SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

IL-3およびWEHI-3D​​-馴化培地の調製のソース注：マウス顆粒球性白血病細胞株WEHI-3D​​は、IL-3を含有する馴化培地を生成するために培養されます。 <ol><li> 50μg/ mlのゲンタマイシンダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％の長寿命グルタミンサプリメント、文化WEHI-3D​​。 T175のcm 3の組織培養フラスコ中の新鮮な培地50mlに対数増殖期中5×10 6個の細胞を接種し、約7日間増殖または細胞が約24による成長のそれらの対数期を経過するまで- 48時間（培養中の過剰な細胞死を避けるため）。 500 mlの一度に製造することができる - 馴化培地を200のバッチがので、-20℃で、複数の年間保存することが可能です。 </li><li> 15分には、細胞と細胞破片を除去するために、1,000×gでフラスコとスピンからの流体および細胞をデカントします。 supernのトップ90％を削除しますatant。 0.22μmのフィルターユニットを通して濾過。 </li><li>小分けしWEHI-3D​​馴化培地（CM）1ミリリットル中に、-20℃での保存のために50ミリリットルと200ミリリットルのボリュームまたは-70℃です。小さなアリコートを分析の準備、因子依存性細胞株の継代培養培地を作製するための中間ボリューム、および長期保存のために大容量のために有用です。 IL-3は、無菌条件下で使用した場合ので、解凍した媒体は、数週間保存することができ、4℃で比較的安定です。 </li><li>代替的に、0.22μmフィルターユニットを通して濾過した後、培地中に希釈した50 ng / mlでの濃度で組換えマウスIL-3を使用します。 </li></ol> VEGFR-2-EpoRを-BA / F3および制御するBa / F3細胞株の2文化と評価<ol><li> DMEMで培養制御するBa / F3細胞を、10％FBS、50μg/ mlのゲンタマイシンまたはペニシリン/ストレプトマイシンサプリメント、1％L-グルタミンおよび10％WEHI-3D​​-CM安定。細胞からの3日ごとに約1時15希釈で継代細胞対数期で増殖。 </li><li> DMEMで培養VEGFR2-EpoRを-BA / F3細胞を、10％FBS、50μg/ mlのゲンタマイシン、1％L-グルタミンおよび10％WEHI-3D​​-CMおよび1mg / mlのG418を安定化。対数期に増殖している細胞から1：15希釈で継代細胞。キメラ受容体の構築および発現の詳細については24を参照してください。 </li><li>中期対数期培養物から収穫制御するBa / F3またはVEGFR2-EpoRを-BA / F3細胞。穏やかにフラスコの底から、これらの非付着細胞を除去するために、ピペット。培地IL-3を含むを除去するために（細胞ペレットを回収するために5分間750×gで、10 mlの遠心分離）を、マウスの等張リン酸緩衝食塩水、pHが7.3（PBS）で3回洗浄します。 </li><li>その後、ウォッシュWEHI-3D-CMまたは組換えIL-3を含まないDMEMと添加剤と一度細胞、および13.5μlのあたり7.4×10 4細胞/ ml（ すなわち、1,000細胞の濃度で、この培地中で再懸濁し、10,000個の細胞あたり血球計数器を用いて計数することによって決定されるように135μL）のためにそれぞれのアッセイの半定量的または定量的のバージョンで使用しています。 </li><li>トリパンブルー排除（注意）によって生存のために細胞を評価します。細胞集団で1と血球計数器に100個の細胞の最小値をカウント：PBS（0.4％）1にトリパンブルーを混ぜます。色素を取る細胞は死んだか死んで考えられています。 98％以上の生存率アッセイを行うために必要とされます。 </li></ol> 3.半定量的アッセイ<ol><li> RTで72ウェルのマイクロウェルプレートのウェルにIL-3欠損培地の13.5μlの中に含まれる洗浄された細胞（1,000細胞）を追加します。重力がバイアス細胞濃度をしないことによって、細胞沈降を確実にするために等分中に細胞懸濁液を混合するために注意してください。よく較正されたP20自動ピペット、およびオートクレーブ処理のヒントを参考にしてください。 </li><li>較正されたP20ピペットまたは、好ましくは、P2ピペットを用いて（ウェルあたり1,000個の細胞を含む15μlの最終容量を作り、1.5μl）を10％の体積でウェルに試験サンプルおよびコントロールを追加します。 CAを取ります再サンプルはpH、塩および他の細胞増殖抑制性/潜在的な細胞傷害性物質の面でのBa / F3細胞の培養条件と互換性があることを確認します。可能であれば、（それぞれ、 例えば、DMEMまたはPBS）に適合する培地または緩衝液を使用するか、またはそのような培地または緩衝液中に希釈します。同じチップで粉砕して、混合を確実にします。 </li><li>対照サンプルについては、単独で含有ノーIL-3を培地（i）を含みます。 （ⅱ）WEHI-3BD-CMは10％最終容量で、単独で培地に添加し;および/または（iii）VEGF-Aには、IL-3を含まない、培地単独中を100ng / mlに希釈しました。 </li><li>滅菌水、PBSまたは媒体とマイクロウェルプレートの未使用井戸を記入し、（水に浸したティッシュペーパーで）加湿容器内にプレートを配置したガス交換を可能にします。 10％CO 2の加湿雰囲気中で容器内の細胞をインキュベートします。試験サンプルおよびメディアコンポーネントが利用可能である場合、このアッセイは、快適に一人で3時間に設定することができます。 </li><li>典型的に16時間後にプレートを評価しますインキュベーションは、その時に正と負のサンプル間の時間差別は明らかです。細胞が培養中に表示される方法の例については、 図3を参照してください。 100倍の倍率 - 40で標準的な倒立位相差顕微鏡を使用してプレートを分析します。 注：ウェルズはラウンドと半透明表示されるセルが含まれていますように、IL-3またはVEGF-Aとして支持する成長因子を含みます。支援的な成長因子を含まない、または培地のみを含むウェルは、円形細胞の数、ならびに死亡または瀕死の細胞および細胞破片（例えば、 図3C）を低減しています。 24〜48時間後のインキュベーションでアッセイを評価する感度のために最適です。 </li></ol> 4.定量的バイオアッセイ<ol><li>室温での標準的な96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、IL-3欠乏培地中で洗浄された細胞（135μl中10,000細胞）を加えます。 CEには影響しません重力によって細胞の沈降を確実にするために等分中に細胞懸濁液を混合するために注意してくださいLL濃度。 </li><li>較正されたピペット（P20）を使用して、10％の容量（15μL）でウェルに試験サンプルおよびコントロールを追加します。試料はpH、塩または他の細胞増殖抑制性/潜在的な細胞傷害性物質の面でのBa / F3細胞の培養条件と互換性があることを確認するために注意してください。可能な場合は、互換性のあるメディアを使用するか、バッファー（ 例えば 、DMEMまたはPBS）またはそのような培地または緩衝液中に希釈します。フィルターは、0.22μmの細孔酢酸セルロース遠心管フィルターユニットを用いて少量を滅菌します。 </li><li> 48時間、10％CO 2の加湿雰囲気中で、細胞、成長因子および/ ​​または阻害剤の薬剤の混合物をインキュベートします。水に浸したティッシュペーパーを有しており、ガス交換を可能にする加湿容器内にアッセイを行います。ウェル中の生細胞数の代理マーカーは、インキュベーション期間の終了時に、その下に記載されている代替方法のいずれかを使用してアッセイを評価しています。 </li><li> 代替＃1：3 H-thymidineの設立 注：この定量化は、96ウェルプレートフォーマットのために設計されています。 <ol><li> 37°C（ウェル当たり150μlの体積）で48時間、アッセイプレートのインキュベーションの後、（IL-3 / WEHI-3D ​​CMなしのBa / F3培地）アッセイ培地を50μlの体積で3 H-チミジンを加えますウェルあたり1μCiの最終用量を与え、20μCiの/ mlの濃度でウェルあたり。 </li><li>セルハーベスターを用いて細胞を回収する前に、37℃でさらに4時間培養します。シンチラントにフィルタを配置することによって、個々のサンプルを抽出し、液体シンチレーションカウンターで定量化します。 </li></ol></li><li> 代替＃2：携帯ATPの生物発光検出 注：このアプローチは、集団内の生存細胞を反映した生物発光信号を生成することができる細胞溶解物と組み合わせたATPモニタリング試薬を使用しています。 <ol><li> ATPを抽出し、生成するATPモニタリング試薬を使用するために細胞を溶解製造業者の説明書に従って発光シグナル。 96ウェルプレートフォーマットと互換性のルミノメーターを使用して発光をお読みください。 </li></ol></li><li> 代替＃3：生存可能な細胞によるインジケータ染料の酵素的還元 注：レサズリンベースのアッセイは、細胞生存率に対して良好な相関を示します。 <ol><li>レサズリン系色素で培養した細胞を組み合わせて、製造業者の説明書に従って、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイを定量化します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+VEGF+and+its+receptors.">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li><li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-D:signalling+mechanisms,+biology+and+clinical+relevance.">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li><li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration.">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li><li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+bevacizumab,+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer.">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li><li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid.">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+vascular+endothelial+growth+factor,+VEGF-C,+is+a+ligand+for+the+Flt-4+(VEGFR-3)+and+KDR+(VEGFR-2)+receptor+tyrosine+kinases.">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+D+(VEGF-D)+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+(Flk1)+and+VEGF+receptor+3+(Flt4).">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li><li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity.">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1.">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li><li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+(VEGFs)+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+(VEGF+receptor+2).">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li><li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis.">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics.">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li><li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis.">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li><li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis.">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer.">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li><li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium.">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers.">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li><li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D.">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li><li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li><li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+tyrosine+kinase/cytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand.">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability.">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li><li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D:+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding.">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence,+receptor-binding+specificities,+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens.">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li><li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies.">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis.">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man.">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth,+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C/D+receptor+VEGFR-3.">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3.">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li><li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COSMIC+(Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer)+database+and+website.">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li><li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome.">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li></ol>

スティーブンA.スタッカーとマルク・M.アーヘンは、概日テクノロジーズ株式会社、成長因子のVEGFファミリーを標的とすることにより治療薬を開発する会社では株主です。

ここに記載のアッセイは、増殖因子に依存する高い生存性の細胞を、使用することに依存しています。細胞は、したがって、彼らが要因に依存していることを確認し、キメラ受容体の発現を維持するために慎重に培養する必要があります。媒体は作りたてと過度に長期間およびWEHI-3D​​ CMが重要である高活性であることが格納されていないことを保証します。細胞は完全に救出リガンドに細胞を暴露する際に残留IL-3は、アッセイを汚染しないことを確実にするために、アッセイ培地中にIL-3含有培地から洗浄する必要があります。リガンドは、多くの異なる形態で来ることができるようにアッセイするためにこれらを準備する際には注意する必要があります。防腐剤、抗菌剤、塩または異なるpHの緩衝液は、アッセイに影響を与えることができ、および非トランスフェクトするBa / F3細胞の並列テストは、バッファ関連の問題について通知することができる理由です。 私たちは、半定量的および定量的なプロトコルの両方を使用しています。半quantitatiVEのアッセイは、前より多くの時間とサンプルを必要とし、完全に定量にコミットするには、サンプルの活動を迅速に評価することができます。出版物のためのデータを生成する際の定量方法が排他的に使用されます。培養物の生存度を検出するための別の方法は比較的簡単です。定量的アッセイは、増殖の定量化のための異なるフォーマットの数に適合されており、我々が使用している（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド） MTT 30、細胞ATPの生物発光検出（未発表）、レサズリン系色素（ 図2）と成功との3 H-チミジン31。近年では、生物発光のアプローチを適応させる放射線の使用から離れて進化してきたし、その費用対効果に起因しレサズリン系染料を使用していました。アプローチのすべては、適切な結果を与え、選択は試薬の可用性とAに依存してもよいです与えられた実験室/機関または特定の手法に精通に特化したプレートリーダーをssociated。 トラブルシューティングは、リガンド刺激アッセイの3つの主要コンポーネントの活動を中心に展開し、i）はIL-3 CM、ⅱ）VEGFR-2-EpoRを-BA / F3細胞およびiii）。初期の文化の中で不適切なWEHI 3D細胞、貧弱な貯蔵条件、過度の凍結融解サイクルまたは高すぎる希釈で使用するCMにおけるIL-3の貧しいレベルが不十分なアッセイを妨げます増殖する培養物を作成することができます。細胞集団は、それらの通常の明るい丸い外観を損なう、ゆっくり成長し、これは、通常、対照ウェル中で検出されます。長期間培養で維持場合、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3アッセイ細胞は経時キメラ構築物の細胞表面発現を失うことができます。液体窒素ストックの良い数字を維持することは非常にキメラ受容体を発現する細胞の新鮮​​な培養液を常時利用できるようにすることができます。必要に応じて高発現している人口がすることができますVEGFR-2のリガンドで細胞を増殖させ、フローサイトメトリー選別によってキメラ受容体を高レベルで発現する集団を選択することによって達成しました。次いで、これらの細胞をさらに凍結培養で増殖させます。 技術は、VEGFR-2細胞外ドメインとの相互作用を分析するための便利で単純化された代替手段ですが、初代内皮細胞上の天然受容体は、他のVEGFR、共受容体などの存在下でプローブされるより洗練された実験を置き換えるために見ることができませんニューロピリン。このアッセイの基礎となる細胞（B細胞）、内皮細胞から区別され、従って、内皮細胞におけるVEGFR-2の活性化に応答する細胞質シグナル伝達経路および転写因子を研究するために使用されるべきではありません。それにもかかわらず、この方法は、固定化レジェップとリガンドの相互作用を調べ、単純な結合アッセイの間にある受容体 - リガンド相互作用を分析するのに有用なアプローチを提供します器、および受容体結合の分析および一次内皮細胞への結合アッセイで見られる下流効果（例えば可溶性受容体細胞外領域または免疫グロブリンに融合した受容体細胞外領域として）を構築。これは、多くの受容体型チロシンキナーゼは、一般に、それらのシグナル伝達カスケードを開始することにより、受容体の結合および架橋結合、最初の2つのステージを可能にするシステムを提供します。学術的および商業設定の数への応用は、バリアントリガンドまたは受容体 - リガンド相互作用の阻害剤を評価する場合は特に、それが結合特性を調べるために有用なアッセイとして受け入れられて示されています。 アッセイはまた、受容体細胞外ドメインまたはそのリガンドの新しい阻害剤の分析に有用です。このアッセイは、ヒトGEに見出される（どちらも継承され、体細胞）迅速ゲノム変異のコンテキストで見られるリガンドまたは受容体の細胞外領域の変異体をスクリーニングするために使用することができます彼らの機能的結果を決定するために、癌32,33などの疾患でファミコン。したがって、このVEGFR-2アッセイのアプリケーションは、将来的に拡大する可能性があります。さらに、このアッセイの基礎となる一般的なアプローチは、健康及び疾患におけるシグナル伝達分子の大規模かつ重要なファミリーを構成する細胞表面受容体チロシンキナーゼ、のために、より広く利用することができます。

分泌タンパク質成長因子およびその同族の細胞表面受容体の血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーの可溶性リガンドおよび膜埋め込み受容体、細胞膜を横切ってシグナルを伝達におけるそれぞれその機能の重要かつ多様な群です。彼らは、内皮細胞でだけでなく、上皮由来の細胞と免疫系1,2のもので、主に機能します。リガンド活性化VEGF受容体（のVEGFR）によって係合さシグナル伝達経路は、加齢性黄斑変性症および癌などの主要な病態において重要であり、それらを標的とする治療薬は、頻繁な臨床用途（VEGF-Aを標的とする、例えば、モノクローナル抗体ベバシズマブ）であります3,4。 VEGFファミリーの複雑さの一つは、自然界に存在する可溶性リガンド（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、パラポックスウイルス属ファミリーORFとヘビ毒VEGF、加えて他によってコードされるVEGFタンパク質の多様性であります抑制するVEGF-A）2のアイソフォーム。 これらのリガンドは、受容体チロシンキナーゼファミリーの3つのメンバー、すなわちVEGFR-1、VEGFR-2およびVEGFR-3と相互作用します。これらの受容体は、可変異なる細胞型上で発現されるが、多くの場合、すべてのサイズ5の血液やリンパ管を裏打ちする内皮細胞の表面上に共発現されます。 VEGFR-2は、哺乳動物のリガンドのVEGF-6、VEGF-C 7およびVEGF-D 8,9と同様にオルフウイルスVEGF 10とヘビ毒VEGF 11を結合することができます。 VEGFR-2は、胚発生、創傷治癒、癌、および眼疾患における血管形成（既存の血管か​​らの新しい血管の成長）を駆動する際に主要な役割を果たしています。これらの状況では、そのようなVEGF-A、-C及び-Dバインドなどとリガンドは、血液、血管内皮細胞12-15上の受容体を活性化させます。リンパ管内皮細胞上で、VEGFR-2は、リンパ管形成、新しいリンパ管16を形成する役割を果たしています。 VEGFR-2はまた、拡張および健常組織と疾患17の主要な動脈およびリンパ管の拡大を促進することができます。 VEGFR-2の完全な理解：リガンド相互作用は、血管新生依存性疾患18の治療に使用するための阻害剤の開発のためには重要です。 VEGFR-2のVEGF-A結合のほとんどのアイソフォームは、VEGF-CおよびVEGF-Dのタンパク質分解切断はVEGFR-2 19,20に高い結合親和性を示すVEGF-相同ドメインからなるフラグメントを放出するために必要とされます。 我々は（特殊な培地を必要とする）を購入するには高価通過に技術的に困難である初代内皮細胞の必要性を回避するために設計され、VEGFR-2のリガンドを監視するためのバイオアッセイ、および文化21を開発し、複数のVEGFRおよび関連コを表現しています受容体22。スタッドに目的とする場合、他のVEGF受容体または共受容体とVEGFR-2のヘテロ二は、不必要な複雑さを引き起こす可能性がありますyのバイナリ受容体-リガンド相互作用、特異的な受容体に起因する活性を評価する、または阻害剤の効果を評価する。23。バイオアッセイは、細胞膜に関連する受容体の可動性を保持し、VEGFR-2の細胞外領域に結合し、架橋するリガンドの能力の評価を可能にします。 バイオアッセイは、（この場合はVEGFR-2）のVEGF受容体の細胞外領域を貫通し、エリスロポエチン受容体（EpoRを）、サイトカイン受容体ファミリーのメンバーの細胞内領域に融合されたキメラ受容体の構築に依存しています8,24。この融合タンパク質は、その後、結合し、受容体の細胞外ドメインが可能な細胞質エフェクター領域の活性化を引き起こす架橋することができるリガンドとその刺激によって、因子依存性プロB細胞系のBa / F3で表され細胞を促進するために、ヤヌスキナーゼ（のJAK）を介して生存シグナルを伝達生存および/または増殖。対照的に、リガンドと全長VEGFR-2と同じ細胞型において、および刺激の発現は、VEGFR-2経路の近位シグナル伝達エフェクターは、この細胞タイプでは利用できないことを示す、細胞の生存と増殖を促進しません。 私たちは、新規VEGFR-2リガンド10,19,20,24-29の結合を調査するために、種々の状況でアッセイを使用していました。 VEGFR-3-EpoRを-BA / F3アッセイと組み合わせて、我々は、VEGFR-2およびVEGFR-3 30に結合し、架橋のための相対的なVEGF-Cの活性とVEGF-Dの成長因子を比較しました。アッセイは、VEGFR-2またはVEGF-D、可溶性VEGFR-2トラップ及びVEGFファミリー31を標的とするペプチド模倣体に対するモノクローナル中和抗体の阻害活性を特徴付けるために使用されてきました。アッセイはまた、一次内皮細胞における試験の前にバインドするために、異なるオルフウイルス株からのVEGFの能力とクロスリンクVEGFR-2を表示するために使用されました<s&gt; 10,26アップ。アッセイは、それらがより面倒な内皮細胞アッセイ25時または浄化成長のための評価のプロトコルは27因子に導入される前に速やかに活性を評価することができるのVEGFの変異体の迅速なスクリーニングのために特に有用です。 私たちが説明するアッセイは、実施が容易であり、かつ半定量的バージョンは、成長因子、抗体または他の実験のための可溶性受容体ドメインの生産や精製を監視するときに時々必要とされる迅速な決定を可能にします。アッセイの使いやすさは、特定の組織または器官系から血液やリンパ管由来初代内皮細胞を用いて行われ、さらに、より完全な研究を補完する理想的なことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1110">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">T8154</td>
			<td style="width:424px;">0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulphate (Geneticin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3H-Thymidine</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:181px;">NET-027</td>
			<td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vialight Plus Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-221</td>
			<td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prestoblue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13261</td>
			<td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136528</td>
			<td>Small microtitre plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">96 well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:183px;">Falcon, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DMEM (1X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">11965-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Foetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">&#160;10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Harvester</td>
			<td style="width:183px;">Tomtec Life Sciences</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Scintillation Counter</td>
			<td style="width:183px;">LKB Wallac</td>
			<td style="width:181px;">1205</td>
			<td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">UniFilter-96 GF/B</td>
			<td style="width:183px;">Perkin Elmer</td>
			<td>6005177</td>
			<td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &#181;m poresize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:323px;">0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td>
			<td style="width:183px;">Costar, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">8160</td>
			<td>Centrifuge tube filters have a 0.22&#181;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500&#181;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fluorescence Reader</td>
			<td style="width:183px;">BioTek</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

血管生物学に関与する受容体チロシンキナーゼおよびそれらの相互作用するリガンドの分析を伴う関連する受容体のファミリーの構成的発現、関連するリガンドの広い範囲と専門内皮細胞の初代培養物を扱うのが困難にしばしば困難です。ここでは、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）、血管新生およびリンパ管新生を促進シグナルの主要なトランスデューサに対するリガンドを検出するためのバイオアッセイを説明します。エリスロポエチン受容体（EpoRを）の膜貫通および細胞質領域とVEGFR-2の細胞外（リガンド結合）領域の融合体をコードするcDNAは、因子依存性細胞株のBa / F3で表されます。この細胞株は、インターロイキン-3（IL-3）、24時間以内に細胞死におけるこの因子の結果の離脱の存在下で成長します。 VEGFR-2 / EpoRを受容体融合生存を促進する別のメカニズムを提供するの発現およびPotentiaでLLY融合タンパク質（ すなわち 、することができますクロスリンクVEGFR-2細胞外領域1）の細胞外部分に結合し、架橋することができるリガンドの存在下で安定にトランスフェクトされたBa / F3細胞の増殖。リガンドと細胞の少量を24時間で迅速な結果を可能にする半定量的アプローチ、および生存細胞数の代理マーカーを含む定量的アプローチ：このアッセイは、2つの方法で行うことができます。アッセイは実行が比較的容易であり、既知のVEGFR-2リガンドに応答性の高いであり、そのような受容体またはリガンドに対するモノクローナル抗体、および可溶性リガンドトラップとしてVEGFR-2シグナル伝達の細胞外阻害剤を収容することができます。

このセクションでは、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ（アッセイの原理については、 図1を参照）の本質的な特徴を実証する実験の結果を示します。その他の公表された研究は、代替VEGFR-2リガンド、変異型VEGF分子および抑制性モノクローナル抗体8,10,19,24-30ためのアッセイのより広範なアプリケーションを示しています。 ここに提示したデータは、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ三組換えヒトリガンド（VEGF-165、VEGF-CおよびVEGF-D）VEGFRに特異的な活性を定量化するために使用されるアッセイを表します-2阻害するモノクローナル抗体（ベバシズマブ）の存在下でのVEGF-165のデータは、VEGF-165を単独で（ 図2）への応答に対して正規化されています。予想通り、ベバシズマブはVEGF-アッセイにおける165の効果を遮断したが、VEGF-CおよびVEGF-Dの活性に影響を及ぼしませんでした。 アッセイまたは時その開発中にアッセイを観察するの半定量的バージョンでは、標準的な倒立位相差顕微鏡を使用してアッセイを閲覧することは、アッセイの進行状況に関する貴重な情報を提供することができます。 IL-3を含む培地、またはVEGFR-2に対するリガンド、 例えば、VEGF-Aとインキュベートしたとき、アッセイ（ 図3）の分析は、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ細胞の良好な生存率を示しています。これらの細胞は大きく、半透明であり、かつ粒度のないか、または最小限の証拠は、培養中の細胞質や細胞の破片ではありません。追加なしの成長因子で還元細胞数といくつかの健康な細胞の証拠がすでに存在します。本細胞は、その細胞質に有意な粒度を有し、細胞破片は、培養の一貫した特徴です。 48時間後の生存細胞の兆候はありません。 VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイの原理を説明すると、図1の模式図である。（A）のBa / F3細胞は、因子依存性であり、そのように、外因性の成長因子を必要とするIL-3を介して、細胞増殖/生存能力を刺激します内因性IL-3受容体およびJAKシグナル伝達経路。 EpoRを、これらの細胞の救出に表現されている場合も、JAK経路を介して発生する可能性があります。このようなVEGFR-2活性化の下流標的として最小限のシグナル伝達におけるVEGFR-2の結果として、全長受容体チロシンキナーゼの発現は、JAK経路を係合しません。膜貫通およびBa / F3細胞にトランスフェクトし、特異的なVEGFR-2のリガンドで刺激し、JAK経路を活性化し、セルを駆動することが可能であるEpoRを、細胞質領域に融合されたVEGFR-2の細胞外領域を有するキメラレセプター生存と増殖。 （B）VEGFR-2-EpoRを-BA / F3細胞を、フローサイトメトリーを用いて定量することができるキメラVEGFR-2-EpoRを受容体の有意なレベルを発現します。一度IL-3含有培地のうち洗浄、細胞を、細胞の生存/増殖のいずれかを駆動する培養条件の多様に配置されます。特定の成長因子を含まない非トランスフェクトするBa / F3細胞またはVEGFR-2-EpoRを-BA / F3細胞が生き残る/成長することができない。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53867/53867fig2.jpg" /> 図2.マウスVEGFR-2-EpoRをキメラを発現VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイIL-3依存性のBa / F3細胞におけるVEGFR-2リガンドの評価を除いて（IL-3を含まない培地に播種しために+ IL-3のサブセット、示されるように）と、ヒトVEGF-165、VEGF-CΔNΔC（VC）（これは、中央領域で構成され、NおよびC末端プロペプチドを除外するVEGF-Cの形態である）、またはVEGF-DΔNΔC（これは中央領域を含み、NおよびC末端プロペプチド（VD）を除外VEGF-Dの形態である）、VEGF-Aに結合し、阻害100ng / mlのヒト化中和モノクローナル抗体ベバシズマブ（時なく、VEGF-CまたはVEGF-D）、または非中和対照抗体トラスツズマブ、0.75μMで示​​されるように。 NF =追加の成長因子を含まない培地。 48時間後、相対的な生細胞数は、細胞ATPの生物発光検出を用いて定量しました。垂直バーは、3つの独立した実験の平均値の標準誤差（単独のVEGF-165、最初のバーへの応答に対して正規化）手段を表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig2large.jpg" target="_blank">Vにはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版をIEW。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53867/53867fig3.jpg" /> 図3. VEGFR-2-EpoRを-BA / F3細胞は生存のための外部成長の要因に依存している。IL-3依存性Ba / F3細胞は、マウスを表現するVEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイの例VEGFR- 2-EpoRをキメラとIL-3、（B）100ng / mlのヒトVEGF-165（無IL-3）、または（C）媒体を提供する10％WEHI-3D ​​馴化培地を含有する培地（A）に播種しました。無IL-3または追加の成長因子。培養物は、IL-3（A）もしくはVEGF-165（B）の存在下で高い生存細胞を示すアッセイに24時間が示されている一方、無IL-3または追加の成長因子（C）細胞死との培養および赤uced生存率は明らかです。バーは100μmであるスケールします。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K ビュー.  Peter MacCallum Cancer Centre. 我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。 

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A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

生物学

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of the intact endothelium will provide valuable information for understanding the cellular and molecular events in the dysfunctional endothelial cells. Here, we describe a modified en face immunofluorescence staining technique which enables scientists to obtain clear images of the intact endothelial surface and analyze the molecule expression patterns in situ. The method is simple and reliable for observing the entire endothelial monolayer at different sites of the aorta. This technique may be a promising tool for understanding the pathophysiology of atherosclerosis, especially at an early stage.

Here, we present a protocol for immunofluorescence staining to observe the endothelial cells of the mouse aorta directly. This technique is useful when studying the cellular and molecular phenotype of endothelial cells in different flow patterns and in the development of atherosclerosis.

血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic nephropathy, are associated with VEGF dysregulation in the kidney. The factors that govern VEGF under physiologic conditions in the kidney are not well-understood. Luteinizing hormone (LH), a pro-angiogenic hormone, helps regulate physiologic VEGF expression in reproductive organs. Given that LH receptors are found in the kidney, we, at Zietchick Research Institute, hypothesized here that LH also helps regulate VEGF expression in the kidney as well. To provide evidence, we aimed to show that LH levels are able to predict VEGF levels in the mammalian kidney. Most VEGF-related investigations involving the kidney have used lower order mammals as models (i.e., rodents and rabbits). To translate this work to the human body, it was decided to examine the relationship between VEGF and LH in higher order mammals (i.e., bovine and porcine models). This protocol uses the total protein lysate from the kidney cortex. Keys to this method&#39;s success include procurement of kidneys from slaughterhouse animals immediately after death as well as normalization of analyte levels (in the kidney extract) by total protein. This study successfully demonstrates a significant linear relationship between LH and VEGF in both bovine and porcine kidneys. The results are reproducible in two different species. The study provides supporting evidence that the use of kidney extracts from cows and pigs are an excellent, economical, and abundant resource for the study of renal physiology, particularly for examining the correlation between VEGF and other analytes.

Presented here is a protocol for utilizing a cortical kidney extract preparation and total protein normalization to demonstrate the correlation between vascular endothelial growth factor and luteinizing hormone in the mammalian kidney.

腎皮質抽出物における血管内皮増殖因子と黄体形成ホルモンとの線形関係の実証

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

in vitro疾患モデリングのためのヒト初代弁細胞の単離

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...