臨床応用5,6のための潜在的な候補です。免疫原性および免疫調節プロへHP-NAPのpertiesは、このタンパク質は、ワクチン、治療薬、および診断ツールを開発するために使用することができます。臨床試験は、Hに対するタンパク質ワクチンのコンポーネントの1つとして、組換えHP-NAPを使用するために行われていますピロリ菌 。このワクチンは、水酸化アルミニウムとともに処方組換えHP-NAP、細胞毒素関連遺伝子A（CagAタンパク質）、および空胞化細胞毒A（のVacA）タンパク質で構成され、さらに安全かつ人間7において免疫原性であることが実証されています。また、HP-NAPは、Tヘルパー1型（Th1）をトリガするために、強力な免疫調節剤として作用する癌治療の8のための免疫応答を-polarizedダウンアレルギー反応や寄生虫感染9,10によって誘発されたTh2媒介性免疫応答を調節します。診断に関しては、組換えHP-NAPベースのELISAは、HでHP-NAPに対する血清抗体を検出するために適用されていますピロリ菌は、患者11に感染し。ある研究では、Hからの血清中のHP-NAP特異的抗体のレベルことを示しましたパラグアイロリは胃癌の患者は慢性胃炎12を有する患者からのものよりも有意に高かったに感染し。別の研究では、HP-NAPに対する血清抗体は、非噴門、胃腺癌13の存在と関連していることが示されました。従って、組換えHP-NAPベースのELISAは、Hで胃癌の予後のためのHP-NAPに対する血清抗体を検出するために適用することができますピロリ菌は、患者に感染し。まとめると、精製されたHP-NAPは、さらに予防、治療、およびHの予後のために利用することができますピロリ菌は、病気だけでなく、癌治療を-関連しました。 これまでに報告され、その天然の形態で（ 大腸菌 ） 大腸菌で発現された組換えHP-NAPの精製に使用されるいくつかの方法の中でも、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む第二の精製工程は、高純度のHP-NAP 14-16を得るために必要とされます。ここでは、負モードバッチクロマトグラフィーを用いた方法ジエチルアミノエチル（DEAE）イオン交換樹脂は、Eで過剰発現HP-NAPの精製の ​​ために記載されています高収率、高純度で大腸菌 。この精製技術は、宿主細胞のタンパク質および/または樹脂HP-NAP以外の不純物の結合に基づいていました。 pH8.0で、HP-NAPを除いてほとんどなく、他のタンパク質は、非結合画分から回収されます。ネガティブモードでDEAEイオン交換クロマトグラフィーを使用して、この精製アプローチは、非結合画分のコレクションを1段階クロマトグラフィーにより組換えHP-NAPの精製を可能にすることにより、簡単かつ時間の節約です。 図17に示すように 、免疫グロブリンG（IgG）18、ヘモグロビン19、タンパク質ホスファターゼ20、および毒性因子フラジェリン21ウイルスなどの、負にイオン交換クロマトグラフィーによって精製することが報告されているようなHP-NAP、いくつかの他の生体分子に加えてモード。不純物が軽微である場合、ネガティブモードでは、イオン交換クロマトグラフィーが好ましいです22を精製するために供される試料中に存在する成分。天然または組換え生体分子の精製における負のクロマトグラフィーの適用は、最近23を検討されています。 本レポートでは、 大腸菌における組換えHP-NAPの発現のためのステッププロトコルでステップを提供しますDEAEイオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーを用いて大腸菌細胞の溶解、およびHP-NAPの精製。精製のために、所望のタンパク質は、ネガティブモードでのイオン交換クロマトグラフィーに適している場合、記載されたプロトコルはまた、精製プロセスの開発のための出発点として適合させることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET42a-NAP&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&#160; 
			https://www-sciencedirect-com.remotexs.ntu.edu.sg/science/article/pii/S0006291X08018317</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>MD Biomedical Inc</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&#38;supplier=search&#38;name =IPTG%20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7254</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4376</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td>Bio&#8208;Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>for protein quantitation 
			http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5619&#160;</td>
			<td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE&#8211;Sephadex &#160;A-25 chloride form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum/Por dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132720</td>
			<td>with molecular weight cutoff of 14 kDa 
			http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc&#174; units with Mustang&#174; E membrane</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MSTG25E3</td>
			<td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min 
			http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&#160; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA 
			https://www-sciencedirect-com.remotexs.ntu.edu.sg/science/article/pii/S0264410X10017585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28989335</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne silver staining kit, protein</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1150-01</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well white plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>236108</td>
			<td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>protected from light 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand &#160;long template PCR system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td>source of High Fidelity PCR enzyme mix 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xho I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Product Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin Inc</td>
			<td>C315320</td>
			<td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi Koki Co</td>
			<td>90106401</td>
			<td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates 
			http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1900-26</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td>
			<td>Aviv Biomedical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 imaging system</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>discontinued and replaced 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>1420-018</td>
			<td>for chemiluminescence detection 
			http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

ヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質（HP-NAP）は、 ヘリコバクター・ピロリ （ ピロリ菌 ）の主要な病原性因子です。それは、Hで重要な役割を果たしていますピロリ菌は、好中球、単球、およびマスト細胞を含むいくつかの先天性白血球を活性化することによって、胃の炎症を誘発しました。 HP-NAPの免疫原性および免疫調節特性はH.のための潜在的な診断およびワクチン候補となりますピロリ菌および癌治療のための新薬候補。その臨床応用に使用される精製されたHP-NAPの実質的な量を得るために、高い収率及び純度で、このタンパク質を精製する効率的な方法を確立する必要があります。 このプロトコルでは、ジエチルアミノエチル（DEAE）イオン交換樹脂を使用して、 大腸菌 （E. coli）中で過剰発現組換えHP-NAPのワンステップネガティブクロマトグラフィー精製の ​​ための方法を記載している（ 例えば 、セファデックス）をiがn個のバッチモード。組換えHP-NAPは、E中の全タンパク質の約70％を構成しています大腸菌とは、ほぼ完全にpHが9.0で、細胞溶解の際に可溶性画分に回収されます。 pH8.0の最適条件の下では、HP-NAPの大部分は、非結合画分に回収される一方、Eからの内因性タンパク質大腸菌を効率的に樹脂によって除去されます。 DEAEイオン交換樹脂を用いてネガティブモードバッチクロマトグラフィーを使用して、この精製方法は、Eからの機能HP-NAPを生じます高い収率および純度でその本来の形で大腸菌 。精製されたHP-NAPは、さらに予防、治療、およびHの予後のために利用することができますピロリ菌は、病気だけでなく、癌治療を-関連しました。

組換えHP-NAPの負の浄化の実験手順の概略図は、Eで表現しましたバッチモードでDEAEイオン交換樹脂を用いて、 大腸菌は 、図1に示されている。この精製技術は、宿主細胞タンパク質および/ ​​または樹脂HP-NAP以外の不純物の結合に基づいています。 pH8.0で、その本来の形でのHP-NAPを除いてほとんどない他のタンパク質は、非結合画分（ 図2AおよびB）から回収されます。非結合画分中の精製HP-NAPは、HP-NAP（ 図2C）に対する抗体により免疫検出し、銀染色（ 図2D）によって確認されるように、その純度は97％以上でした。ネイティブPAGE（ 図2B）およびゲル濾過クロマトグラフィー（ 図3A）によって分析した以外に、精製された組換えHP-NAPは、オリゴマー形態を保ちます。円偏光二色性spectroscopIC分析は、精製されたタンパク質は、主にαヘリックス（ 図3B）から成ることを示しました。また、精製されたHP-NAPはROS（ 図3C）を生成するために、ヒト好中球を刺激することができました。したがって、この方法によって精製された組換えHP-NAPは、生物学的活性を有するその天然の形態です。また、この負モードバッチクロマトグラフィーは、一段階での点突然変異を有する組換えHP-NAPを精製するために使用することができる。 図4に示すように、2つの組換えHP-NAP Y101HおよびHP-NAP E97GY101H変異体 H.のHP-NAPを模倣しますピロリ NCTC 11639およびNCTC 11637株を、それぞれ、95％よりも高い純度のこのネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって精製しました。 HP-NAPを精製するためにDEAE樹脂を用いたネガティブモードバッチクロマトグラフィーを実施するため、精製のために使用されるバッファーのpHは8.0に調整されるべきですHP-NAPの大半は非結合画分に存在していることを確認します。緩衝液のpH値は、8.0（ 図5）よりも高いか低くなったときにHP-NAPのより少ない量は、非結合画分に存在しました。 pHが9.0に7.0から増加すると、非結合画分におけるHP-NAPの存在の純度が少し増加したにもかかわらず、緩衝液のpH値はpHがあったときに、未結合画分中のHP-NAPの存在量が最も高かったです8.0（ 図5）。樹脂上にロードされた細胞溶解物からの可溶性タンパク質の量は、この精製のための別の重要な因子です。ここでは、比は、Eから不純物を吸収する樹脂の最大容量を達成するためのミリリットル樹脂あたりのタンパク質の1.5 mgで大腸菌 （ 図6）。また、この負モードバッチクロマトグラフィーによって得られた純度およびHP-NAPの収率は実質的に可溶性画分にHP-NAPの存在量を増加することによって増加させることができますE.は、溶解物を大腸菌 。組換えHP-NAPは、ほぼ完全にpHが9.0（ 図7）で細胞溶解時の可溶性画分に回収されました。にもかかわらず、 大腸菌における組換えHP-NAPの溶解度細胞が9.0よりも低いpHを有する緩衝液で溶解したとき、細胞は7.5（ 図7）よりも高いpHを有する緩衝液で溶解したとき、 大腸菌溶解物が著しく増加した、HP-NAPの90％未満では、可溶性タンパク質として存在していました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig1.jpg" /> 図1：バッチモードでのDEAE樹脂によるHP-NAPの負の精製の ​​概略概要精製は、バッチ結合手順を開始します。細菌溶解物から得られたHP-NAPを含有する可溶性タンパク質画分を、DEAE樹脂pH8.0のトリス緩衝液で予め平衡化に添加されます。タンパク質/樹脂スラリーは、その後、緩やかにmixiの1時間4℃でインキュベートされngの。インキュベーション中に、宿主細胞のタンパク質が樹脂に結合します。非結合画分中のHP-NAPの存在を集め、遠心分離後の上清または重力流によって実行カラムからのフロースルー画分のいずれかによって得られる。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig2.jpg" /> 図2：DEAEイオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーによるHP-NAPの精製結果の一例 Eの全細胞溶解物（W）および可溶性タンパク質画分（S）。 HP-NAP及びDEAEイオン交換クロマトグラフィーからのHP-NAPを含有する非結合画分（U）を発現する大腸菌 BL21（DE3）をSDS-PAGE（A）、ネイティブPAGE（B）、およびウェスタンブロッティング（C）により分析しました。結合していないFRAC1μgから10μgの範囲のタンパク質の指示量にションは銀染色SDS-PAGEゲル（D）で分析しました。 kDaの中分子量（M）は、染色ゲルおよびブロットの左側に表示されています。 （参照24から適応） <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig3.jpg" /> 図3：構造および E から精製された組換えHP-NAPの機能解析 ネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって 大腸菌 （A）は、UV吸光度プロファイルは、ゲル濾過カラムから溶出したHP-NAPについて記録しました。タンパク質マーカーの分子量は、クロマトグラム上に示されました。 （B）遠紫外円二色性SPECTHP-NAPのラムは、195〜260ナノメートルの波長範囲で記録しました。 （C）ヒト好中球（1×10 5細胞）を37℃で陰性対照として、0.5μMHP-NAPとD-PBS、pHは7.2で処理しました。 ROSの含有量は、ルミノール依存性化学発光アッセイを用いて連続的に測定した好中球から生成されます。データは三連での実験の平均値±標準偏差として表しました。 （参照24から適応） <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig4.jpg" /> 図4：Eに発現された組換えHP-NAPの変異体の精製 ネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる 大腸菌 。E.の可溶性タンパク質画分大腸菌 BL21（DE3）は、2つの組換えHP-NAP Y101HおよびHP-NAP E97GY101H変異体を発現し、野生型のHP-NAPはDEAE樹脂とネガティブモードクロマトグラフィーにより精製しました。未結合画分をSDS-PAGEによって分析した。kDaの中の分子の質量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig5.jpg" /> 図5：Eに発現された組換えHP-NAPの精製に緩衝pHの影響 ネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる 大腸菌 。E.の可溶性画分pHを9.0に溶解したHP-NAPを発現する大腸菌 BL21（DE3）は、7.0から9.0の範囲のpHを示し、および0.3 mg / mlのタンパク質濃度に調整しました。これらの調整画分を、その後4℃でネガティブモードバッチクロマトグラフィーによって、組換えHP-NAPを精製するためにDEAE樹脂上にロードし、負荷として示します。非結合、洗浄、および溶出画分をSDS-PAGEにより分析しました。 kDaの中分子量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 （参照24から適応） <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig6.jpg" /> 図6：E.において発現ピュリ組換えHP-NAPのためにDEAE樹脂上にロードされたタンパク質の量の影響 大腸菌 。E.の可溶性タンパク質画分大腸菌 BL21（DE3）を発現するHP-NAPは、に従って、DEAE樹脂にロードしました recombiを精製する樹脂のミリリットル当たりミリグラムのタンパク質示さ比NAntのHP-NAP pH8.0のネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる。可溶性タンパク質は、負荷（L）、非結合画分（A）、洗浄画分（B）、およびSDS-PAGEにより分析した溶出画分（C）として示します。 kDaの中分子量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 （参照24から） <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig7.jpg" /> 図7： 大腸菌 におけるHP-NAPの溶解度に及ぼすpHの影響 大腸菌 溶解物。（A）E. HP-NAPを発現する大腸菌 BL21（DE3）は、7.0から9.5の範囲のpHで示された氷冷Tris-HCl緩衝液に懸濁しました。細胞を溶解し、次いで、全細胞溶解物（W）は、Tを遠心分離しO可溶性画分（S）及び不溶性ペレット（I）を分離。タンパク質は、SDS-PAGEにより分析しました。 kDaの中分子量（M）は染色ゲルの左側に表示されています。 （B）各pHにおける全細胞溶解物中の組換えHP-NAPの溶解性の割合は、全細胞溶解物（Wのそれで割った可溶性画分（S）のためのSDSゲル上でHP-NAPバンドの強度から算出しました。 ）。データは、少なくとも2つの実験の平均値±標準偏差として表しました。 （参照24から） <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54043/54043tbl1.jpg" /> 表1： 突然変異誘発のために使用されるプライマー。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043tbl1large.jpg" target="_blank">CLください</a>この表の拡大版を表示するには、こちらICK。

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One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

バッチモードでジエチルアミノ樹脂を使用して、 大腸菌中で過剰発現組換えヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質（HP-NAP）のワンステップ負精製が記載されているため、高い歩留まり方法。この方法によって精製されたHP-NAPはH.のためのワクチン、薬、または診断薬の開発のために有益ですピロリ菌は、病気を-関連しました。

ワンステップの負のクロマトグラフィー精製<em&gt;ヘリコバクター・ピロリ</emで過剰発現&gt;好中球活性化タンパク質<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;バッチモードでの

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

9.6K ビュー.  National Tsing Hua University. バッチモードでジエチルアミノ樹脂を使用して、 大腸菌中で過剰発現組換えヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質（HP-NAP）のワンステップ負精製が記載されているため、高い歩留まり方法。この方法によって精製されたHP-NAPはH.のためのワクチン、薬、または診断薬の開発のために有益ですピロリ菌は、病気を-関連?...

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Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

免疫・感染学

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

神経病原の非侵襲的モデル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;新生ラットにおける感染

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

の高分解能電子顕微鏡<em&gt;ヘリコバクター·ピロリ</em鉄の可用性の変化する条件で生産&gt; CAG IV型分泌系線毛

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

ヒトの過剰発現と精製<em&gt;シス</em&gt; - プレニルトランスフェラーゼ<em&gt;大腸菌</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...