Name: epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
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The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. DNA-タンパク質架橋<ol><li> ES細胞と胚の心臓組織から発生した15ミリリットルチューブに修正収穫-ES細胞（レギュラーチップ用の2×10 6細胞、マイクロチップのための2×10 5細胞）、胚様体（EB）はE9.5のマウス胚から切開（房室細胞または胚組織のために透過処理PB2バッファにPBS中の1％ホルムアルデヒドを用いて運河、流出路及び心室）。正確に10分間、室温で60回転の速度でオービタルシェーカー上でチューブを入れます。 </li><li> 125 mMの最終濃度のグリシンを添加することによって架橋反応を停止させ、60回転の速度でオービタルシェーカー上で室温で5分間インキュベートします。 </li></ol> 2.細胞溶解とクロマチン断片化<ol><li> 10mlのPBS 1Xまたは1ミリリットルPB2に再懸濁胚組織に再懸濁回架橋された細胞を洗浄します。 4℃で5分間1,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。&lt;/李&gt; <li> PB1またはPB2（2 / mlのロイペプチン、1 / mlのアプロチニン、および0.1mM PMSF）（ 表1）をバッファリングするためにプロテアーゼ阻害剤を追加します。それぞれバッファPB1またはPB2の1ミリリットルのステップ2.1から細胞ペレットまたは胚組織を再懸濁します。ピペットで上下および細胞または組織を再懸濁します。細胞または組織を均質化するために21ゲージ針で1ミリリットル注射器を使用してください。 10分間4℃（ホイール上）でインキュベートします。 </li><li> 4℃で5分間、3000×gでスピンダウンし、上清を捨てます。 </li><li>きれいなチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充したそれぞれのSBバッファ（ 表1）300μlの中にペレットを再懸濁（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）は、任意のDNA分解を防ぐために。氷上で15〜30分間インキュベートします。 </li><li>各材料について、表2に記載されたプログラムに従って超音波処理器を用いてクロマチンを剪断するために4℃で試料を超音波処理します。 &lt;（次の用途に応じて超音波処理時間を調整しますem&gt;のすなわち、PCRまたは配列決定）。剪断されたDNAの大きさは、PCRおよび配列決定のための300bpのための約500塩基対でなければなりません。 </li><li>遠心分離機は、新しい1.5 mlチューブに上清（クロマチン）を転送し、ペレットを廃棄し、4℃、6,000×gで10分間、細胞溶解物を超音波処理しました。 </li><li>水で10倍のため、溶液中のクロマチン（上清緩衝液B）を希釈し、ナノ分光光度計で1.5μLを使用して光学密度を評価します。 0.76のx OD 260から1.55のx OD 280：次の式を使用して、μgの/μlの中のタンパク質の濃度を得ます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> 利用 </td><td colspan="4"> 組成 </td><td> 材料 </td></tr><tr><td rowspan="2"> A </td><td rowspan="2">透過化</td><td colspan="4"> PB1：5 mMのパイプpHが8; 85メートルMのKCl; 0.5％NP40 </td><td>すべて</td></tr><tr><td colspan="4"> PB2：15mMのHEPES pH7.6の、15mMの塩化ナトリウム、4のMgCl 2 60mMの塩化カリウム、0.5％TRITON X-100 </td><td>胚組織</td></tr><tr><td rowspan="3"> B </td><td rowspan="3">溶解/超音波処理</td><td colspan="4"> SB1：1％SDS。 10mMのEDTA; 50mMトリス - 塩酸pHが8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2：50mMのHEPES-KOH pH7.9; 140 mMの。 1mMのEDTA; 0.1％デオキシコール酸塩、 0.1％SDS </td><td> EB </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3：15mMのHEPES pH7.6、15mMのNaClを。 60のKCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA; 1％TRITON-X100、0.1％SDS、0.5％ラウリルサルコシン</td><td>胚組織</td></tr><tr><td> C言語</td><td>チップバッファ</td><td colspan="4"> 150mMのNaCl; 50mMのトリス塩酸pH7.5で、 5 mMのEDTA; 0.5％NP40。 1％TRITON-X100。 </td><td>すべて</td></tr><tr><td> D </td><td> DNA /タンパク質の溶出</td><td colspan="4"> D1：1％SDS。 100mMの炭酸水素ナトリウム D2：50 mMトリスpHが7.6 / 5 mMのEDTA、15mMのDTT、2％SDS </td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> DNA結合ビーズの準備</td><td colspan="4"> E：20％PEG 8000; 2.5 MのNaCl; 10mMトリス - 塩酸pHが8と1mMのEDTA </td><td></td></tr></tbody></table> 表1のChIPバッファー 。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 材料 </td><td> 超音波処理プログラム </td></tr><tr><td>胚性幹細胞</td><td> ON 30秒と30秒OFFの15サイクル</td></tr><tr><td>胚様体</td><td> ON 30秒と30秒OFFの30サイクル</td></tr><tr><td>胚組織</td><td> ON 30秒と30秒OFFの21サイクル</td></tr></tbody></table> 表2.超音波処理プログラム。 3.免疫沈降および洗い上げ<ol><li>バッファーCで3回のプロテインA結合ビーズを洗ってください。新しい1.5 mlチューブにビーズを100μlを取り、緩衝液C（ 表1）の1ミリリットルを追加します。次に、チューブを磁石上に転写されます。 1分間待ち、上清を吸引除去します。二回洗浄工程を繰り返します。 </li><li>バッファCの20洗浄蛋白μlの結合ビーズを1 mlの修飾ヒストンまたは転写因子に対する抗体（ 表3に示す濃度）インキュベート新しい1.5 mlのチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充しました。 4℃で少なくとも2時間、40 rpmで回転体のサンプルを設定します。 </li><li>洗浄抗体ビーズを、緩衝液Cを1ml（3.1に記載の操作）で3回錯体。 </li><li> 2チューブ、クロマチンと抗体 - ビーズ複合体およびクロマチン150μgのを含む他のチューブと洗浄したビーズを20μlの150μgのを含む1を準備し;各チューブにプロテアーゼ阻害剤を補充した緩衝液Cを1ml加えますそして4℃で一晩40 rpmで回転ホイール上でサンプルをインキュベートします。 注：クロマチンの濃度は、転写因子またはシーケンシャルチップ用を免疫沈降するために、少なくとも300μgのでなければなりません。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 標準 </td><td> 濃度（ngの/μL） </td><td> 容量（μL） </td><td> 全DNA濃度（NG） </td></tr><tr><td> A </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> C言語</td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> D </td><td> 1.25 </td><td> 1 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0.625 </td><td> 1 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0.3125 </td><td> 1 </td><td> 00.3125 </td></tr><tr><td> G </td><td> 0.156 </td><td> 1 </td><td> 0.156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> 表3基準濃度。 4. DNA溶出、クロスリンクの逆転とプロテイナーゼK消化<ol><li>磁気ラック内のサンプルを設定します。非結合抗体のクロマチンを含む上清を回収。 注：サンプルは、すぐにその段階で、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存することができます。クロマチンは、他の抗体と他の免疫沈降アッセイに使用することができます。バッファCの1ミリリットル（前述の操作）で各サンプルを3回洗浄。 </li><li>シーケンシャルチップが洗浄のChIP材料を（ 表1）を行わなければならない場合、バッファD1またはD2の150μLを添加することによって、抗体結合タンパク質を溶出し、加熱ブロック中で50℃で20分間、サンプルをインキュベートします。 </li><li>からチューブを外します加熱ブロックとは、磁気ラックにサンプルを入れて、（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）新しい1.5 mlチューブに上清を回収し、ビーズを捨てます。 </li><li>バッファCの2倍量の第二の抗体の3μgのに1を加え、順次チップ用の上清を使用するか、または200 mMのの最終濃度を得るために、5 MのNaClを添加することにより架橋逆転。 </li><li>新しい1.5 mlチューブにクロマチンの入力サンプルを準備する（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）水を150μlの最終容量でIPサンプル（150μgの）のようなクロマチンの同じ量を取ります（RNアーゼDNアーゼを含まない水）。 200 mMの最終濃度が5MのNaClを追加します。 65℃で一晩サンプルをインキュベートします。 </li><li>翌日、加熱ブロックからサンプルを除去するのChIP材料中に250μg/ mlの最終濃度を得て、2時間55℃で消化し12.5ミリモルおよびプロテイナーゼKの最終濃度を得るために、250 mMのEDTAを加えます加熱ブロック。 </li></ol><ol><li>ビーズの作製<ol><li>少なくとも30分間室温でビーズを持って開始し、非常に徹底的にビーズをボルテックス。ビーズは落ち着くので、ピペッティング時に高速に動作します。転送（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）きれいな1.5ミリリットルチューブ中のビーズの1ミリリットル。 </li><li> 、明確上清を廃棄するソリューションの3分 - 磁石に設定し、2を待ちます。 、磁石から削除0.5 M EDTAの1ミリリットルを追加し、短時間のボルテックスで混和します。 </li><li>二回ステップ5.1.2を繰り返し、最後に上清を捨てます。 </li><li> 、磁石から削除バッファEの1ミリリットルを追加し、ゆっくりとビーズを再懸濁します。シェーカー上にバッファE.プレイス50mlに全体のミックス（緩衝液E中のビーズ）を転送し、それを1時間室温でゆっくりと混ぜてみましょう。 </li><li> 3実験条件を用いて説明精製プロトコールを以下の試験DNA結合ビーズ：ビーズを50μl/ DNAを50μl（1ボリューム/ 1容量）、ビーズを100μl/ DNA50μlの（2ボリューム/ 1容量）とビーズの125μlのDNA /50μlの（2.5容量/ 1容量）。フラグメント（ 図1A）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で精製されたDNAを移行しましょう。 </li></ol></li><li> DNA精製<ol><li>各DNAサンプル（約170μl）をした磁気ビーズを結合するDNAの425μL（2.5容量）を追加します。ダウン（約10倍）、ピペッティングによりゆっくりと再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。 </li><li>その後、上清を吸引し、（磁石に）捨て、5分間磁石上に置きます。 </li><li> 、1分間待機し、磁石上にチューブに新たに作製した80％エタノール600μlを添加し上清を吸引して廃棄した後、もう一度、前の手順を繰り返します。 </li><li> 5秒（マイクロフュージ）のために、迅速なスピンを与える、磁石上にチューブを置き、エタノールの最後の滴を除去します。室温で1分間乾燥させ</li><li> DNアーゼRNaseを含まない水20μlを加えることによって、DNAを溶出します。磁石から取り外し、サンプルをボルテックス。 </li><li>室温で3分間インキュベートし、その後、磁石上にサンプルを置きます。新しいチューブに吸引し溶出したDNAは（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定します）。 </li><li> DNAフラグメント（ 図1B）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で入力画分からDNAを実行します。 </li></ol></li></ol> 6. DNA定量は、蛍光検出機器の使用します<ol><li>シリアル7希釈液を加えた無DNA点（ 表3に集まった希釈液）の合計を与えるために水に1μgのDNA（1キロバイトラダー）で希釈します。 </li><li> PCRグリーンI色素の溶液を準備し、すべてのサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）のための十分な：1×TE緩衝液中グリーン色素を10,000倍希釈します。 </li><li>毛細血管のキュベット中で10μlの1×緑の色素ミックスに各DNAサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）の1μLを加えるには、488 nmの波長での蛍光光度計で読み取ることができます。無DNAアッセイのために、1×TE緩衝液1μLを使用しています。 </li><li>ビルドグラフィックソフトを使用して検量線とNG /μlの中のDNAサンプルの範囲に相対濃度を決定します。次いで、DNAをPCRのために準備ができているか、シーケンシングライブラリを作成します。 </li></ol> 7. PCR <ol><li>プライマーの選択<ol><li>関心の設計プライマーは、関心のあるゲノム領域を調べることができます。設計プライマーは、UCSCゲノムブラウザを使用して遺伝子のエンハンサー領域を増幅します。エンハンサーはさらにGEOデータセット内の9データ利用可能H3K4me1またはP300のChIP-seqのを用いて予測しています。 </li></ol></li><li> PCR <ol><li> 45サイクル（8秒95℃、8秒、60℃、8秒72°C）25μlの緑の色素ミックス、2 ngのDNAを、および0.5μlのプライマーミックスでリアルタイムPCRサーマルサイクラーを使用するためのファイル名を指定して実行のPCR反応（20 μMストック溶液）10。 </li></ol></li><li>濃縮の分析<ol><li>ヌクレオソームのせいぜい1％が11を免疫沈降したと仮定して絶対濃縮を計算します。 </li><li> ConsideRゲノム投入DNAの0.1 ngのと比較すると10 ngののIPサンプルが大きい濃縮を示す場合に富むように。 </li><li>非特異的対照試料と入力し、調整の正規化後の非濃縮領域にわたって濃縮度の増加倍数として結果を表現します。 </li><li>入力DNAは100（希釈係数またはDF）によって希釈されるように考えてみましょう。 </li><li> Ct [DF X入力] - X 100％以下の式2-ΔCt、-ΔCt= Ctを[IP]を使用して入力を正規化します。 </li><li> NSは、非特定のサンプル（抗体なしIP、またはIgG IP）であるとして、次の式（ΔCtを[IP]-ΔCt[NS]）を使用してコントロールを調整します。 </li><li> 2-ΔΔCTとしてサンプルの倍の濃縮を計算します。唯一各PCRサンプルは、結果の分析を容易に入力することができる式で計算のすべてのステップを含むファイル。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

エピジェネティクスは、発生生物学の研究の重要な分野となっています。遺伝的プログラムは、胚系統内の特定のIDを取得するに細胞を可能にするために胚細胞で活性化されているどのくらいの時間のために、発生生物学者にとって重要な問題となっています。 チップは広く最後の年以内に使用し、シークエンシングの解像性の向上、次のDNA配列決定に組み合わされています。これは、ゲノムワイド依存的に細胞または特定の胚および成体組織のエピジェネティックな風景を調べるための強力な技術となっています。 ChIPアッセイ緩​​衝液および超音波処理条件が大幅に生物学的材料の少量のためのアッセイを可能にするために改善されました。これは、顕微解剖により、または蛍光レポータータンパク質を発現するFACS選別細胞によって得られた胚の心臓の特定の領域を含みます。実際にチップが不均一な細胞集団13 14缶上で実行しました解釈するのが困難な誤った結果につながります。エピジェネティックな署名は非常に正確に細胞集団をマーク。その署名は、それらへの分化の特定の可能性を与え、彼らの運命を決定します。精製された（ソート）の細胞集団または解剖胚組織と連携することが重要です。 我々は、これらの目標を達成するために、堅牢なプロトコル上に記載しています。我々はチップ7、10またはチップ・シーケンシング（ 図4、原稿準備中）でのChIP-PCR、ChIPのためのこれらのプロトコルを使用しています。堅牢性の理由は、完全な細胞と核溶解および効率的なクロマチン超音波処理を確保するために最適化された透過性および細胞溶解バッファに産みます。プロトコルは、このようにして胚組織の少量のために使用することができます。 これらのプロトコルの制限事項は、チップに固有のものです。より具体的には、空間分解能は500 bpの周りにDNAサイズと非常に高くありません。どうやって今まで、それは、私たちは7 ES細胞を分化に二価のドメインのダイナミクスを調査し、野生型または遺伝子変異細胞でEMT遺伝子調節領域に変更されたヒストンの濃縮の違いを明らかにすることができます。 （ 図2）。免疫沈降したDNA（ 図4）のディープシークエンシングは、部分的に、この制限を克服します。 転写因子の免疫沈降以下の特定のゲノム領域の濃縮は、要因が直接DNAに結合することを確実に示すものではありません。それが唯一のDNAに結合した複雑な工場の一部とすることができます。これは、約知っておくべき重要なポイントです。対照的に、ゲル遅延アッセイは、問題に対処するために使用することができます。 ディープシーケンシングと組み合わせる手に技術を持つことは、ゲノムワイドな転写因子または特定のヒストンマークで占有ゲノム領域を監視することができます。技術が向上し、唯一のSMAに質問することができますされていますLL細胞集団15。したがって、胚発生中に特定のエピジェネティックな風景のダイナミクスにおける新しい道を開きます。

<html>心臓は最初の器官が形成されると、胚における機能的になることです。心臓は、第1および第2の胚性心臓フィールド1から発生する多くの細胞系譜から構築されています。受精後の胚盤胞は、成形心まで段階から、胚細胞は、多くの細胞の運命決定を行うためにこのようにしてあります。遺伝子の転写は、時間と空間依存的に調節され、胚発生の間の細胞運命の決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。このような方法は、心臓構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノム内の調節領域に結合する特異的転写因子によって媒介されます。 DNAは、例えば、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、および/またはリン酸化などの修飾に供されたヒストンの周りに巻かれています。ヒストン修飾は、ヒストンのリジン残基が2に変更されているに応じて活性化し、抑圧や構え遺伝子転写につながります。 jove_content &quot;&gt;クロマチン免疫沈降アッセイ（チップ）年前に3を設定し、4。ヒストンや転写因子の免疫沈降後に変更されたヒストンや転写因子のいずれかの標的を同定するために、現在最も広く使用されている技術であるされてきた、結合したDNAをすることができますいずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅または配列決定した。チップは、技術的挑戦ゲル遅延アッセイ5を克服している。しかし、チップはDNA、ゲル遅延アッセイの利点の転写因子の結合を直接意味するものではない。一方、チップ上DNAシークエンシングに合わせた遺伝子調節に関する新たなゲノムワイドな視点をオープンしました。 ES細胞（ES細胞）を6胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養において心臓の開発の初期段階を再現し、チップのための原則に十分な材料に提供します。また、ヒトES細胞は、CAのヒト細胞モデルを表しますその心原性の潜在的なもののrdiogenesisはそのエピジェネティックな署名7に依存します。開発の後期段階では、マウス胚組織は、セル識別の決意に必要な特定のエピジェネティックな景観を調査することを可能にします。しかし、ゲノムは時間と細胞型に特異的な様式8に転写されます。遺伝子転写のエピジェネティック制御は、局所領域内で検討されなければなりません。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚領域を使用して、PCRまたは配列決定に続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。

<table><tbody><tr><td>Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Cell Fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>Cross-link stop</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>Proteases inhibitor</td></tr><tr><td>Leupeptin hemisulfate</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>Proteases inhibitor</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Proteases inhibitor</td></tr><tr><td>Protein A magnetic beads&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>10001D</td><td>Immunoprecipitation</td></tr><tr><td>SPRI magnetic beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>25530-015</td><td>Protein digestion&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNA BR standard&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Q32850</td><td>Calibration range&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syber green</td><td>Molecular Probes</td><td>S-11484</td><td>DNA quantification</td></tr><tr><td>TE buffer&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA quantification</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td>Washing</td></tr><tr><td>DNase RNase free water</td><td>Life technologies</td><td>10977-035</td><td>Dilution</td></tr><tr><td>Axygen tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP purifiction</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibody&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Reference&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;ChIP concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr></tbody></table>

epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues

特定の遺伝子の転写は、胚発生の間の細胞運命決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。生物学的プロセスは、心臓、構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノムの調節領域に結合する転写因子によって媒介されます。 DNAは、化学修飾に供されるヒストンの周りに巻かれています。ヒストンの修飾は、さらにこのように、遺伝子転写の微調整調節の別のレベルをもたらし、抑圧、アクティブまたは構え遺伝子転写につながります。胚性幹細胞（ES細胞）は、心臓発生の初期段階の胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養で再現します。それらは、クロマチン免疫沈降（チップ）のための原則に十分な材料、広く遺伝子調節領域を同定するために使用される技術の提供します。また、ヒトES細胞は、心臓のヒト細胞モデルを表します。開発の後期段階では、マウス胚組織はを可能にセルIDを決意するために必要な具体的なエピジェネティックな風景を調べます。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚性領域を用いたPCRまたはチップ・シーケンシングに続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。

図1Aは、まず、異なるサイズ（1kbのラダー）のDNAを用いたDNA結合ビーズおよび品質管理の調製を示します。 0ne、ビーズの2および2.5体積（1〜3）は、高および低分子サイズのDNA断片を精製する試料の量に添加しました。 図1 B、C、Dは、マウスES細胞、胚様体または心臓胚領域から抽出された全超音波処理DNAのDNAゲルの典型的な例では、それぞれ、（25 E9.5心室をプールしました）。 最初の中内胚葉、その後、中胚葉状態を経てES細胞が心筋細胞の運命に向かって分化し、それらのトランジット。このような発達の旅は上皮細胞がepithelio間葉移行を受けなければなられる工程を含み、 図2 </st栄&gt;変更されたヒストンの免疫沈降以下のPCRの結果を示しています。実験は、ES細胞は、中胚葉細胞の運命に向かって分化する際に、野生型または遺伝子変異細胞でepithelio間葉移行遺伝子のエピジェネティック制御に見えるように設計されました。 BMP2のようなモルフォゲンで処理された野生型または変異したES細胞を抗H3K4me1、H3K36me3とH3K9me2を抗体を用いて免疫沈降したからクロマチン。修飾されたヒストンの結合は、ゲノムのPCR（エンハンサー、A、B、C、D、E）カドヘリンおよびねじれ遺伝子の領域によって監視されます。 分化遺伝子は、ES細胞12に二価のドメインを備えています。それらのプロモーターに近い彼らの5 &#39;UTR領域は、実際に両方のH3K4me3とクロマチン活性化マークとH3K27me3、抑圧されたマークで占有されています。細胞はBMP2 7などのモルフォゲンによって挑戦されたときにこれらのマークは変更されます。これらのマークは、しかし、変数は、ヒトES細胞ラインに依存していますなぜなら、彼らは場合でも、未分化から派生元の胚盤胞（ 図3）の可能性が高いのです。 上記のプロトコルがあっても、材料の少量から開始したChIP配列決定のために適しています。 ChIP実験は、これらの特定の心臓領域のアイデンティティを定義する役割を果たしている新規遺伝子およびエンハンサーを明らかにするために、AVC、OFTとE9.5マウス胚の脳室から抽出されたクロマチンから実施した。 図4における心筋遺伝子の2ゲノム領域図アセチル化H3K27によって一ペースメーカー固有の濃縮E9.5マウス心室は、遺伝子は、アセチル化H3K27によって濃縮されない（ すなわち 、心室ではありません）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53874/53874fig1.jpg" /> 図1. 電気泳動データ ：DNA結合ビーズチェックおよび超音波処理ヴァルidation。 （A）DNA DNA結合ビーズにより精製し、ビーズのDNA / 1体積の1体積（1）ビーズのDNA / 1体積の2倍量（2）ビーズの2.5体積のDNA / 1体積（3）。入力されたマウスES細胞（B）の画分を、胚様体（C）とは逆の架橋後に得られたDNA断片の大きさ、及び胚の心臓組織（D）。サンプルは、2％アガロース電気泳動ゲル上で実行されました。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53874/53874fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53874/53874fig2.jpg" /> 図2. E-カドヘリンのエンハンサー/プロモーターにH3K27acエピジェネティックなマークのチップ・データ解析。（A）濃縮 （A - E領域）（B）H3K4me1、H3K36me3とH3K9me2をepigeの濃縮。ツイストエンハンサー/プロモーター上の磁マーク（AC領域）。ゲノム領域は、チップ次の入力対ヒストン濃縮を測定するために定量PCRによって増幅されます。結果は3回の実験からの平均±SEMである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53874/53874fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53874/53874fig3.jpg" /> 図3.シーケンシャルのChIP。クロマチンは4ヒトES細胞株から抽出し、チップは、抗H3K4me3とした後、抗H3K27me3抗体を用いて、連続して行われました。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53874/53874fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53874/53874fig4.jpg" /> 図4。 <stroNG&gt;特定胚の心臓領域。クロマチンから抽出したクロマチンからのChIPを溶解し、超音波処理E9.5マウス胚（2リットル）の25心室から抽出しました。抗H3K27ac抗体を免疫沈降に使用しました。 DNA配列決定のために使用しました。図は、変更されたヒストンとSHOX2ペースメーカー特異的遺伝子の1ゲノム領域ではない心室で表現豊かではないが濃縮された心臓の遺伝子Nkx2.5とTBX5のゲノム領域を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53874/53874fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

epigenetic-regulation-cardiac-differentiation-embryonic-stem-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K ビュー.  Université Aix-Marseille. 遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。 

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

発生生物学

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Conventional methods to initiate suspension aggregate based cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) are plagued with culture heterogeneity with respect to aggregate size and shape. Here, we describe a robust method for cardiac differentiation employing microwells to generate size-controlled hPSC aggregates cultured under cardiac-promoting conditions.

ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

生物学

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...