BSは、ミラノ·ビコッカサマー学生研究トレーニングプログラムの大学によってサポートされていました;研究は健康と教育、大学と研究Fondazioneヒューマニタスのイタリア省イタリアの省資金からGCにサポートされていました、我々は批判的に読むためマイケルVG Latronicoに感謝原稿。

1。ヒトiPS細胞株のフィーダーフリーメンテナンスと継<ol><li>マトリゲル被覆された料理を準備します。雪解け一つ一つ時間氷上で人間ESC修飾マトリックスのバイアルと25ミリリットルDMEM-F12培地中で、それを希釈する。氷の上のすべてを維持し、すべてのプレートとチューブが予め冷却されていることを確認しながら、各35ミリプレート（または他の皿が使用される場合、表面積あたりの当量）、1 mlを加える。アルミホイルでプレートをカバーしています。 </li></ol> 注：マトリゲル在庫濃度はバッチによって異なります。希釈命令はデータシートに示されている。 <ol start="2"><li>晩氷の上のプレートを保持し、次の日に氷から削除します。プレートを使用する前に、1週間冷蔵庫にまで保つことができる。 </li><li> mTESR1完全培地（またはNutristem媒体のバイアルを解凍）し、以下の表に従ってH-ESM（人間ESC媒体）を準備します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> FINAL CONC </td><td> 500ミリリットルFOR </td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換（KSR） </td><td> 20％ </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td>グルタ100X </td><td> 2 mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> 0.1mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100 U / mlの - 0.1 mg / mlの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td> 0.1mMの</td><td> 900μlの</td></tr><tr><td> B27サプリメント - VitaminAなし</td><td> 1％ </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td> N2サプリメント</td><td> 1％ </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM </td><td> - </td><td> 370ミリリットル</td></tr></tbody></table> ストック媒体は、それ以上の2週間以上、4℃で保存することができる。完全増殖培地を調製し、塩基性FGFだけ血友病追加されます20 ngの/ mlの最終濃度までe給餌。 </li></ol> 注：H-ESM完全にマウス胚線維芽細胞を条件としては、iPS細胞のためmTESR1またはNutristemの代わりに使用することができる。 <ol start="4"><li>継代の前に30分〜2時間37℃でインキュベーター内でコーティングしたプレートを置きます。 </li><li>細胞は、それらがコンフルエンスに達していない場合でも、約5日ごとに継代されるべきである。コロニーは触れてはいけません。 </li><li>ディスパーゼを1m​​l（1 mg / mlの、PBS中10 mg / mlの在庫からディゾルブ）と成長培地を交換してください。 </li><li>引っ張らガラスパスツールピペットで差別化の領域を削除します。除去すべき分野は、クレーター状または嚢胞構造コロニーの中心にあり、細胞がコロニーから分離し、扁平になり、外側に移行しているように思われている任意の領域が含まれます。 </li><li>植民地の境界線が明るくなって、（通常は5-7分程度）デタッチ始めるまで培養フードの下に37℃でインキュベートする。 DiscarDディスパーゼ。 1ミリリットルH-ESMで洗浄し、廃棄します。 </li><li> 1ミリリットルH-ESMでは、収穫のコロニーへのセルリフター（スクレーパーへらのような）を使用し、15ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに集める。 1ミリリットルH-ESMで洗い流し、チューブに加える。 4分間1,000 rcfでスピンし、上清を除去します。 </li><li> 1ミリリットル予め温めておいた増殖培地（どちらmTESR1またはNutristem）でペレットを再懸濁します。あまりにも塊を解体避ける - 上下6-8X未満ピペット。どのように多くの細胞にメッキさ〜1:5で2プレート用など不必要な細胞（通常は午前1時04分または1：05希釈）、削除する必要があります決定し、600μlのを削除し、その後、1.6ミリリットル新鮮培地を追加します。 </li><li>プレートからマトリゲルを削除します。場所細胞は、プレート上に均一に分散、ドロップでドロップします。これは細胞が中心に向かって移動するようになりますように、過度にチューブを振って避ける。 </li><li> 、1mlの培地とプレート間の格差とチューブを洗ってください。各プレートの最終容量は1.5 -2ミリリットルでなければなりません。 </li><li>継代後の日を除く毎日の媒体を変更します。それはあるが、もう2〜3日以上は、多能性または分化の潜在的影響を与えることなく、最後の通路を経過した場合は培地日常を変更することが理想的な、これは時折回二日の頻度で変更されることがあります。 </li><li>細胞株を凍結する必要がある場合は、2 mlのピ​​ペットと場所1ミリリットル/クライオバイアルを使用して1〜2ミリリットルmFreSR凍結培地に代わりに再懸濁する。 -80 cryoboxに置きバイアル℃、3〜4日での液体窒素への転送。 </li></ol> 注：iPS細胞の顕微解剖マニュアルは実体顕微鏡下で行わなければなりません。彼らは加熱された表面領域に保持されながら、実体顕微鏡と統合で体外受精 （IVF）ワークステーション（KSystemからIVFワークステーションなど ）を無菌条件下で細胞の操作を可能にします。これが利用できない場合、実体顕微鏡は、通常、層流フードの下で移動させることができる。 2。胚様体集約および心臓InductioN <ol><li>以下の表に従ってEBM-20培地を準備します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> FINAL CONC </td><td> 500ミリリットルFOR </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（原産地南米） </td><td> 20％ </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> 0.1mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100U/ml - 0.1 mg / mlの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>グルタ100X </td><td> 0.1mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td> 50umの</td><td> 450μlの</td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385ミリリットル</td></tr></tbody></table> 南アメリカ原産のFBSの使用は分化効率を決定するために重要である：血清の他のタイプの雇用が影響を与える可能性があります分化プロセス。 50μgの/ mlの最終濃度まで、EBM-20完全な追加アスコルビン酸（AA）を調製した。完全増殖培地をして一週間以内に使用し4℃で保存することができます。 </li><li>ハーベストのiPS上記のように植民地を（ステップ1.6から1.9）。 </li><li> 2 mlのピ​​ペットで1ミリリットルEBM-20で軽く懸濁します。あまりにも塊を解体避けるん - ピペット上下に2〜3倍以上のものを、実体顕微鏡下でコロニーのサイズをチェック。 1:1の比率で超低取付板（35mmディッシュ用など 、6ウェルプレートのウェル1を使用）上にプレート。 1ミリリットルEBM-20とチューブを洗浄し、プレートに加える。 </li></ol> 注：コロニーのサイズ分化過程に影響を与え、心臓の誘導の効率及びタイミングを制御する。均一の大きさの凝集がEBの分化の間に観察されたばらつきを低減することが示されている。 <ol start="4"><li> 3日目に、EBM-20は一度再避けるために、顕微鏡を使用して変更のEBS moval。プレートの端に近いピペット、そして培地を除去してください。 </li><li> 7日目、0.1％でコーティングされたプレートにスイッチのEBにゼラチン、以前37に配置℃で30分間。必要に応じて、ゼラチンは、細胞培養フード下で除去し、プレートを残すことができるO / N 35mmディッシュあたり35-40 EBSを追加します。 </li><li>週2回の地域と変化EBM-20を打つためにEBSをチェックします。実体顕微鏡下でそれらの局在を促進するために、暴行の領域は皿カバーの上に置かれている場所をマーク。締約エリアは約10〜20日後に表示されるはずです。 </li><li>自発的な収縮に領域は、表示され（代わりに2％FBSで、EBM-20として用意）EBM-2培地を切り替えて、それらを、セクション3に説明分離。とき</li><li>鼓動と鼓動領域は​​さらなる実験のために必要とされるまで、週二回の媒体を変更するための他のエリアをチェックし続けています。 </li></ol> 注：分化プロセスの効率に大きく依存しているいくつかの要因が、その中で最も重要な特定の細胞系および心臓の分化を誘導するために使用する血清のバッチである。血清心筋電位およびさまざまなバッチの最高効率は、試験細胞株を得ることができる。 3。エリアの分離と文化を破っ<ol><li>コート12ウェルプレート（4 cm 2の面積）または5μgの/ cm 2のフィブロネクチンを有する近隣のプレート（12ウェルプレートで、ウェル当たり300μlの合計）が完全に表面全体を覆うに十分な量を作るためにPBSで希釈した。細胞培養フード内で発見保ち、乾燥させます。プレートを4℃で包んで保存することができます°CO / N. </li><li>必要に応じて、パスツールピペットやメスを引っ張られたガラスを使用して面積を破って外します。 、1mlのピペットでフィブロネクチン被覆プレートに移す。 </li><li> 1ミリリットルEBM-2を追加します。 </li><li>細胞が除去された領域を示し、メディアを変更するためにプレートをオフに渡ります。他の地域は、Bを起動することがありますようにプレートを、1ヶ月用に保持することができる後で食べる。 </li></ol> 注 ：小さい鼓動塊が必要な場合は、実体顕微鏡下で上下に数回植面積ピペット、それは小さい部分に壊れるまで。これは、（映画の3を参照）、いくつかの拍動細胞のクラスターになります。 <ol start="5"><li>分析のための準備ができるまで週二回培地を変更します。 </li></ol>注：このプロトコルから得られた心筋細胞は、胎児のような形態学的および機能的特性を有し、成人の様表現型に向かって成熟さらに、これらの細胞を区別するために、培養時間を増加させることによって得ることができる。 4。シングル打つセルの単離と解析<ol><li>コート2チャンバースライド（4 cm 2の面積）または全体の培養表面を被覆するのに十分なPBSで希釈した5μgの/ cm 2のフィブロネクチンを有する他の適切な担体。ガラス支持体が使用される場合、ラミニンおよびフィブロネクチンでコート（5μgの個/ cm &lt;&gt;各2）（商標）。 </li><li>セクション3からのプレートからパスツールピペット/メスでエリアを破って外します。 </li><li> 500μlのコラゲナーゼII（MgおよびCaを含むPBSで480 U / ml）を含む15ミリリットルチューブに1ミリリットルピペット、転送細胞を用い、37℃で15分°C、インキュベーション中に一度チューブを振ってインキュベートする。 </li><li> 200μlのピペットで上下にピペッティング。任意の塊が残っている場合は、新鮮なコラゲナーゼIIに転送し、ステップ4.3を繰り返します。 </li><li>に大きな塊が残っていないまで、ステップ4.4を繰り返します。 </li><li> 3ミリリットルEBM-2（無AA）とコラゲナーゼを不活化する。他のチューブは準備が整うまで、チューブを加熱ラックにボンネットの下におくことができます。 4分間1,000 rcfで遠心分離します。 </li><li>ペレットを再懸濁し、1 mlの0.25％を5分間37℃でトリプシン/ EDTA（1X PBS中0.5％のストックから希釈）とインキュベートする。同じ初期サンプルから消化の端数を兼ね備えています。 </li><li> 4ミリリットルEBM-2（無AA）とトリプシンを不活性化。もっとトンなし2.5ミリリットル注射器に18G針を通して細胞を渡す藩7倍。 4分間1,000 rcfで遠心分離します。 </li><li>よく、プレート当たり1ミリリットルEBM-2で再懸細胞ペレット。細胞を2〜3日めっき後の機能的および形態学的分析のために使用することができる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

開示することなく経済的利益はありません。

多能性幹細胞は、低効率とラインの間で高い変動性を持つとはいえ、CMSに自発的に分化する可能性を秘めている。新規の誘導方法の開発は、したがって、プロセスの効率を向上させ、より定義されたプロトコルに向かって焦点を当てている。しかし、これらの新しい分化方法の最も精巧な培養条件、タイミングおよび試薬の濃度を微調整し、高価なサイトカインと成長因子を用いた治療を必要とし、非常に複雑である。また、様々なiPS細胞株の内因性サイトカイン信号レベルの違いは、それはしばしば困難で各細胞系に適したレベルに調整されなければならないサイトカイン濃度を、標準化するレンダー。 得られたiPS由来CMの成熟はまた、疾患のモデリングと創薬アプリケーションのためのiPS細胞の心筋分化をしようとする際に考慮すべき重要な側面を表しています。 differentiatヒトESCとiPS細胞のイオンは、通常、完全に成熟した構造のない胎児の表現型、すなわちとのCMを生じさせる。単層のアプローチが使用される場合に特に当てはまり、その結果として、これらが増幅して、特定の心臓前駆細胞集団を単離2,3生成するためのより適している。 このシナリオでは、まだ広く疾患モデル化の目的のために使用された場合、 &quot;古典的な&quot; EBを凝集法は、良好な実験の必要性に合うように思われる。この方法は簡単で、経済的で、容易に実用的で、かつすべての行に適している。追加の成長因子やサイトカイン、用またはしばしば非常によくiPS細胞によって許容されていない単一セル消化は必要ありません、また、彼らはROCK阻害剤21に追加の治療が必要になります。さらに、EBSに集約はEBを3次元環境を提供し、パラで、多能性細胞の自然な発達過程に似ている生理学的条件に、より似ているcrine信号。また、AAの添加は、iPS細胞の心臓分化を高めるために一貫して示されており、また、その構造的および機能的成熟18,19を向上させることができる。血清の最も適切なバッチを選択すると共に、その心電位に基づいてiPS細胞株を選択すると、さらにCM生成の効率を改善することができる。 最後に、ここで提案する方法はまた、マウスフィーダー細胞、マウス細胞による汚染の可能性を排除し、さらに継代iPS細胞とEBを形成のための技術的な手順を簡素化する必要がないという利点を有する。この方法は、多くの利点を与え、将来の心血管再生医療アプリケーションへの道を開く、前の技法に比べて大きな改善を構成する。

歴史的には、人間開発や病気を駆動する遺伝的および分子メカニズムの研究は、遺伝子組み換え動物モデルの生成に基づいている。しかし、多数の人間の表現型が正常に主な理由は2種の間に存在する生物学的な違いにより、マウスで複製することに失敗する。一方、ヒト組織へのアクセスが制限される場合があり、しばしば綿密な実験的研究のために得られる十分な材料を許可しない。心臓血管生物学の分野では、これらの両方の制限に苦しんでいる：人間の心の生理機能は、マウスのそれとは大きく異なっており、心臓組織のかなりの量は、事後のみアクセスや心臓手術中です。機能的なヒトCMの差別化のための最適なソースを見つけることは、したがって心臓血管生物学における中心トピックとなっており、多くの努力が、この問題に対処するためになされた。種々の細胞型は、iが提案されているncluding骨格筋芽細胞、局所心臓幹細胞、骨髄単核細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞。ただし、データは4一貫していない、これらの細胞を用いて得られた。 山中とトムソン6,7によるヒト胚性幹細胞の誘導（ESC）最初の5と人工多能性幹（iPS細胞）の細胞の画期的な発見は、後でソリューションを提供するために見えた：これらの細胞は無限に増殖する能力と与えるために可能性を秘めているCMを含めた3つの胚葉全てのセル誘導体に上昇する。 iPS細胞の使用は、さらなる利点があります自家成体細胞から誘導されるが、それらは、それらが由来する個体または患者と同じゲノムを運ぶ。従って、それらは、ヒトの遺伝疾患および開発メカニズムの検討を容易にするin vitroモデルの開発を可能にする。この特徴のおかげで、iPS細胞はまた、Oすることができ免疫拒絶や倫理的な問題8に関連vercome問題。 ESCは、まだ幹細胞生物学の分野で金本位を表す場合でも、これらの理由により、研究者は世界中の現在のiPS細胞技術に対してより動いている。 iPS細胞は現在、先天性心血管疾患9,10など、さまざまな条件を、in vitroでヒトの疾患モデルに採用されています。最近では、iPS細胞の病気のモデリングの適用は単一遺伝子の心臓疾患のために行われている（ つまり、QT延長症候群、カテコールアミン多形性心室頻拍）と心臓の欠陥が複雑な表現型（ すなわち Leopardとティモシー症候群、拡張型心筋症）の一部であるの病態。これらのレポートは、CMSに分化されている患者固有のiPS細胞は、 生体内での疾患と同様の表現型および機能特性を表示することを確認した。 しかし、心臓系譜へのiPS細胞の誘導の効果を改善するために多くの課題が残っている。胚様体と呼ばれる凝集体形成を介したヒトESCからCMの自発的な世代は（EBS）成功17実証されています。この発見以来、他の多くの方法が提案されている。多くのグループが大幅に分化プロトコルの効率性を高めており、化学的に定義されており、動物製品を含まない培地試薬（ママリーを参照して、C. らに向かって移動している。、すべての既存のメソッド3の包括的な見直しのために循環研究 （2012） ）。 それにもかかわらず、EB集約に基づいて古典的な方法は、まだほとんどの一般的な機能の研究を行い、病気のメカニズムを調査するために使用さを表しています。提案プロトコルは、心臓分化プロセスを増強することが示されている血清およびアスコルビン酸の存在下でのEBにiPS細胞の集約と文化とPOに基づいていますsitivelyこれらの細胞18,19の成熟に影響を与える。この記事では、具体的にこの方法論を通過しますと、患者固有のiPS由来のCMを生成するためのフィーダーフリーのiPS細胞株を使用する方法を示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

心臓の開発を推進したイベントを調査するために、ヒトにおける心筋疾患につながる分子メカニズムを決定するためには、機能的なヒト心筋細胞（CMS）を生成する第不可欠である。薬剤の発見および毒性試験におけるこれらの細胞の使用は、ヒト由来の細胞に対する予備臨床的に検証する心臓障害の治療のための新しい薬理学的分子を可能にする、非常に有益であろう。 CMの発生源のうち、誘導多能性幹（iPS細胞）細胞は、それらが容易にアクセス可能な、患者の組織から直接導出することができるように、最も有望間であり、ボディ1の全ての細胞型を生じさせるための固有の能力を有する。いくつかの方法は、古典的な胚様体（EB）集約アプローチから化学的に定義されたプロトコル2,3に至るまでのCMにiPS細胞を区別するために提案されている。この記事では、EBをベースのプロトコルを提案し、表示する方法このメトキシdは効率的にフィーダーフリーiPS細胞からの機能CM-様細胞を生成するために使用することができる。

我々の研究では、いくつかのiPS細胞株からのCMを生成した。これらのラインは、最初にMEFフィーダー層上で生成されたが、すぐに定義された媒体（またはいずれかmTESR1 Nutristem）を用いて、マトリゲル上に置いた。種々のアッセイは、形態学的特性、多能性細胞の典型的なマーカーの発現（OCT-4、SSEA4およびTRA1-60）、およびそれらのゲノム安定性（ 図1）の維持を確認するために使用した。 心臓系統への誘導は、血清およびAA（ 図2Aおよび2B）、特定の種類の存在下でのEBと文化にiPS細胞の集合体によって引き起こされました。締約領域が（ 図2Cおよびムービー1）を使用した細胞株に応じて、全体の20から35パーセントを占めました。締約酵素消化（ 動画2）することによって、これらの地域から分離されたCMは、典型的な心筋細胞の構造タンパク質（心筋トロポニン、＆ALPHを表明;-サルコメアアクチン、αおよびβミオシン重鎖）、ギャップ結合蛋白（コネキシン43）、及び主要なイオンチャネル（ 図2D-2F）。これらの細胞の電気生理学的解析では、心房結節、心室プロファイル（データら 、SG、プリオリ、図示していない。、J. CLIN。投資。、プレス 、14,15,20 年 ）で細胞を含む不均一な集団を明らかにした。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50429/50429fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50429/50429fig1.jpg" /> 図1。フィーダーフリーのiPS細胞のメンテナンスは、多能性には影響しません。AB）をマトリゲル上に成長したiPSコロニーは、位相明るいエッジと著名な核小体で、彼らの人間ESC様の形態を保持している。CD）iPS細胞を示す免疫蛍光分析正しく転写因子OCT-4を発現している（C）とTRA1-60表面抗原（スケールバー：50μmの）。（D）（E）細胞蛍光分析は、典型的な表面多能性抗原（SSEA-4およびTRA1-60）の発現を確認した。ゲーティング戦略は、左の散布によって示されている。（F）マトリゲル上に成長したiPS細胞の代表的な核型分析は。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50429/50429fig1large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50429/50429fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50429/50429fig2.jpg" /> 図2。 CMの機能由来のiPSの分化。分化プロトコルの）模式図。iPS細胞から集約B）胚様体。C）収縮の面積の表現。D）RT-PCRショーiPS細胞由来の鼓動塊によっていくつかの心臓特異的イオンチャネルの発現をING（CACNA1A - カルシウムチャネル、電圧依存、α1Aサブユニット; SCN5A - ナトリウムチャネル、電位依存性、タイプV、αサブユニット; KCNQ1 - カリウム電圧依存性チャネル、サブファミリーのようなKQT、部材1）とミオシン重鎖（MHC-及びMHC-B）の両方の形式。胎児の心臓細胞由来のcDNAを陽性対照として用いたのに対し、全く発現は、iPS細胞において検出されなかった。を示す単一のCMが構造タンパク質α-サルコメアアクチン、心筋トロポニンI（TNNI）、および心臓特異的接合コネキシン43（CNX-43）を発現するのiPS由来。のHGPRTがハウスキーピング遺伝子として用いた。EF）は、免疫蛍光染色スケールバー：50μmである。画像はAxioVisionのツァイス蛍光倒立顕微鏡を用いて取得し、ImageJので分析した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50429/50429fig2large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 &lt;strong&gt;のムービー1。 iPS細胞由来の領域を縮小すること。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50429/50429movie1.avi" target="_blank">ムービーを表示するにはここをクリックしてください。</a> 映画の2。契約面積の酵素消化から得られた単収縮のiPS由来のCMは、。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50429/50429movie2.avi" target="_blank">ムービーを表示するにはここをクリックしてください。</a> 映画の3。部分的に機械的な解剖によって得られた小さな請負クラスタは、。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50429/50429movie3.avi" target="_blank">ムービーを表示するにはここをクリックしてください。</a>

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Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K ビュー.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. 多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。

ビデオ: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

生物学

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...