We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).

Questo protocollo richiede l&#39;utilizzo di vivo, zebrafish adulto per la produzione di embrioni. Gli embrioni vengono raccolti per la raccolta dei tessuti. E &#39;essenziale per ottenere l&#39;approvazione da etici appropriati revisione schede per condurre questo esperimento. 1. Ottenere embrioni graduali <ol><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, preparare sano, zebrafish adulti per la riproduzione. Inserire un maschio e una femmina su lati opposti di una netta barriera in un serbatoio di allevamento. </li><li> Ripetere 1.1 a molti vasche di allevamento come necessari per la produzione di embrioni sufficiente per l&#39;applicazione a valle. Ottenere embrioni da entrambi i pesci wild type e pesci transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti nel tipo cellulare di interesse. NOTA: Il numero di embrioni necessari per applicazioni a valle Fasi 2-8 dipende dalla abbondanza relativa delle cellule di interesse per il punto temporale di interesse. Anche se questo può variare a seconda del tipo di cellula, 200 embrioni producono 2,000-5,000 cellule ordinati quando la cbraccia di interesse rappresentano &lt;1,0% delle cellule totali a 24 HPF (ore dopo la fecondazione). </li><li> La mattina successiva, cambiare l&#39;acqua nel serbatoio panatura trasferendo pesce a un serbatoio di allevamento fresco e rimuovere il divisore. Inclinare il serbatoio con un angolo per incoraggiare l&#39;allevamento. </li><li> Raccogliere gli embrioni in scena. <ol><li> Ogni 15 minuti, raccogliere gli embrioni trasferendo gli adulti ad un serbatoio di allevamento fresco e passando le uova, che sono lasciati alle spalle attraverso un colino da tè. NOTA: zebrafish embrioni si sviluppano in modo sincrono quando mantenuto a densità e temperature paragonabili. </li><li> Lavare le uova con l&#39;uovo d&#39;acqua (0,21 g / L sali Ocean istantanei in acqua distillata doppia 1 L) e trasferimento in una capsula di Petri. Trasferire la capsula di Petri di un incubatore umida a 28,5 ° C con circolazione di aria. </li></ol></li><li> Due ore dopo l&#39;ultima raccolta, ordinamento fecondato, embrioni multicellulari in 10 cm capsule di Petri e ridurre la densità a 50 embrioni per piatto. Selezionare gli embrioni provenienti da una singola, 15finestra temporale min di raccolta per l&#39;applicazione a valle. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C. NOTA: Per esempio, raccogliere gli embrioni alle 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 09:45, 10:00 e 10:15. Confrontando attraverso punti di tempo, se il maggior numero di embrioni fecondati sono dalle grinfie raccolti alle 9:00, quindi utilizzare solo questi embrioni per applicazioni a valle. </li></ol> 2. Impostare per singola cella Dissociazione <ol><li> Circa 30 minuti prima del punto di tempo di interesse (18 HPF) rimuovere gli embrioni dalla loro corion manualmente con una pinza sottile. </li><li> Raccogliere ed etichettare la seguente per ogni condizione: due 2 ml microprovette, uno di 40 micron colino cella, una 35 millimetri piatto di coltura cellulare, e due tubi FACS sormontato da un colino cella di 35 micron. </li><li> Raffreddare i seguenti reagenti su ghiaccio: Uovo acqua contenente 0.21g / L sali Ocean istantanea in 1L di acqua bidistillata; De-yolking Buffer contenente 55 mM NaCl, KCl 1,8 mm e 1,25 mm NaHCO 3; e FACS tampone contenente del Leibovitz L-15 multimediale integrato con siero fetale bovino al 5% inattivato al calore. </li><li> Portare 1 ml per campione di cellule dissociazione reagente 1 a RT. Scongelare 1 ml cellulare dissociazione reagente 2 per campione sul ghiaccio. Portare a Rt immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. La dissociazione Single Cell <ol><li> Usando una pipetta di vetro un&#39;ampia foro, trasferire 100-300 embrioni in una provetta da 2 ml microcentrifuga in un volume minimo di acqua Egg. </li><li> Euthanize embrioni sostituendo l&#39;acqua con 1 ml ghiacciata Egg Acqua e sommergendo tubo in ghiaccio per 20 min. ATTENZIONE! E &#39;fondamentale per ottenere l&#39;approvazione da adeguata comitato di sorveglianza la cura degli animali istituzionale per questo metodo di eutanasia (agghiacciante sul ghiaccio seguito da dissociazione cellulare come l&#39;eutanasia secondaria). l&#39;eutanasia standard in genere richiede che gli embrioni &lt;3 giorni dopo la fecondazione sono sbiancati dopo che sono stati refrigerati, che non è appropriato per l&#39;ottenimento di cellule vitali. </li><li> Lavare gli embrioni due volte con 1 ml ghiacciata Egg acqua. Per lavare, utilizzare una vasta pipetta di vetro foro per rimuovere Uovo acqua e un P1000 per aggiungere Egg acqua. </li><li> Rimuovere il tuorlo sostituendo l&#39;acqua embrione con 1 ml Deyolking tampone e triturazione 8-12 volte con una punta P1000, o fino a quando il tuorlo è sciolto e solo i corpi degli embrioni sono visibili. </li><li> Raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 300 xg per 1 min. Usare una pipetta per rimuovere delicatamente il surnatante senza interrompere il precipitato di tessuto. Risospendere in 1 ml di acqua Egg. </li><li> Ripetere il punto 3.5, per un totale di tre lavaggi, ma il lavaggio finale, risospendere in 1 ml di RT cellulare dissociazione reagente 1. </li><li> Incubare in cella di dissociazione reagente 1 per 10 minuti a temperatura ambiente con tubi in posizione orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente con una pipetta P1000 per evitare grumi. NOTA: Maneggiare campioni delicatamente durante le fasi di triturazione. A volte un unico, grande gruppo si forma nel tubo da un groviglio di corpi embrionali. Questo saràdisperdere con la digestione ulteriore aiutato dalla leggera triturazione. NON FARE VORTEX. </li><li> Raccogliere tessuti mediante centrifugazione a 300 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml di cellule dissociazione reagente 2. </li><li> Incubare per 5-15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente per evitare grumi. Ogni 5 min, valutare i progressi compiuti digestione. <ol><li> Per valutare i progressi compiuti digestione, diluire 2 ml surnatante in 18 microlitri FACS tampone e pipetta come una goccia su un piatto di coltura cellulare. </li><li> Mettere un vetrino sul campione ed osservare sotto una cultura al microscopio del tessuto a 10X e 20X ingrandimenti. NOTA: La preparazione dovrebbe apparire come un insieme di celle singole, piccoli gruppi, grandi gruppi, e occasionali corpo dell&#39;embrione per lo più intatto. </li><li> Visivamente valutare la proporzione della preparazione che è singole cellule e piccoli cluster. NOTA: Over-digestione sarà ridurre la vitalità; sotto-digestione ridurrà singolo rendimento delle cellule. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Raccogliere il preparato cellulare mediante centrifugazione a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere in 1 ml freddo FACS tampone. </li><li> Inumidire un colino cella di 40 micron con FACS tampone. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro cella 40 micron su un piatto di coltura cellulare da 35 mm. Lavare il filtro delle cellule una volta con 1 ml FACS ordinamento buffer. </li><li> Trasferire il flusso continuo in una provetta 2 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e risospendere in 100 ml FACS tampone. </li><li> Conte rendimento delle cellule utilizzando un emocitometro. Ulteriori diluire i campioni di 5x10 6 cellule per ml, o la concentrazione ottimale consigliati per FACS macchina di scelta. Opzionale-Quando il conteggio delle cellule rendimento sul emocitometro, le cellule morte di contrasto con trypan blu per confermare la vitalità della preparazione cellulare prima di FACS ordinamento. NOTA: I preparativi che sono troppo diluito avrà eccesso quantità di tempo per ordinare. I preparativi che sono troppo concentrated tendono a raggrupparsi in multimeri e sono ottimali per l&#39;ordinamento di una popolazione pura. </li><li> Riserva il 10-20% di ciascun campione da utilizzare come controlli non colorati. Per i campioni rimanenti, le cellule morte macchia aggiungendo un guasto (L / D) discriminazione / live colorante fluorescente in ciascun campione. Non lavare. NOTA: Qualsiasi colorante fluorescente che penetra cellule con membrane cellulari compromesse e macchie acidi nucleici possono essere utilizzati come colorante L / D, a condizione che gli spettri di fluorescenza è compatibile con la macchina FACS di cellule scelta ed etichettatura fluoroforo di interesse. <ol><li> Non lavare la preparazione dopo aver aggiunto il colorante come alcune cellule moriranno in transito alla purificazione FACS e dovrebbero essere esclusi dalla popolazione ordinata. </li></ol></li><li> Inumidire il filtro 35 micron cella ricoperto tubo FACS con 20 microlitri di buffer FACS. Aggiungere cellule per il filtro e raccogliere per gravità. Conservare su ghiaccio. </li></ol> 4. FACS arricchimento <ol><li> Utilizzare FACS per arricchire per singolo, Cellule vive che esprimono il marcatore fluorescente. <ol><li> Impostare una porta per distinguere le cellule dai detriti su un grafico a dispersione di forward scatter (FSC-A) di ampiezza vs ampiezza lato scatter (SSC-A), entrambi con scala lineare. Attenzione cellule Zebrafish sono in genere più piccolo del mouse o cellule umane. Ciò si riflette in una separazione basale minore tra cellule e detriti. </li><li> Dal cancello impostato in 4.1.1, impostare una porta per arricchire per singole cellule ed escludere multimeri utilizzando un grafico a dispersione di altezza avanti scatter (FSC-H) e bassa altezza laterale scatter (SSC-H), entrambi con scala lineare. NOTA: Celle con sproporzionatamente alta FSC-H e basso SSC-H sono probabili multimeri e sono esclusi dalla selezione. </li><li> Dal set porta al punto 4.1.2, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive usando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l&#39;ampiezza del canale utilizzato per rilevare L / D macchia con scala log. Includere cellule negative L / D. </li><li> Da parte diil cancello situato in 4.1.3, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive con fluorescenza positiva utilizzando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l&#39;ampiezza del canale utilizzato per rilevare marker delle cellule proteina fluorescente con scala di registro . Includi cellule positive. </li><li> Regolare tutti i controlli di compensazione, se necessario, per tenere conto di interferenza tra la L / D macchia e spettri proteina fluorescente. </li></ol></li><li> logica sorta Set per le cellule che rientrano in tutte le porte impostati nella fase 4.1. <ol><li> Utilizzando cellule doppio etichettati, verificare gating per l&#39;ordinamento delle cellule. NOTA: Le cellule per l&#39;ordinamento sarà cellule piuttosto che detriti, singole cellule piuttosto che multimeri, L / D cellule positive negative e fluorescenza. </li></ol></li><li> Ordina 2000-4000 cellule dalla popolazione di interesse in 5 ml di freddo FACS tampone in una provetta su ghiaccio. Per minimizzare tranciatura e deformazione su cellule di cernita, utilizzare le pressioni più basse possibili per la cellasorter. NOTA: La gocciolina 5 microlitri di tampone FACS funge da ammortizzatore per le cellule in uscita della macchina FACS. Raccolta 2000-4000 cellule direttamente nel FACS Buffer elimina la necessità di centrifugazione prima di caricare sui chip IFC. Questa strategia è raccomandato perché centrifugazione può portare alla formazione di multimeri se le cellule aderiscono l&#39;uno all&#39;altro nel pellet. </li><li> Valutare la fattibilità analisi post-specie. <ol><li> Trasferire 1 ml cellule ordinati ad un tubo FACS fresco con 100 ml FACS ordinamento tampone e 1: 1000 diluizione L / D macchia. Far passare le cellule attraverso il sorter FACS con la strategia di gating al punto 4.1. Utilizzare la proporzione di L / D negativo a positivo stimare vitalità delle cellule ordinati. </li></ol></li></ol> 5. Le cellule caricare sul microfluidica Chip <ol><li> Utilizzando un emocitometro, misurare sia la concentrazione e la dimensione delle cellule ordinati. <ol><li> Diluire le cellule ordinati ad almeno 10 ml. Diluire un&#39;aliquota del 5 μ; Celle l con 5 ml trypan blu. Caricare sul emocitometro e applicare vetrino. </li><li> Raccogliere le immagini in campo chiaro di tutte le cellule in 4 x 4 griglie di emocitometro. Contare il numero di cellule vive e calcolare vivi cellule / ml. cellule vive non occupano trypan blu. NOTA: utilizzare qualsiasi software di analisi delle immagini standard per misurare il diametro di tutte le cellule vive. Calcolare la deviazione media e standard della dimensione della cella, e selezionare una piastra IFC adatto al calibro cella di interesse. Se gamma dimensione della cella si trova a cavallo di dimensione celle piatto IFC, utilizzare più piatti per catturare l&#39;intera gamma di cellule di interesse. </li></ol></li><li> Le celle di carico su di IFC piatto secondo le istruzioni del produttore (vedi Materiali). <ol><li> Diluire le cellule a 1x10 6 cellule / ml e di eseguire l&#39;ottimizzazione dell&#39;assetto secondo le istruzioni del produttore. NOTA: ottimizzazione galleggiabilità assicura che le cellule non si depositano sul fondo né a galla della WEL caricol per il carico ottimale su chip di IFC. Il rapporto di tampone di cellule può variare secondo il tipo cellulare, ma varia tipicamente 6: 4-7: 3 di celle: buffer. </li><li> Aggiungere cellule per piastra-IFC innescato. Piatto di carico in macchina fluidica compatibile, ed eseguire uno script di carico delle cellule di spingere le cellule attraverso il circuito microfluidica e in corsie di cattura. </li></ol></li><li> Verificare che le cellule sono alloggiati in siti di cattura sulla piastra IFC. <ol><li> Rimuovere IFC piatto dalla macchina fluidica. Montare la piastra di IFC su un microscopio dotato di una piastra di adattamento. </li><li> Raccogliere istantanee di campo chiaro e fluorescenza per ogni sito di cattura a 10X di ingrandimento. NOTA: Campo chiaro volte di acquisizione possono variare da 10-50 ms, a seconda della intensità della lampada. i tempi di acquisizione fluorescenza possono variare da 250-750 ms, a seconda della luminosità fluoroforo. Evitare di sovraesposizione cellule per prevenire fotodanneggiamento. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Synthesis <ol><li> Eseguire lisi cellulare in situ in base al Ile istruzioni del produttore piatto FC. <ol><li> Aggiungere i buffer di lisi ai pozzetti sulla piastra IFC. Piatto di carico sulla fluidica compatibili macchina e lo script lisi cellulare corsa secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Eseguire la trascrizione inversa in base alle istruzioni del produttore piatto IFC. <ol><li> Aggiungere i reagenti trascrizione inversa alla piastra di IFC. Piatto di carico sulla macchina fluidica compatibili. Eseguire lo script trascrizione inversa. Esempi di condizioni di ciclo: 1 ciclo a 25 ° C per 10 min, 1 ciclo a 42 ° C per 1 ora, poi 1 ciclo a 85 ° C per 5 min. </li></ol></li><li> Eseguire pre-amplificazione con sonde gene-specifici in base alle istruzioni del produttore piatto IFC. NOTA: A causa della loro maggiore specificità con i numeri a basso copiare, utilizzare sonde fluorogeniche marcato piuttosto che le sonde ottimizzati per l&#39;uso con coloranti intercalanti. <ol><li> primer Pool e diluire a finale 180 nm ciascuno. Aggiungere primer in pool al piatto IFC. Piatto di carico su fluidi compatibilimacchina cs. script di preamplificazione Esegui. </li></ol></li><li> Eseguire pre-amplificazione con le seguenti condizioni di ciclo: 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, quindi 18 cicli con denaturazione a 95 ° C per 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 4 min. Conservare pre-amplificato cDNA a 4 ° C fino alla raccolta. Harvest cDNA dalla piastra microfluidica in base alle istruzioni del produttore e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 7. Selezionare cDNA da singole cellule per singolo obiettivo qRT-PCR <ol><li> Diluire cDNA in 25 reagente di diluizione ml in base alle istruzioni del produttore. NOTA: resa finale è di circa 28 ml di cDNA pre-amplificata per cella. Prenotare una aliquota di diluente per uso come controllo non-template in qRT-PCR. <ol><li> Riferendosi al campo chiaro e le immagini fluorescenti registrate nella fase 5.3.2, segnare ogni sito di cattura. contare manualmente e registrare il numero di cellule. Valutare e registrare se ogni cella è l&#39;influenzaorescent. NOTA: Ogni singolo sito può contenere 0, 1, o&gt; 1 cella, dove&gt; 1 cella include siti di cattura che contengono più celle e / o detriti non identificabile. Se le immagini sono qualità sufficiente, un valore di pixel può anche essere assegnata per quantificare l&#39;intensità del segnale di fluorescenza. </li></ol></li><li> Selezionare i campioni per l&#39;analisi qRT-PCR. <ol><li> Selezionare campioni di cDNA da siti di cattura identificati nella fase 7.2 che contengono esattamente 1 cella con fluorescenza positiva. Pool 1 ml aliquote di cDNA da ciascun campione. NOTA: Questo è il controllo positivo &quot;Pool&quot; utilizzato per determinare se i geni di interesse sono espressi in una qualsiasi delle celle selezionate. </li><li> Selezionare cDNA da almeno un sito di cattura che contiene esattamente 0 cellule come controllo negativo. Utilizzare diluente dal punto 7.1.2 come un controllo non-modello. </li></ol></li><li> Eseguire test di qRT-PCR. <ol><li> Utilizzare solo sonde utilizzate per la pre-amplificazione in fase 6.4.1. Caricare tutti i campioni in triplicate. condizioni bicicletta per una reazione di 10 microlitri su 384 pozzetti: 1 ciclo a 50 ° C 2 min, 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, 40 cicli con denaturazione a 95 ° C 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 1 min. </li></ol></li></ol> Analisi 8. Dati <ol><li> Convalida qRT-PCR prodotti mediante elettroforesi su gel standard. Confermare prodotto è una singola banda a peso molecolare atteso (varia per ogni sonda). NOTA: Se una sonda produce più bande o una singola banda in una dimensione inadeguato, allora la specificità è discutibile, e questo esclude il gene dall&#39;analisi. </li><li> Esaminare tutte le curve di amplificazione e tenere conto di eventuali anomalie 14. Calcolare il valore medio CT per ogni combinazione campione / gene 15. NOTA: valori CT per i controlli positivi in ​​genere varia 10-30. valori CT per i controlli negativi in ​​genere varia 35-40 (senza amplificazione). valori CT 30-35 sono considerati molto bassa espressionee dovrebbero essere interpretati con cautela 14. </li><li> I dati del rapporto <ol><li> Se i campioni cadono nel CT = 10-30, i dati possono essere segnalati anche come cambiamento volte trascrizione abbondanza relativa ad un campione di controllo. NOTA: Fold cambiamento è uguale a 2 ^ (- ΔΔCT) dove ΔCT è relativa a un gene housekeeping sottraendo la media CT del campione del gene housekeeping e ΔΔCT è le differenze di ΔCT tra il campione e un controllo positivo 15. </li></ol></li></ol>

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T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish:+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type,+developmental+stage+and+chemical+treatment.">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102 (2008).</li><li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+zebrafish+(Danio+rerio)+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization.">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li><li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish.">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li><li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart.">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li><li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field.">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li><li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. 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The authors have nothing to disclose.

Il metodo qui descritto utilizza espressione di una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore specifico tipo cellulare per arricchire una popolazione di cellule progenitrici cardiache da embrioni di zebrafish per l&#39;uso nel sistema di assistita acquisizione singola cella microfluidica per valutare l&#39;espressione di un sottogruppo di geni cardiaci nei singola cellule. A condizione che le capacità FACS eccitazione laser e di emissione sono compatibili con il fluoroforo (s) di scelta, questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi linea reporter fluorescente. Molte linee giornalista di zebrafish sono già esistenti, e pesci transgenici portando nuovi giornalisti possono essere generati in appena 3 mesi. Inoltre, questo flusso di lavoro può essere adattato per produrre cDNA da tutta trascrittoma per singola sequenza cella-RNA. Per fare ciò, i passaggi dovranno essere leggermente modificato per l&#39;utilizzo con chimiche ottimizzati per la preparazione di cDNA per la generazione di librerie adatte a RNA sequenziamento 5-7. Tuttavia, è consigliabile convalidare eterogeneità della popolazioneutilizzando il metodo descritto qui prima di inseguire le applicazioni di sequenziamento ad elevato throughput. È importante notare che ci sono alcune limitazioni al metodo descritto. In primo luogo, l&#39;uso di piastre di circuito integrato microfluidica (IFC) richiede specializzata, attrezzature costose. Tuttavia, i chip microfluidica offrono notevoli vantaggi rispetto ai tradizionali 96 e ben 384 formati lastra e per il saggio singole cellule. Con scorre cellule e reagenti attraverso corsie scala micrometrica, singole cellule sono posizionate in siti di cattura singole dove possono essere osservati direttamente per confermare che sono singole cellule in buona salute. Estrazione di RNA e la sintesi del cDNA si verificano in situ sul chip CFI utilizzando volumi molto bassi per ogni cella. chip fluidici integrati, al momento in cui scriviamo, sono disponibili in commercio attraverso una sola fonte. Sebbene fabbricazione non commerciale è stata eseguita da diversi gruppi, è al di fuori della portata della maggior parte dei laboratori. I passaggi 5-7 maggiobisogno di essere modificato per piattaforme prodotte da altre aziende o in-house invenzioni. In secondo luogo, anche se disponibili in commercio piastre IFC possono ospitare fino a 96 geni, i geni selezionati sono limitati dalla disponibilità di sonde geniche fluorogeniche marcato convalidato per l&#39;uso in zebrafish. In terzo luogo, le cellule zebrafish sono in genere più piccolo di cellule di mammifero, e questa piccola dimensione presenta sfide di trattamento del campione. Un piccolo cambiamento di diametro cellulare traduce in un grande cambiamento in volume cellulare, riducendo materiale disponibile e diminuendo la probabilità di rilevazione bassa espressione di geni. Ci sono diverse considerazioni aggiuntive per questo protocollo. Nel passaggio 1, è importante solo embrioni fecondati uso all&#39;interno di una finestra di tempo breve. Mantenendo la temperatura costante e senza limitare le condizioni di ossigeno, zebrafish embrioni si sviluppano in modo sincrono. La lettura finale di questo protocollo (relativa espressione genica da singole cellule) non può discriminare la fonte di heterogeneity tra le singole celle. Per questo motivo, l&#39;interpretazione di eterogeneità intercellulare deduce embrioni attentamente gestita e sviluppo sincrono. Nei passaggi 2-3, vi è un compromesso tra la dissociazione e la vitalità. Anche se il punto 4 seleziona per cellule vitali, e il passaggio 3 contiene diversi passaggi filtranti che consentono di escludere multimeri, over-digestione ridurrà il materiale vitale disponibile per FACS e potenzialmente ridurre la resa delle cellule ordinato. I passaggi per risolvere i problemi bassa vitalità includono riducendo i tempi di digestione, ridurre l&#39;intensità triturazione, e ottimizzando il numero di embrioni nel materiale di partenza. FACS arricchimento della popolazione di cellule (fase 4) è senza dubbio la fase più critica in questo protocollo. criteri di ordinamento stringenti sono essenziali per generare un singolo preparazione cellulare contiene solo vivono cellule che esprimono la proteina fluorescente di interesse. Contaminando le cellule provenienti da altre popolazioni potrebbe portare alla falsa rappresentazione di eterogeneità intercellulare. In particolare,FACS arricchimento di una popolazione di interesse non si limita alla strategia due colore indicato in questo protocollo. Più complesse strategie in grado di produrre più raffinate popolazioni di cellule e sono un modo rapido per estendere la metodologia riportata nella prova di principio studio. Nel passaggio 5, le cellule possono essere osservati direttamente per confermare il numero di cellule raccolte, la salute delle cellule e l&#39;espressione della proteina fluorescente. Ma, a seconda delle dimensioni delle cellule e la luminosità, il fluoroforo di interesse può non essere percettibile e non è una lettura affidabile. Il completamento dei passaggi 6-8 richiede un&#39;attenta aderenza ai protocolli del produttore. Come prova di principio, i livelli di espressione di un sottoinsieme di noti marcatori cardiaci sono stati valutati nel singolo derivato da un precedentemente descritta BAC transgenici linea zebrafish Nkx2.5: ZSY esaminare marcatori di differenziazione cardiaci in Nkx2.5 individuale: cellule positive ZSY al palo 18 ore la fecondazione (HPF). Per esplorare il heterogeneity di marcatori di differenziazione espressi in Nkx2.5 catturato: cellule che esprimono ZSY, una serie di geni sono stati analizzati tra cui geni housekeeping (EF1A, GAPDH), fattori di trascrizione noti per essere acceso all&#39;inizio del specifica cardiaca (GATA4, Nkx2.5), un secondo campo cuore marcatore progenitore (isl1), e geni noti per essere trasformato in un secondo momento durante il differenziamento cardiaco (myl7, vmhc). L&#39;abbondanza relativa di ciascun gene è stata misurata mediante qRT-PCR calcolando ciclo soglia (CT). Il valore più basso CT è stato calcolato al 17,9 e il massimo era 40, che rappresenta nessuna amplificazione (Tabella 1). sono stati considerati valori CT di&gt; 35,0 sotto rilevamento. Delle 46 celle nel set di dati, 6 sono stati esclusi a causa dell&#39;amplificazione fallito di eventuali geni. Le cellule rimanenti sono stati cellule sub-suddivise in 5 tipologie sulla base di espressione di GATA4, Nkx2.5, myl7, e vmhc, e were allineati secondo valore EF1A all&#39;interno dei gruppi. Anche se GAPDH è stato originariamente incluso come un possibile gene housekeeping, espressione era altamente variabile attraverso le cellule, che lo rende inadatto come un gene housekeeping. Espressione GAPDH probabilmente meglio rappresenta modifiche al metabolismo energetico associati differenziazione cardiaca in questo tipo di cellule. È interessante notare che c&#39;era una cella in cui EF1A era non-rilevabile, ma un altro gene era rilevabile (GATA1 nelle cellule 26). Questo suggerisce che, mentre EF1A è generalmente un gene housekeeping adeguata per distinguere tra le reazioni di successo e insuccesso singoli inversa cella di trascrizione, non può essere l&#39;ideale per tutte le applicazioni. La mancanza di espressione EF1A nella cella 26 potrebbe essere dovuto a dinamiche trascrizionali singola cella. Single-cellule Recenti studi dimostrano che la trascrizione del gene è fondamentalmente stocastica, alternando fasi di rapida e trascurabile attività trascrizionale 26. Til suo modello scoppio trascrizionale suggerisce che l&#39;uso di un gene housekeeping per i confronti quantitative tra singole cellule può essere del tutto inadeguato. Nel gruppo di tipo 1, EF1A è l&#39;unico gene rilevabile. Queste cellule possono comprendere sia Nkx2.5: ZSY cellule o cellule negative con molto bassa espressione degli altri geni di interesse. Tipo 2 cellule, con l&#39;eccezione di Cell-26, espressi sia EF1A e GATA4 con nessuna correlazione nei relativi livelli di espressione di questi geni. In particolare, l&#39;espressione Nkx2.5 in cellule di tipo 1 e di tipo 2 può essere dovuta a rigore sub-ottimale FACS, scoppio trascrizionale, transgene leakiness, o livelli di espressione di sotto della soglia. Tipo 3 celle esprimono livelli rilevabili di EF1A, GATA4, e NKX-2.5. Queste cellule sono probabili cellule progenitrici cardiache e possono includere differenziare cardiomiociti atriali. Tipo 4 cellule esprimono livelli rilevabili di EF1A, GATA4, Nkx2.5, myl7 &lt;/ em&gt; e vmhc ed è probabile che le cellule di differenziazione in cardiomiociti ventricolari. Tipo 5 cellule espresso EF1A, GATA4, Nkx2.5, myl7, vmhc, e GAPDH. L&#39;aggiunta di livelli rilevabili di GAPDH suggerisce che queste cellule hanno la capacità per il metabolismo glicolitico rafforzata trovato in cardiomiociti differenziati. E &#39;stato interessante che, nonostante l&#39;ordinamento per le cellule positive ZsYellow da Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), embrioni, 21/40 cellule avevano livelli sotto-soglia di Nkx2.5 nella nostra analisi qRT-PCR questo potrebbe essere dovuto alla rottura trascrizionale o potrebbe riflettere le differenze di trattamento tra trascrizione Nkx2.5 endogeno e ZsYellow. È importante sottolineare che il secondo campo cuore marcatore isl1 era rilevabile in tutte le cellule o cDNA pool da tutti i nostri siti di cattura. In sintesi, il confronto tra i campioni, una sostanziale eterogeneità era evidente a livello di singola cellula, suggerendo che a 18 HPF, Nkx2.5: ZSY + cells comprendono progenitori cardiaci e progenie a diversi stadi di differenziazione.

La maggior parte degli studi in corso di biologia cellulare e molecolare si basano sulle medie della popolazione. Tuttavia, importanti eventi biologici possono essere mascherati da queste analisi tradizionali basati sulla popolazione dal momento che le popolazioni minori possono giocare un ruolo importante nei processi biologici e l&#39;esito della malattia. Comprendere l&#39;espressione genica in popolazioni eterogenee a livello di singola cellula può (e deve) portare a dati biologici e clinici rilevanti 1,2. Di interesse per gli studi di sviluppo embrionale, in un numero maggiore di cellule, le cellule progenitrici sono spesso sottorappresentati, il che rende difficile per rilevare sottili cambiamenti nell&#39;espressione genica che in ultima analisi iniziativa per le decisioni sul destino delle cellule 3. Analogamente, un singolo tipo di cellula può avere diversi profili di espressione in risposta al microambiente 4. Ad esempio, le cellule endoteliali residenti nello stesso organo o in diversi organi (ad es., Dell&#39;aorta o renali) mostrano una significativa eterogeneità, nonostante la condivisione di MORP comunehological e funzionale dispone di 5. Inoltre, le cellule tumorali che popolano lo stesso tumore può anche avere diversi profili molecolari o mutazioni a livello di singola cellula 6. In sistemi modello, trascrittomica in singole cellule ha identificato con successo nuove popolazioni di cellule, caratterizzato stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare, e ha rivelato le risposte cellulari differenziali agli stimoli 7,8,9. Tali intuizioni sarebbero stati mascherati in studi basati sulla popolazione convenzionali. embrioni di zebrafish sono una fonte immensamente utilizzato sotto-dello stelo, progenitore, e differenziazione delle cellule per esplorare questioni di singola eterogeneità cellulare e regolazione molecolare delle identità cellulari durante lo sviluppo. Il loro altamente stereotipato, ex vivo lo sviluppo e la facilità di manipolazione genetica loro un sistema modello eccellente per questo approccio 10,11 fanno. In particolare, una limitazione importante per l&#39;interpretazione della singola cellula gendati e espressione è che l&#39;identificazione affidabile di nuovi stati di cella intermedi durante lo sviluppo richiede molto attenti tempi di raccolta dei tessuti 9. Ciò è necessario per garantire che eterogeneità tra cellule catturate rappresenta eterogeneità all&#39;interno di un tessuto in un singolo punto tempo piuttosto che eterogeneità nell&#39;espressione genica presentata dalla differenziazione cellulare dipendente dall&#39;età. Rispetto ai topi, sviluppo embrionale zebrafish può essere sincronizzato con precisione su un ampio numero di embrioni 12. Inoltre, con le grandi dimensioni della covata, embrioni di zebrafish può essere utilizzato come una fonte abbondante di cellule staminali e progenitrici. Questo protocollo descrive un metodo per isolare le cellule da embrioni zebrafish e catturare singole cellule utilizzando un chip e autoprep sistema disponibile commercialmente circuito microfluidica integrato (CFI) per qRT-PCR analisi di espressione genica. Questo protocollo può essere rapidamente trasferibili a qualsiasi test di throughput elevato di multiplazione tra cui interotrascrittoma sequenziamento che permette l&#39;analisi più completa della eterogeneità cellulare 13. Inoltre, offre diversi vantaggi per analisi di espressione genica tradizionali. Il singolo protocollo di isolamento delle cellule produce alta la vitalità dopo FACS, che diminuisce la proporzione di cellule compromesse che sono inclusi in applicazioni a valle. Utilizzando un IFC, le cellule catturate possono essere osservati direttamente per valutare i tassi di cattura e di valutare la salute delle cellule morfologicamente. Inoltre, questo protocollo è ampiamente applicabile per la comunità di ricerca zebrafish, che richiede solo una linea di pesce transgenico etichettati e l&#39;accesso alle tecnologie di cattura microfluidica cellulare. Come prova di principio, singole cellule derivate da progenitori cardiaci sono stati isolati e catturato su un chip IFC, e quindi la relativa abbondanza di marcatori di differenziazione cardiaci stata misurata qRT-PCR. analisi di espressione genica a livello di singola cellula dimostra che i progenitori cardiaci convivono con la loro differeprogenie ntiating. La conoscenza acquisita da profilatura cella singola di progenitori cardiaci può far luce su l&#39;eterogeneità nei modelli di espressione genica tra cellule progenitrici cardiache durante lo sviluppo dei vertebrati, che potrebbe essere stato mascherato nelle analisi tradizionali basati sulla popolazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Supplies</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:388px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:103px;">11254-20</td>
			<td>For removing the chorion from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tube 2 mL</td>
			<td style="width:111px;">GeneMate</td>
			<td style="width:103px;">C-3261-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40 um cell strainer</td>
			<td style="width:111px;">Biobasic</td>
			<td style="width:103px;">SP104151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:103px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS tubes topped with 35 um cell strainer</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:103px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P1000 and tips</td>
			<td style="width:111px;">Rainin</td>
			<td align="right" style="width:103px;">17005089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P20 and tips</td>
			<td style="width:111px;">Rainin</td>
			<td align="right" style="width:103px;">17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IFC chip manufacturer&#39;s protocol</td>
			<td style="width:111px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:103px;">100-6117</td>
			<td>Version 100-6117 E1 was used in representative experiment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wide bore pastuer glass pippette</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:103px;">14673-010</td>
			<td>For transferring embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult wild type zebrafish</td>
			<td style="width:111px;">N/A</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>We used AB line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult transgenic zebrafish</td>
			<td style="width:111px;">N/A</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents for cell dissociation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double distilled water</td>
			<td style="width:111px;">N/A</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:111px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:103px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:111px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:103px;">S271-3</td>
			<td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P5405</td>
			<td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">S6014</td>
			<td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:111px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:103px;">03-600-511</td>
			<td>Heat inactivate; any brand of FBS should be fine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:103px;">12605-010</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax</td>
			<td style="width:111px;">Genlantis</td>
			<td style="width:103px;">T200100</td>
			<td>Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pronase (optional)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L/D Dye - Sytox Blue</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:103px;">S34857</td>
			<td>Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Reagents for IFC plate use and qRT-PCR</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene-specific probes</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Probes will vary by experiment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Probe ef1a</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td>Dr03432748_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Probe gata4</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td>Dr03443262_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Probe nk2-5</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td>Dr03074126_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Probe myl7</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td>Dr03105700_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Probe vmhc</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td>Dr03431136_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Probe isl1</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td>Dr03425734_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:103px;">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Reagents listed in IFC manufacturer&#39;s protocol</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C1 Reagent Kit</td>
			<td style="width:111px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:103px;">100-5319</td>
			<td>Reagents for loading cells onto IFC plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ambion Single Cell-to-CTTM</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:103px;">4458237</td>
			<td>Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Molecular Biology Quality Water</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">46-000CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C1 IFC for PreAmp (5-10 um)</td>
			<td style="width:111px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:103px;">100-5757</td>
			<td>IFC plate for small cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C1 AutoPrep machine</td>
			<td style="width:111px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:103px;">100-5477</td>
			<td>For IFC plate use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">Z359629</td>
			<td>For counting cells and assessing cell size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For removing embryos from chorion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue culture microscope</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For assessing single cell digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS machine</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For isolating cells of interest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of single cells from zebrafish embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Come prova di principio, l&#39;espressione del gene è stata valutata per esplorare le dinamiche di differenziazione durante lo sviluppo cardiaco. In zebrafish, i progenitori cardiaci derivano da una popolazione mesoderma di cellule che migrano verso il mesoderma piastra laterale anteriore dove si fondono per formare il tubo cuore lineare. Prima della fusione, i progenitori cardiaci iniziare ad esprimere il fattore di trascrizione Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), che è pensato per essere il primo marcatore specifico di progenitori cardiaci 16,17. Qui, un precedentemente descritto BAC pesci transgenici Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, Nkx2.5 abbreviato: ZSY è stato utilizzato per esaminare marcatori di differenziazione cardiaci in singole cellule nella fase 18 somite, 18 ore dopo la fecondazione (HPF) 12. Questo è stato il punto di tempo prima in cui il segnale ZsYellow era percepibile a vista. Come precedentemente descritto per questa linea transgenica, ZsYellow etichette progenitori cardiaci, come abbiamoll come alcune cellule extra-cardiaca che danno origine alla faringe arco cellule endoteliali a 28 HPF 19 (Figura 1A-B, dati non mostrati). Al 18 HPF, Nkx2.5: gli embrioni sono stati ZSY dissociate in una sospensione singola cella poi colorati con Sytox blu di escludere le cellule morte. Dal vivo, ZsYellow positivo, Sytox blu cellule negative erano FACS allineati utilizzando un sorter MoFloXDP o Sony SH800Z dotata di 100 ugelli micron (Figura 1C-F). Per valutare la purezza della popolazione e post-sort redditività filtrate, una aliquota di cellule filtrate sono state colorate con Sytox blu e valutata la percentuale di eventi che rientra all&#39;interno del cancello ordinamento originale (Figura 1G-J). Dopo la cernita, le cellule sono state inserite in un circuito integrato microfluidica (IFC) del flusso di lavoro del circuito integrato (Figura 2A) secondo le istruzioni del produttore. Un emocitometro, combinato con trypan blu exclusion è stato utilizzato per misurare il diametro delle cellule, la concentrazione e la vitalità (Figura 2B, e dati non mostrati). Cellulare galleggiabilità è stata ottimizzata (6,5: 3,5: cellule buffer) secondo le istruzioni del fabbricante, e le cellule sono stati caricati su un IFC per catturare 5-10 micron di diametro cellule. Per valutare l&#39;efficienza di cattura, fluorescenza e / o segnali luminosi sul campo sono stati ripresi in tutti i siti di cattura, una funzione di piastrelle in Fiji è stato usato per cucire una singola immagine del piatto microfluidica. Ogni sito di cattura contenuta 0, 1 o&gt; 1 singole celle (Figura 2C-F). Come previsto da FACS arricchimento, le cellule catturate espressi ZsYellow (Figura 2G). Efficienza Capture superato il 90% in 5 singoli esperimenti usando Nkx2.5: ZSY ordinati cellule, e almeno il 70% dei siti di cattura erano occupati da una singola cella (dati non mostrati). Le cellule sono state lisate, RNA isolato, cDNA sintetizzato e geni bersaglio specifici sono stati amplificati, il tutto secondo le istruzioni del produttore. Un sottoinsieme di siti di cattura cellulari sono stati selezionati per l&#39;analisi qRT-PCR come descritto nel protocollo di cui sopra. In particolare, fattore di allungamento 1 bis (efl1a) 20 e gliceraldeide-3 fosfato (GAPDH) 21 sono stati dosati come geni housekeeping che dovrebbero essere espressi in ogni cellula; GATA binding protein 4 (GATA4) 22 e NK2 homeobox 5 (Nkx2.5) come marcatori precoci progenitrici cardiache; ISL LIM homeobox 1 scatola 1 (isl1) come campo marcatore secondo cuore 23,24; e la catena leggera della miosina (myl7) e miosina ventricolare catena pesante (vmhc) 25 per marcare cardiomiociti ventricolari. Sonde gene-specifici sono stati convalidati usando cDNA da 48 embrioni HPF (Figura 3). qRT-PCR è stato utilizzato per valutare l&#39;espressione genica relativo di questi geni in 45 singole cellule da 18 HPF embrioni, un controllo negativo non-modello, e una popolazione in pool containi controllo positivong cDNA da tutti i 96 siti di cattura. valori grezzi CT per 40 celle rappresentativi ed i controlli sono riportati nella tabella 1. In particolare, dal pool di 46 cellule esaminate, 6 celle sono stati esclusi dall&#39;analisi perché tutti i valori CT espressione genica superati CT = 35,0, e non si sa se questi alta CT I valori sono riconducibili a vere e proprie, i livelli di espressione molto bassi o la degradazione del campione. Dal momento che l&#39;intervallo di valori CT per il gene housekeeping, EF1A, era troppo ampio per confrontare l&#39;espressione genica tra i campioni, e molti valori CT superato i 30, valori CT sono stati visualizzati come una mappa di calore (Figura 3). Confrontando tra campioni, una sostanziale eterogeneità di espressione genica è stata osservata, e le cellule sono stati classificati come tipo cellule 1-5 sulla base di pattern di espressione (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53877/53877fig1.jpg" /> Figura 1. isolamento delle cellule singolo di zebrafish <strong&gt; Nkx2.5: cellule positive ZSY a 18 HPF immagini tutto il monte di rappresentante Tg (Nkx2.5: ZsYellow). embrione a 18 HPF con (A) ZsYellow solo a fluorescenza o (B) fusa immagine campo chiaro con. Strategia di gating (CF) Rappresentante FACS per arricchire di cellule positive ZsYellow e (GJ) analisi post-tipo con (C, G) FSC / SSC dimensione gating, (D, H) la discriminazione doppietto, (E, I) Live / gating Morto e (F, J) della popolazione ordinato. Barra della scala è di 100 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53877/53877fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53877/53877fig2.jpg" /> Figura 2. cattura cella singola di Nkx2.5 zebrafish: ZSY <str<html> ong&gt; cellule positive. (A) Flusso di lavoro. (B) distribuzione delle dimensioni delle cellule di cellule ordinati dal Tg (Nkx2.5: ZsYellow) embrioni isolati a 18 HPF. (CF) rappresentativi eventi Capture cellule sulla piastra IFC dove (C) è un pozzo vuoto, (D) contiene due cellule, (E) ha una singola cella depositato nel canale fluidica come &quot;cattura canale&quot;, e (F) è una singola cella catturato. scatole viola contrassegnare le all&#39;inserto per la visualizzazione ingrandita di siti di cattura. (G) cattura cella singola con campo chiaro, ZsYellow e fusione di immagini. (CF) barra della scala bianco è di 50 micron; barra della scala gialla è di 10 micron. (G) Barra di scala è di 10 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53877/53877fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> IGURA 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53.877 / 53877fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Analisi dell&#39;espressione genica di cattura singolo Nkx2.5 zebrafish:. ZSY cellule positive espressione genica da qRT-PCR nei controlli positivi (embrioni a 2 giorni post-fertilizzazione, pool cDNA da singole cellule), controllo negativo (no-template ) e 40 singole cellule (cellule 01-40). Valori grezzi CT sono stati codificati a colori basati, come descritto nella chiave. EF1A = fattore di allungamento 1 bis, GATA4 = GATA binding protein 4, Nkx2.5 = NK2 homeobox 5, catena myl7 = leggera della miosina 7, vmhc = miosina ventricolare catena pesante, GAPDH = gliceraldeide-3 fosfato e isl1 = ISL LIM homeobox 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53877/53877fig3large.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> Soglia ciclo (CT) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> EF1A </td><td> GATA4 </td><td> nkx25 </td><td> myl7 </td><td> vmhc </td><td> GAPDH </td><td> isl1 </td></tr><tr><td></td><td> Embrione </td><td> 20.69 </td><td> 20.92 </td><td> 28.59 </td><td> 32.87 </td><td> 26.30 </td><td> 27.00 </td><td> 33.57 </td></tr><tr><td></td><td> Piscina </td><td> 26.4 </td><td> 22.4 </td><td> 27,7 </td><td> 27.4 </td><td> 24.5 </td><td> 29.2 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td></td><td> NTC </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="9"> Tipo 1 </td><td> Cell-01 </td><td> 25.1 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-02 </td><td> 25,4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-03 </td><td> 26.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-04 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-05 </td><td> 28.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-06 </td><td> 28.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-07 </td><td> 29,3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-08 </td><td> 30.7 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-09 </td><td> 34.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="17"> tipo 2 </td><td> Cell-10 </td><td> 23.5 </td><td> 28.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 26.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-11 </td><td> 23.5 </td><td> 27.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-12 </td><td> 23.7 </td><td> 17,9 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-13 </td><td> 24.1 </td><td> 32.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-14 </td><td> 24.9 </td><td> 27.5 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-15 </td><td> 25.9 </td><td> 28.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-16 </td><td> 26.0 </td><td> 28.1 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-17 </td><td> 27,0 </td><td> 27,7 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-18 </td><td> 27,0 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-19 </td><td> 27,0 </td><td> 30.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.2 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-20 </td><td> 27,0 </td><td> 28.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 39.2 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-21 </td><td> 27,7 </td><td> 30.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38,6 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-22 </td><td> 30.4 </td><td> 26.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-23 </td><td> 31.3 </td><td> 22.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 39,7 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-24 </td><td> 31.5 </td><td> 28.8 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 39.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-25 </td><td> 33.8 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 37.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-26 </td><td> 40.0 </td><td> 27.4 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 36.6 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="9">tipo 3 </td><td> Cell-27 </td><td> 24.7 </td><td> 19.9 </td><td> 28.8 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-28 </td><td> 24.8 </td><td> 28.4 </td><td> 26.3 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-29 </td><td> 25.1 </td><td> 23.5 </td><td> 27.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 32.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-30 </td><td> 26.3 </td><td> 21.4 </td><td> 27.5 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 39.9 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-31 </td><td> 26.9 </td><td> 24.8 </td><td> 28.2 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-32 </td><td> 27,0 </td><td> 22.5 </td><td> 23.8 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-33 </td><td> 27.8 </td><td> 27.6 </td><td> 27.7 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-34 </td><td> 28.1 </td><td> 21.9 </td><td> 26.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 37.7 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-35 </td><td> 29,3 </td><td> 26,5 </td><td> 28.1 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td><td> 38.3 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="2"> tipo 4 </td><td> Cell-36 </td><td> 24.8 </td><td> 20.3 </td><td> 26.0 </td><td> 27.4 </td><td> 26.6 </td><td> 40.0 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-37 </td><td> 28.7 </td><td> 22.3 </td><td> 25.9 </td><td> 28.9 </td><td> 22.9 </td><td> 38.5 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td rowspan="3"> tipo 5 </td><td> Cell-38 </td><td> 25.5 </td><td> 20,0 </td><td> 29,3 </td><td> 23.0 </td><td> 19.9 </td><td> 25.9 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-39 </td><td> 25.9 </td><td> 21.8 </td><td> 28.6 </td><td>25.1 </td><td> 21.7 </td><td> 25.7 </td><td> 40.0 </td></tr><tr><td> Cell-40 </td><td> 28.9 </td><td> 22.0 </td><td> 27,0 </td><td> 23.0 </td><td> 21.3 </td><td> 27.6 </td><td> 40.0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Valori Raw CT.

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.4K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells. 

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

Isolamento e caratterizzazione di cellule satelliti da muscoli Rat Capo Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Isolamento e caratterizzazione di cellule Stromal Mesenchymal cardiache da Endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...