この作品は、Carraresi財団と欧州糖尿病財団（EFSD）によって賄われていました。 GPは、ミラノの大学のポスドクフェローシップによってサポートされています。著者は、COSTアクションFA1201 Epiconceptのメンバーである：エピジェネティクスとPericonception環境とコストのアクションBM1308共有は大型動物モデル（サラーム）に進みます。 TALBはCOSTアクションCM1406エピジェネティックなケミカルバイオロジー（EPICHEM）のメンバーです。

注：以下で説明するすべての手順は、無菌条件下で層流フードの下で実行する必要があります。その取り扱いを通して37℃に維持されているすべての培養手順は、サーモスタット制御ステージと細胞上で行われていることを確認します。 1.皮膚線維芽細胞の単離<ol><li>文化ディッシュ用塗布液を調製<ol><li>水（最終濃度0.1％）100mlにブタゼラチンを0.1gを溶解させます。オートクレーブで溶液を滅菌します。 </li><li> 35ミリメートルペトリ皿に無菌0.1％ブタゼラチンの1.5ミリリットルを追加します。室温でそれらを維持し、コートに2時間待ちます。 注：ヒト皮膚生検は、前腕の前面の無血管領域に局所麻酔下で切除することによって回収し、使用前に+4℃で2％抗生物質抗真菌溶液を補充したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に格納されています。 </li></ol></li><li>新しいPBSで洗浄生検は2％antibiを補っ耳の抗真菌ソリューション。 </li><li>場所の100ミリメートルペトリ皿の中の生検とは、滅菌メスで約2mm 3の断片に切断します。 </li><li>断片をメッキする直前に塗布液の過剰分を削除します。 </li><li>プレコート35ミリメートルペトリ皿に5-6皮膚の断片を配置します。 </li><li>線維芽細胞培養培地を調製：77％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース、20％ウシ胎児血清（FBS）、1％L-グルタミン溶液、2％抗生物質抗真菌溶液。 </li><li> 5％CO 2中で37℃で各フラグメント（断片あたり通常100μl）を、文化、それらの上に繊維芽細胞培地の液滴を追加します。 </li><li> 24時間後、5％CO 2中37℃で湿ったそれらを保つために断片上で線維芽細胞培養培地500μlを追加します。 </li><li>少なくとも一度は48時間ごとにピペットで培地を変更します。 </li><li>インキュベーションの6日後、慎重に組織片を除去し、それらを捨てます。 注：6日後、線維芽細胞sが組織片から成長し、細胞単層を形成するために開始することを開始します。 </li><li>培地を更新し、線維芽細胞培養培地2mlを追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞単層培養を続けます。 </li></ol> 2.線維芽細胞培養<ol><li> 37℃での培養線維芽細胞を5％CO 2中で80％コンフルエントになるまで</li><li>継代のために組織培養皿から吸引線維芽細胞培養培地。 4mlのPBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。 </li><li>トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。 </li><li>トリプシンの作用を中和するために線維芽細胞培養培地の9部を、細胞懸濁液を希釈します。遠心分離は必要ありません。 </li><li>新しい培養皿でプレート細胞（と5％CO 2インキュベーター内で37℃でゼラチンアウト）と文化。成長率に応じて、4：2と1：1の間の通路比を保持します。 </li><li>細胞は約80％のコンフルエンス、通路それら（通常は週2回）に達したとき。 </li></ol>エピジェネティックな変換のための3線維芽めっき<ol><li>細胞培養皿に（1.1で説明したように準備し）0.26ミリリットル/ 0.1％のブタゼラチンのcm 2で追加します。コー​​トに2時間待ちます。 </li><li>線維芽細胞をプレーティングする前に塗布液の過剰10月30日分を削除してください。 </li><li>培養皿から線維芽細胞培養培地を除去します。 PBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。 </li><li>トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。 </li><li> fibroblの9部で細胞懸濁液を希釈トリプシンの作用を中和するAST培地。 </li><li>室温で顕微鏡下で計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 7.8×10 4個の線維芽細胞/ cm 2の細胞濃度を得るために、細胞を再懸濁するために線維芽細胞培養培地の必要量を計算します。これは、使用室の特定のタイプに依存します。 細胞/μlの=小グリッド×90（増倍率）×希釈あたりの細胞の平均数</li><li>室温で5分間150グラムで遠心し細胞懸濁液。上清を除去し、線維芽細胞培養培地の以前に計算された量で細胞を懸濁します。 </li><li> 0.1％ゼラチンプレコートディッシュ、5％CO 2インキュベーター中で37℃で24時間培養して上プレート細胞。 </li></ol>脱メチル化剤5-アザCRを使用して4.増加​​細胞の可塑性<ol><li> 0日目<ol><li> DMEM高グルコースメディ10ml中5-アザCRの2.44ミリグラムを溶解させることによって、5-アザ - CRストック溶液を調製しますええと。濾過により滅菌します。使用直前に5アザ-CRの株式を準備します。 </li><li>線維芽細胞培地（最終濃度1μM）1ml中、5-アザ - CRストック溶液1μlを希釈します。 </li><li> 、細胞プレーティング（小見出し3.8）24時間後の細胞の可塑性を高めるために、播種された線維芽細胞から培地を除去し、5％CO 2インキュベーター内で37℃で18時間、1μM5-アザCR原液と文化を追加します。 </li></ol></li><li> 1日目<ol><li> 表1に記載されているように、新鮮なヒト多能性（HP）培地を準備します。 </li><li> 1μM5-アザCRとのインキュベーション後、培地を除去し、5-アザCRが洗い流されることを保証するために、PBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li> 5-アザCR 5％CO 2中で37℃で3時間（回復期間）は、HP培地で線維芽細胞を処理した培養します。 </li><li>回復期間の後、培地除去し、PBSで3回洗浄します。 </li><li> 5-アザCR処理の効率を監視するには、このステップfで確認または形態学的変化の存在は、（結果セクションで詳述します）。細胞は、線維芽細胞の典型的な細長い形態を失い、拡大核と、サイズが小さくなって、円形または楕円形の形状を取得します。 </li><li>膵臓分化に進みます。 </li></ol></li></ol> 5.膵臓分化プロトコル<ol><li>日1-6 <ol><li> 表2に記載されているように膵臓基礎培地を準備します。 </li><li>原液をアクチビン準備：滅菌水の166.6μlの組換えヒトタンパ​​ク質をアクチビン5μgのを溶解します。 </li><li>文化5は、アザ- CR 5％CO 2インキュベーター中、37℃で6日間（5.1.2を参照）1μL/ mlのアクチビン原液を補充し、0.26ミリリットル/ cmの膵臓基礎培地の2に線維芽細胞を処理しました。毎日培地に変更します。 </li></ol></li><li>日7-​​8 <ol><li>レチノインACIの50 mgのジメチルスルホキシド（DMSO）16.6 mlで添加することによって、レチノイン酸のストック溶液を調製D。 </li><li>膵臓基礎培地の0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞/ mlのアクチビン原液（5.1.2を参照）、37℃で2日間、1μL/ mlのレチノイン酸原液（5.2.1を参照）1μlの補足しました5％のCO 2。毎日培地に変更します。 </li></ol></li><li>日9-36 <ol><li>膵臓基礎培地0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞（v / v）のインスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、2％（v / v）のB27および0.1％（v / v）の組換えヒトFGFは、基本1％を補充しました5％CO 2インキュベーター中、37℃で（のbFGF）原液（ 表1参照）。最初の15日間、毎日培地を変更します。 </li><li>以降16日目からは、培養皿の底から切り離すことが集計セルを形成するので、顕微鏡下で、一日おきに培地を更新します。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. 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L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li><li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons.">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine.">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li><li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation.">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li><li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells.">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li><li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells.">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li><li>Plath, K., Lowry, W. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells:+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation.">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

本原稿は、組織特異的な誘導プロトコールに続いて5-アザCR、過渡および短時間の曝露を介して、インスリン産生細胞へのヒト皮膚線維芽細胞の変換を可能にする方法を説明します。このアプローチは、転写因子またはマイクロRNAの強制発現や細胞がより不安定とミス14になりやすいなり安定した多能性状態の取得、なし、中胚葉から内胚葉関連細胞への切り替えを可能にします。 第1のステップでは、細胞の可塑性は、最終分化細胞に一過性、可逆的な寛容状態を誘導する合成エピジェネティックな修飾子のおかげで増加します。具体的には、5-アザCRは、皮膚線維芽細胞の全体的なメチル化の減少を引き起こすために使用されました。 5-アザCR直接メチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、新たに合成されたDNAに新規メチル化を防ぐことが知られています。理由は、その効果の、この分子以前にサイレント遺伝子を再活性化するだけでなく、真核細胞15,16の分化状態を変更するために使用されています。これと一致して、ポスト5アザ- CRの皮膚線維芽細胞は、本実験に用いられる細胞内で可塑性を増加させる5-アザCR能力を示す、グローバルDNA脱メチル化（ 図2A）を示しました。これは、5-アザCRは、神経球細胞（NSCの）17で高可塑性関連マーカーOct-4の発現を促進するという観察と一致してもです。しかし、そのポスト5-アザCRの皮膚線維芽細胞は、5-アザCRを除去した後、元の表現型に戻す興味深いです。確かに、私たちは以前より高い可塑性の状態を取得したことを示す、線維芽細胞は、多能性関連因子9,10の調節された発現ダウン、元の培養培地に戻されていることを実証し、エピジェネティックな修飾子に応じて、可逆的、一過性であり、関与しませんトンの恒久的な修正彼は細胞。 細胞形態のマークの変更は、より高い可塑性状態（ 図2A）の誘導を伴います。未処理の線維芽細胞の典型的な細長い細胞体は、分化した細胞のそれよりも大きく現れた小さな寸法の増大、核の容積を提示円形又は楕円形の細胞で置換しました。丹羽は、多能性関連機能18として記載リラックスしたクロマチン構造に、この核の拡大を相関していました。空胞化、核や顆粒状細胞質だけでなく、増加した平坦化形態の存在は、明らかでした。記載された全ての形態学的変化は、実質的に、変換プロトコルの最初の部分が正常に完了するためのマーカーとして使用することができます。変更が存在している私たちの経験では、5-アザCRは確かにもっと寛容な状態を取得するための細胞を支援してきました。 この過渡的「高PERMISを活用することが可能です完全に異なる表現型に向かってセルを駆動するsivityタイムウィンドウ」。本プロトコルは、ポスト5-アザCR線維芽細胞は、特定の分化培地に応答して、膵臓のβ細胞様細胞に再アドレスすることができることを示している。使用されるプロトコル細胞は内胚葉系統に属する細胞集団に中胚葉由来の細胞型から切り替えることができます。 未処理の皮膚線維芽細胞にもともと検出不可能であったインスリンは、分化プロトコル（ 図3B）の終わりに陽性でした。その外分泌、内分泌、及び管細胞集団、特定のベータ - 細胞系列の横に - これは、膵臓全体の分化に関与PDX1のような他の因子の同時発現を伴っていました。これは、ベータ細胞への適切な分化が未熟細胞は、パーソナルプラグインで積層した場合にのみ達成されたことを示す、マウス胚性幹細胞に関する以前の仕事（ESC）と一致していますランゲルハンスアーキテクチャの膵島により提供局所微小環境は、強力な機能的役割を有することが示唆R内分泌細胞19。 実際、EpiCCは成熟分化した表現型を達成し、20 mMのグルコース曝露（ 図3）に応答する能力を示しました。インスリンは、積極的にインスリン産生のもの（ 図3C）としてEpiCCの真正性を確認し、D-グルコース刺激の1時間後に培養培地中に分泌されました。 成功の手順のための明確な要件は、無菌層流および顕微鏡下での処理を含むすべての工程にて、37℃で細胞を厳密に維持することです。我々の経験では、また非常に培養前におけるそれらの使用、新鮮に試薬を準備するために、プロトコルに応じて厳密に培地を更新することをお勧めします。この操作は、成形集約細胞ので、顕微鏡下で実施しなければなりません培養皿の底から切り離し、培地交換の際に失われることがあります。 エピジェネティックな変換プロトコルは、正常ヒトについて記載したものと同一の細胞数/ cm 2で脱メチル化剤の濃度を用いて、ブタの種、並びにイヌ（原稿提出）に適用されています。 結論として、他の細胞型への皮膚線維芽細胞の変換を可能にするプロトコルがここに提示されています。説明の戦略は、エピジェネティックベースのセル変換の利点があります：がんを引き起こすことができる細胞の後ろに残すことができる多能性状態を回避するために、すなわち可能性を。細胞内での余韻の変化を引き起こす可能性が外因性の遺伝的要因の排除。これらの利点は、翻訳医学アプリケーションのための本発明のアプローチは非常に有望にし、患者の特定の細胞治療を可能にします。

再生医療の基本的な目的は、修理または損傷置き換えるために使用することができる新しい機能細胞の生成は、組織を縮退します。別の細胞型からそれらを変換することによって、新しいものに容易に利用可能な成体細胞をリメイク、必要な細胞集団が豊富なまたはアクセスすることは困難ではない場合は特に、特に魅力的なアプローチです。しかし、成体細胞が著しく安定しています。彼らは成熟した端末専門に達すると、彼らは安定して1を保持し 、そのオプションの緩やかな制限を介して自分の分化状態を取得します。 体細胞（IPS）の多能性への再プログラミングを可能にするプロトコルの数が開発されている最後の年では、転写のセットは2,3因子の強制発現によって達成。あるいは、細胞の変換は、単一の4を導入し 、直接系列分化転換することによって得ることができます</supは&gt;または転写の組み合わせは、5-7因子 。この戦略は、脱分化状態を経て移行を伴うが、特定の転写因子8の高発現を必要としません。 我々は最近、シチジン類似体5-アザシチジン（5-アザCR）、よく特徴付けられたDNAメチル化酵素阻害剤の脱メチル化特性に成体細胞の短時間の暴露に基づいて、変換プロトコルを開発しました。脱メチル化工程は、直ちに必要な端末の表現型を得ることを可能にする特異的な分化プロトコール9-11が続きます。この方法は、異なる系統の細胞への成熟、分化した細胞に変換することができ、ウイルスベクターを使用すると、任意の外因性の転写因子のトランスフェクションの両方を避けるために実質的な利点を有しています。セルの不安定性への安定した多能性状態の取得、及び関連する感受性の増加も避けられます。 <p class=「jove_content &quot;&gt;ここに提示され、完全に機能するインスリン分泌細胞への成人ヒト皮膚線維芽細胞の変換を可能にする詳細なプロトコール。しかし、種々​​の分化経路に向けてセルをアドレス指定するとき技術は、異なる細胞型に適用され、肯定的な結果を生成したことは注目に値します。さらに、エピジェネティックな変換が成功したアプローチの広い有効性と堅牢性を示唆している（原稿は提出）は、ヒトおよびブタの種9-13ならびに犬で使用されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5652</td>
			<td style="width:408px;">PBS; for cell wash and solution preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5955</td>
			<td style="width:408px;">Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:155px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">83.3902</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Porcine Gelatin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td style="width:408px;">For dish coating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W3500</td>
			<td style="width:408px;">For solution preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">35 mm petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">83.39</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41966052</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10500064</td>
			<td style="width:408px;">FBS; Component of Fibroblast and HP media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">L-Glutamine solution</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td style="width:408px;">Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS</td>
			<td style="width:155px;">Hycor Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">87144</td>
			<td style="width:408px;">Cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">5-Azacytidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2385</td>
			<td style="width:408px;">5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31550031</td>
			<td style="width:408px;">For HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31885023</td>
			<td style="width:408px;">For HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828028</td>
			<td style="width:408px;">Component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td style="width:408px;">Component of HP and Pancreatic Basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td style="width:408px;">Component of HP and Pancreatic Basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Guanosine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6264</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Adenosine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4036</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Cytidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4654</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Uridine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Thymidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1895</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Millex-GS 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td style="width:408px;">For sterilizing of solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PHG0261</td>
			<td style="width:408px;">bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3311</td>
			<td style="width:408px;">BSA; Component of Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320074</td>
			<td style="width:408px;">For Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587010</td>
			<td style="width:408px;">Component of Pancreatic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502048</td>
			<td style="width:408px;">Component of Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Activin A Recombinant Human Protein</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PHG9014</td>
			<td style="width:408px;">For Pancreatic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Retinoic Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2625</td>
			<td style="width:408px;">For Pancreatic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:408px;">DMSO; for Retinoic Acid stock preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41400045</td>
			<td style="width:408px;">ITS; for Pancreatic Final medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Anti-Vimentin antibody&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab8069</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32670</td>
			<td>DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution&#160; 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">5-Methylcytidine</td>
			<td style="width:155px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;">MMS-900P-B</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Anti-C Peptide antibody&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab14181</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Anti-PDX1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab47267</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Mercodia Insulin ELISA</td>
			<td style="width:155px;">Mercodia</td>
			<td style="width:119px;">10-1113-10</td>
			<td>For insulin release detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epigenetic conversion as a safe and simple method to obtain insulin-secreting cells from adult skin fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

皮膚生検からの初代培養の確立 皮膚生検を小片に切断し、ゼラチンプレコート皿に入れました。 6日後、線維芽細胞は組織断片から成長し始め、細胞単層（ 図1A）を形成しました。細胞は、典型的な細長い形状を示したと、期待どおりに、線維芽細胞特異的マーカーであるビメンチン（Vimの、 図1B）のために均一な免疫陽性を示しました。 5-アザ-CRに18時間曝露後の形態学的変化および皮膚線維芽細胞のメチル化パターン インスリン分泌細胞への線維芽細胞の正常なエピジェネティックな変換を得るために、我々は、5-アザCR、脱メチル化剤を使用して、可塑性を増加させました。ヒト線維芽細胞は、7.8×10 4線維芽細胞/ cm 2の濃度で0.1％ゼラチンを予めコートディッシュ上にプレーティングしました。ワット、細胞を播種した後二十四時間ERE 18時間1μmの5-アザCRと共にインキュベートしました。 この処理の終了時に、細胞表現型の大規模な変化が（ポスト5-アザCR、 図2A）見えました。未処理の線維芽細胞（T0、 図2A）の典型的な細長い形態は、円形または楕円形で置き換え、細胞サイズがかなり小さくなりました。細胞質は、粒状であった平坦化、及び細胞が培養表面に付着しました。核は大きく登場し、リラックスしたクロマチン構造の結果として、空胞。我々の経験では、これらの形態学的変化の存在が不可欠であり、慎重に5-アザCR処理の効率のマーカーとして監視されなければなりません。 5-アザ-CRに18時間曝露した後、グローバルなDNAメチル化の急激な減少も明らかであり、明らかに（5-メチルシチジン免疫染色の減少強度によって実証されました<strong&gt;図2B）。 インスリン分泌細胞への皮膚線維芽細胞のエピジェネティックな変換時の形態学的および機能的変化 膵臓の分化を誘導するために、5-アザCR処理した線維芽細胞を直ちに3時間の回復期間の後、膵臓の誘導のための3ステッププロトコルに暴露しました。 最初のステップの間、細胞は、内胚葉のコミットメントを促進するために、アクチビンAで補充膵臓基本培地で7日間培養しました。この区間では、細胞をさらに平坦化し、徐々にクラスター（7日目、 図3A）に整理し始めました。その後、膵臓系列分化は、2日間のレチノイン酸の添加によって促進されました。この処理に応答して、細胞は、格子状に再配置し、明確に識別可能な細胞凝集物（10日目、 図3A）で成長しました。クラスター形成のprocessは時間とともに増加し、さらにB27、bFGFおよびITSへの細胞の曝露から成っ第三段階、によって刺激されました。これは、大規模な3Dコロニーに凝集細胞の増加（20日目、 図3A）の動員につながりました。 36日目の周り、これらのコロニーは、インビトロでの典型的な膵島（36日目、 図3A）を連想させるとして、明確な丸い構造が登場しました。 新しいEpiCC表現型の獲得は、未処理線維芽細胞（5 mCと36日目図3B）で観察されたものに戻ったグローバルなDNAメチル化レベルの緩やかな増加を伴っていました。 膵臓誘導の36日後、エピジェネティックな変換の効率も未処理の線維芽細胞に本来検出されなかった典型的な成熟膵臓マーカーの発現、（T0によって実証されました、 <stroNG&gt;図3B）。膵臓と十二指腸ホメオボックス1（PDX1）とCペプチド（C-PEP）の共局在は、インスリン産生もの（36日目、 図3B）などEpiCCの善意の性質を確認しました。さらに、細胞の機能的表現型は、化合物をトリガ生理を表す20mMグルコース曝露に応答するそれらの能力によって実証された変換されます。より詳細には、EpiCCは積極的にD-グルコース刺激の1時間後に培養液中のインスリンを分泌しました。いいえリリースでは、L-グルコース（ 図3C）の等モル量への曝露後に検出されませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53880/53880fig1.jpg" /> 図1：組織片から成長している線維芽細胞のヒト皮膚線維芽細胞の単離とキャラクタリゼーション （A）代表画像。 （B）線維芽細胞は、それらのための均一な免疫陽性を表示しますpecificマーカービメンチン（Vimの）。核はDAPIで染色されています。 （スケールバーは100μm）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53880/53880fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53880/53880fig2.jpg" /> 図2：5-アザCR処理後のヒト皮膚線維芽細胞の形態学およびメチル化の変化細長い形状を示す未処理の線維芽細胞の（A）代表的な画像（T0）、および5-アザ- CRは、円形または楕円形の形態を表示する線維芽細胞を処理し、粒状。細胞質、および拡大して空胞核（ポスト5-アザCR）。 （スケールバーは100μm）。 （B）は、グローバルなDNAメチル化の減少は、5-アザCR処理後（ポスト5-アザCR）検出可能です。 （スケールバーは50μm）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53880/53880fig2large.jpg" target="_blank">をクリアしてください</a>この図の拡大版を表示するには、こちらICK。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53880/53880fig3.jpg" /> 図 3： エピジェネティックな変換中の形態学的および機能的変化 （A）内分泌膵臓分化の間に起こる形態学的変化の代表的な写真。誘導の7日後、ヒト細胞が徐々にクラスター（7日目）に整理します。レチノイン酸の添加に応答して、彼らは区別可能な骨材（10日目）で格子状とクラスタ内で再配置します。これらの形成は、細胞を動員し、大規模な3Dコロニー（20日目）に集約し、時間とともに進行します。最後に、コロニーを切り離し、in vitroでの典型的な膵島（36日目）を彷彿とさせる培地に自由に浮遊する傾向がある球状の構造になります。 （スケールバーは100μm）。 （B）膵臓中の36日後ductionは、人間EpiCCのグローバルなDNAメチル化レベルは、未処理の線維芽細胞（5 mCと36日目）で観察されたものに戻ります。 （スケールバーは50μm）。これらの内分泌膵臓のマーカーは、未処理の線維芽細胞（T0）に完全に存在しない一方で、C-PEPとPDX1の共局在は、変換期間（36日目）の終わりに検出可能です。 （スケールバーは100μm）。 20mMのD-グルコースおよび20mMのL-グルコースの曝露に応答した（C）EpiCCインスリン放出。バーは、3つの独立した反復試験の平均±SDを示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53880/53880fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> マテリアル/機器の名前 </td><td> 量（v / v）の </td><td> コメント/説明 </td></tr><tr><td>ハムF-10栄養ミックス</td><td> 40％ </td><td></td></tr><tr><td> DMEM低グルコース</td><td> 40％ </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替</td><td> 10％ </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5％ </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質抗真菌ソリューション</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン溶液</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸溶液</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td> 2-メルカプトエタノールの株式</td><td> 1％ </td><td> 2-メルカプトエタノールの原料調製：滅菌PBS 5ml中の2-メルカプトエタノールのdiluite 3.5μlの。 4℃の暗所で保管してください。注：2週間以内に使用します</td></tr><tr><td>ヌクレオシドミックスストック</td><td> 1％ </td><td>ヌクレオシドミックス原料調製：0.042グラムグアノシン、0.040グラムのアデノシン、0.036グラムのシチジン、0.036グラムのウリジン、滅菌水50ml中の0.012グラムのTimidineを溶解します。溶解するために50℃で融解します。 filtratによって滅菌します4℃でのイオンと店舗</td></tr><tr><td> ESGRO（LIF） </td><td> 0.1％ </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF基本（のbFGF）株式</td><td> 0.1％ </td><td> bFGFのストック準備：bFGFの25μgのでPBS中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）の5ミリリットルを追加します。 </td></tr></tbody></table> 表1：材料ソリューションを提供しています。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> マテリアル/機器の名前 </td><td> 量（v / v）の </td><td> コメント/説明 </td></tr><tr><td> DMEM / F-12 </td><td> 93％ </td><td></td></tr><tr><td> B-27サプリメントマイナスビタミンA </td><td> 2％ </td><td></td></tr><tr><td> N-2サプリメント</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸溶液</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質抗真菌ソリューション</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td> 2-メルカプトエタノールの株式</td><td> 1％ </td><td> 2-メルカプトエタノールの原料調製：滅菌PBS 5ml中の2-メルカプトエタノールのdiluite 3.5μlの。 4℃の暗所で保管してください。注：2週間以内に使用します</td></tr><tr><td> L-グルタミン溶液</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td> BSAストック</td><td> 1％ </td><td> BSAストックの調製：50mlの水に250mgのを溶かします。 4℃でろ過し、ストアによって滅菌します。 </td></tr></tbody></table> 表2：材料ソリューションを提供しています。

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Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

epigenetic-conversion-as-safe-simple-method-to-obtain-insulin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K ビュー.  Università degli Studi di Milano. Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

ビデオ: Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

発生生物学

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

脱分化脂肪細胞を得るために効率的な方法

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

修正されたMicroSecureガラス化：人間の胚盤胞のための、安全なシンプルで非常に効果的な凍結保存手順

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

非形質転換ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞の樹立

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

成体マウスの解離と再生:哺乳類のブラステマ形成と腸内形成を調べるための簡単なモデル

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...