This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).

<ol>
	<li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics.">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+FRET+sensor+proteins+based+on+mutually+exclusive+domain+interactions.">Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).</li><li>Lindenburg, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Stickiness:+Thermodynamic+Characterization+of+Intramolecular+Domain+Interactions+To+Guide+the+Design+of+Fo&#776;rster+Resonance+Energy+Transfer+Sensors.">Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Fo&#776;rster Resonance Energy Transfer Sensors.</a> Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).</li><li>van der Velden, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+bile+acid+transport+in+single+living+cells+using+a+genetically+encoded+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+sensor.">Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer sensor.</a> J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).</li><li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heteromeric+organic+solute+transporter+&#945;-&#946;,+Ost&#945;-Ost&#946;,+is+an+ileal+basolateral+bile+acid+transporter.">The heteromeric organic solute transporter &#945;-&#946;, Ost&#945;-Ost&#946;, is an ileal basolateral bile acid transporter.</a> J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).</li><li>Meier, P. J., Stieger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salt+transporters.">Bile salt transporters.</a> Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).</li><li>Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mTurquoise-based+cAMP+sensor+for+both+FLIM+and+ratiometric+read-out+has+improved+dynamic+range.">A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range.</a> PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Plass, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesoid+X+receptor+and+bile+salts+are+involved+in+transcriptional+regulation+of+the+gene+encoding+the+human+bile+salt+export+pump.">Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump.</a> J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、生きた細胞内の胆汁酸輸送の時空間ダイナミクスを監視することができる新規な遺伝的にコードされた胆汁酸センサーを使用するための詳細なプロトコールを提示します。このバイオセンサーは、それによって、FRETベースの胆汁酸センサー（BAS）を形成する、FXR-LBDに融合されセルリアンとシトリン蛍光タンパク質で構成されています。 細胞培養およびFACSまたは（共焦点）顕微鏡の基本的な経験をしたとき胆汁酸センサーは、使用中の比較的簡便です。しかし、いくつかの側面は、いくつかのトラブルシューティングが必要な場合があります。胆汁酸輸送体と組み合わせた胆汁酸センサーを使用する場合には、木炭濾過血清を含む培地中で細胞を培養することが推奨されます。木炭は、さらに血清からの吸着によって胆汁酸のレベルを低下させます。これは非感受性センサーの最も一般的な原因であるため、特に、NTCPなどの輸入の存在下では、これは、培養中のセンサの飽和を防ぐために重要です実験中。そのため、他のセンサは、より大きなダイナミックレンジ8を作成し 、胆汁酸に対する感度を変更する突然変異を含む（NucleoBAS N354K / I372V）が作成されました。センサが既に飽和しているかどうかを定義するために、シトリン/セルリアン比は、これらの細胞を低細胞内の胆汁酸レベルを有すると仮定されるので、任意の胆汁酸トランスポーターを発現しない対照細胞における比と比較することができます。あるいは、蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）の測定は、強度に依存しない方法12にFRETを調査するために行うことができます。この技術は、本論文の範囲を超えて、さらに特殊な装置を必要とします。鈍感センサーの他の理由は、自己蛍光および/またはNucleoBASに発現を失った細胞の使用を含みます。注目すべきは、実験中（例えばによる焦点シフトする）紺碧とシトリンの強度の変動は一方で、撮影時のFRET変化の直接的な可視化を曖昧にすることができますセンサのレシオメトリック性質はまだ胆汁酸動態のモニタリングを可能にします。比率の増加は明らかであるが、多くの場合、絶対強度の変化は、FXRリガンドの添加の際に個々のフルオロフォアのために控えめです。 BASセンサーでトランスフェクトした細胞におけるFRET分析のために、適切なレーザー光とフィルタが選択されるべきです。 FRETの間シトリン強度の増加は、450から520（紺碧）および520から580（シトリン）にわたって監視排出量紫色ダイオード（405 nm）のレーザーを用いて測定する必要があります。考慮すべき重要な側面は、光退色に対するセンサの感度です。一方または両方のフルオロフォアの強度は徐々に配位子を添加しない時に低下するとき、それは、多くの場合、光退色を示しています。レーザパワーが高すぎる場合、この現象は、主に発生します。この望ましくない効果を回避するために、レーザパワーは、フルパワーの5％を超えないように、細胞は可能な限り暗所に保存しなければなりません。制限右のセルを検索するための時間。蛍光強度の変動も、z軸における焦点ずれによって引き起こされ得ます。これに対抗するために、ピンホールのサイズを大きくすることができ、セル境界に非常に近接していない関心領域を描画することが望ましいです。 胆汁酸のためのFRETセンサーは、トランスフェクトし、安定した表現型を有することができ、複数の細胞型（U2OS、Huh7細胞、HepG2細胞、H69、MDCKおよびHEK293T細胞）で試験されています。しかしながら、そのような肝細胞などの一次および分化した細胞は、トランスフェクトすると、特性的に安定維持することが困難です。ウイルス形質導入は困難なトランスフェクト細胞（リクエストに応じてご利用いただけ構築）を支援することができます。我々は現在、急速に分離すると脱分化新たに単離された一次細胞におけるセンサの使用を可能にするために、マウスのラインを生成しています。 記載の共焦点実験を行うためには、選択された細胞株が培養皿に付着していることが不可欠であり、Si中の成長しますngle細胞層。しかし、むしろ容易にトリプシン処理することができ、懸濁液中で増殖する細胞、または付着細胞は、また、FACSを用いて測定することができます。最後に、特定の輸送経路を分析する際に、内因性胆汁酸輸送または合成することなく細胞株を選択することをお勧めします。 すなわち 、特定のトランスフェクトされた（変異型）トランスポータータンパク質の活性を測定する場合。 提示遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーBASは、単一の生細胞の胆汁酸輸送を監視するための貴重なツールです。 BASは、胆汁酸の細胞内8ダイナミクスのイメージングを可能にする、胆汁酸の多種多様によって活性化されるFXR-LBDが含まれています。これは、他の技術の使用に関連して大きな利点を与えます。例えば、プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ルシフェラーゼシグナルは、細胞内の情報をサポートしていない、細胞内のレポーターの安定性に依存しており、サンプルの破壊を必要とします<s&gt; 13アップ。胆汁酸輸送を測定するための別のアプローチは、蛍光標識または放射性標識リガンドの使用です。しかし、胆汁酸の蛍光標識は、胆汁酸輸送速度を変えることができ、放射性標識された胆汁酸の利用可能性は限られています。さらに、胆汁酸トランスポーターの発現とセンサを組み合わせて、特定の胆汁酸の細胞の流入と流出に対処することができます。 TCDCAは、輸送活性についての洞察を提供するように例えば、抱合胆汁酸の細胞内レベルを増加させました。これはまた、分子または化合物阻害剤のスクリーニングを使用して、または他のFXRリガンドの効果を調べることによって、例えば、特定の経路との干渉後の胆汁酸輸送に及ぼす影響を調べるためにBASを使用することができます。最後に、センサの別の適用は、原形質膜輸送体の発現およびFXR活性化の例イメージングのために、定量分析またはタンパク質の局在化のために他の蛍光タンパク質と組み合わせされ同じ細胞中に存在します。

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、高い時間および空間分解能1と生細胞中の細胞機能のより良い理解を得るために使用されます。 FRETは、励起されたドナーフルオロフォアからのエネルギーは、アクセプターフルオロフォアへ転送されます。 FRETの効率は、ドナーとアクセプターフルオロフォアとその方向との間の距離に強く依存するため、2つの蛍光体に影響を与えるコンフォメーション変化の敏感な読み出しです。この現象は、小分子のイメージングのためのFRETベースのバイオセンサーを生成するために利用されます。それらの濃度の変化は、ドナーフルオロフォア2対アクセプターの発光強度の比の増加/減少するように監視することができます。例えば、FRETベースのカルシウムのバイオセンサーは細胞3生き内遊離カルシウム濃度の迅速かつ安定した検出を可能にします。 FRETベースのバイオセンサの他の利点は、単一の生細胞内で撮像され、T相続人の非侵襲性は、それらの能力が異なる細胞型および細胞区画4を標的とします。 細胞内の胆汁酸動態の多くの側面は、まだよく理解されていません。例えば、少しは、共役および非抱合型胆汁酸輸送の規制の根底にあるメカニズムについて知られています。既存の技術は、この輸送は、主に、ルシフェラーゼベースのレポーター、放射性標識胆汁酸、または蛍光胆汁酸類似体を利用する監視します。後者は、おそらくそれらの特性に影響を与え、胆汁酸の修飾を必要とします。ルシフェラーゼベースのレポーターは悪い時間分解能を持っています。また、これらの技術は、サンプルの損失をもたらし、単一細胞でのイメージングには適用されません。したがって、それはレシオメトリック検出5,6の利点を備えているので、特に、FRETバイオセンサーを使用して、輸送活性の生きた単一細胞イメージングを可能にする方法を使用することが有益であろう。一方、CFの変種P / YFPのフォームは、最も頻繁に、FRETペアを使用し、自己会合を誘発する変異を有するmOrangeとmCherryをを使用して、新しい戦略がレッドシフト胆汁酸センサー7を含む小説センサー、とのFRETツールボックスの拡大につながっています。 我々は以前ファルネソイドX受容体（FXR）のリガンド結合ドメインと融合されるドナーフルオロフォア（セルリアン）とアクセプターフルオロフォア（シトリン）で構成され、遺伝的にコードされたFRET胆汁酸センサー（BAS）を、作成した（FXR-LBD）そして、LXXLLモチーフ8を含むペプチド 。胆汁酸依存的にFXR-LBDとこのペプチドの仲間。 FXRの活性化の際に、シトリンと紺碧の間の距離は、立体構造の変化に起因する変更されます。哺乳動物細胞株における、FXR活性化の結果シトリン/セルリアン比で明らかに検出可能な増加で、精製されたセンサーは、反対方向に動作し、FXRの活性化の際に減少FRET比をもたらしました。このセンサー（CytoBAS）細胞質の胆汁酸動態のモニタリングを可能にします。細胞内ターゲティングモチーフのカルボキシル末端付加することで、BASの構築物は、異なる細胞区画における胆汁酸濃度の測定が可能、核（NucleoBAS）およびペルオキシソーム（PeroxiBAS）を標的とすることができます。ペルオキシソーム標的モチーフの添加は胆汁酸への応答性を損なうものではないが、細胞透過性FXRリガンドは、ペルオキシソーム8内 PeroxiBASの任意のFRETの変化を誘導しませんでした。この矛盾の性質は不明であるため、プロトコルは以下CytoBASとNucleoBASに焦点を当てています。 この遺伝的にコードされたFRETセンサーの使用は、最近、肝胆汁酸輸送体+ /タウロコール酸共輸送ポリペプチド（NTCP）Naおよび有機溶質輸送体アルファ/ベータ（OSTαβ）を8含む細胞で実証されました。 NTCPは、主要な肝胆汁酸輸入国であるとOSTαβは基底外側の腸胆汁です電気化学的な胆汁酸濃度勾配9、10に依存輸入および輸出の両方として機能することができる酸トランスポーター。最近のデータは、NTCP、および/またはOSTαβによる胆汁酸輸送の際に、リガンド - FXR-LBD相互作用の結果として、FRET比の堅牢かつ高速応答を観察することができることを示しました。 ここで、我々は、そのような共焦点顕微鏡分析および蛍光セルソーター（FACS）などのFRETを測定する方法のための詳細なプロトコルを記述する重要なステップを強調表示し、潜在的な問題に対処し、別の方法を説明します。この遺伝的にコードされたFRETセンサーを使用して、FXR-LBDと胆汁酸との相互作用を定量化し、生細胞内で直接監視し、リアルタイムでの胆汁酸の輸送および動態を可視化する迅速かつ簡単な方法を提供することができます。 CytoBASとNucleoBASをコードする哺乳動物発現プラスミドは、市販されています。したがって、このバイオセンサーは、さらにに貢献することができます胆汁酸輸送体またはFXRを活性化し、胆汁酸の生物学およびシグナル伝達をより深く洞察を提供する化合物の理解。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CytoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:145px;">62860</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right">62861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Dulbecco&#39;s modified Eagles media (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td>High glucose without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (pen/strep)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">102-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-25 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0253</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-175 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0238</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">6-well plate</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">734-0229</td>
			<td>Poly-L-lysine and Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">10cm dish</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0243</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Polyethylenimine (PEI)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Brunschwig</td>
			<td style="width:145px;">23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">G418 (geneticin) 50 mg/ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10131-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Hygromycin B, 50 mg / ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Cloning cylinder (6x8 mm)</td>
			<td style="width:173px;">Bellco</td>
			<td style="width:145px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-15 Leibovitz culture medium</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">21083-027</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:300px;">Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td style="width:145px;">352008</td>
			<td>No cap, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Falcon 2063 tubes (5 ml)</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td align="right" style="width:145px;">352063</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Nunc Lab-Tek 8 well coverglass</td>
			<td style="width:173px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:145px;">155409</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Charcoal-filtered FBS</td>
			<td style="width:173px;">Life technologies</td>
			<td style="width:145px;">12676011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">GW4064</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G5172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">TCDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T6260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">C9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Other chemicals</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">n.v.t.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time monitoring of intracellular bile acid dynamics using a genetically encoded fret-based bile acid sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

提示FRET-BASセンサはFXRのリガンド結合ドメイン（LBD-FXR）2つのフルオロフォアシトリンと紺碧に取り付けられている）とLXXLLモチーフに基づいています。このセンサは、高い空間分解能と時間分解能（ 図 1 A）と生細胞内で胆汁酸輸送の調査を可能にします。セルリアンとシトリンの変異は分子内複合体（ 図 1 B）の形成を促進するために適用しました。胆汁酸および他のFXRリガンドは、FXRに結合し、それによりコンホメーション変化によってシトリンと紺碧の間の距離を変化させます。哺乳動物生細胞では、これは、増加したFRET効率（シトリン増加、セルリアン減少）（ 図 1 C 1 D）が得られます。共焦点顕微鏡を用いて生細胞の定量的強度に基づくFRET実験の間に、私tは平均シトリン/セルリアン比はGW4064（5μM）（ 図での処理後に著しく増加したタウロケノデオキシコール酸（TCDCA）は、FRETの変更を示していない胆汁酸トランスポーターを欠くNucleoBASを表す（30μM）U2OS細胞を処置されたことが観察されました1 C）。これとは対照的に、U2OS細胞を共発現NucleoBAS、NTCPとOSTαβはTCDCAを添加するとシトリン/セルリアン比の明らかな増加、及びGW4064の追加（ 図 1 D）後の比でさらに大きな増加を示しました。これは、TCDCAが細胞膜を通過することができず、細胞に入るために、特定の輸送体を必要とすることを示しています。 センサーの細胞局在は、特定の局在化シグナルの存在によって決定されます。 NucleoBASは、核局在化シグナル（ 図 &lt;によって核に標的化されますCytoBASは任意の局在化シグナルを含んでいるので、サイトゾル（ 図 2 A）に残っていませんが、強い&gt; 2 B）。バイオセンサーは、同じ細胞におけるタンパク質の発現/局在化およびFXR活性の測定を可能にする、他の蛍光タンパク質の画像化と組み合わせることができます。例えば、 図 2 のCは、U2OS細胞はNucleoBASとNTCP-mKate2で同時トランスフェクトを示しています。さらに、センサは、同時に複数のパラメータの細胞内イメージングのために他のセンサーと組み合わせることができます。例えば、NucleoBASはTGR5（ESTクローンIMAGE番号5221127）、同時に同じセル内TGR5とFXRの活性化を測定するためのcAMPの細胞質ゾルセンサー（TのEpac VV）11と一緒に発現させました。核におけるFXR活性化は可視であったTGR5に結合すると、cAMPレベルは、cAMPのセンサーによって検出された細胞質ゾルに増加しました同時にualized。 図 2D-F &#160; GW4064（5μM）（ 図 2 D）で処理した後NucleoBAS-TGR5- TのEpac VV細胞の6共焦点画像で構成される時系列を示し、TCDCA（10μM）（ 図 2 E）を伴うまたはケノデオキシコール酸（CDCA） （10μM）（ 図 2 F）= 0緑色のに比べて、放射率（FXR活性）の増加を表す450分の525 nmの放射率が低下する領域（cAMPの上昇を表す）とピンク色を表し、tの実験開始時の比。 また、フローサイトメトリー単一細胞レベルまたは集団全体での高スループットスクリーニングにおける細胞のプールをスクリーニングすることができます。 NucleoBASを発現しているU2OS細胞はexcitました紫405 nmのレーザーと蛍光とEDがシトリンのためのセルリアンと20分の525レンジの40分の450の範囲で収集しました。 FACSベースのFRET実験の効率を向上させるために、適切なゲート（図3）に設定されなければなりません。 P1のゲートは、細胞の破片を除外し、P2のゲートは、分析からデュプレットを削除します。次に、分析は（488レーザーで励起）と紺碧（405レーザーで励起）最後にゲート3により陽性細胞シトリンに制限され、ゲートP4は高シトリン/セルリアン発光比を有する細胞の割合を表す（紺碧の励起を使用して、 405nmのレーザー）を持ちます。各サンプルについて、ゲート3に減少した少なくとも10,000個の細胞を測定しました。 その後、FACSベースのFRETのフローサイトメトリーは、TCDCA及びGW4064での30分間のインキュベーション後に、生細胞におけるFRETの増加を計算しました。 NucleoBASを発現する非処理されたU2OS細胞は、ゲートP4の&lt;5％の細胞（シトリン/ Cを示しましたerulean-high細胞）。任意の胆汁酸輸送体の非存在下では、同様の割合は、30μMTCDCA処理した細胞（ 図 4 A）で観察されました。これとは対照的に、細胞を共発現NucleoBAS、NTCPとOSTαβは約38％のシトリン/セルリアン-high細胞の量の増加を示しました。 10μMのGW4064を加えた後、細胞のほぼ90％がOSTαβやNTCP（ 図 4 B）の発現のシトリン/セルリアン高にかかわらずでした。データは棒グラフ（ゲート4％の細胞集団4）（ 図 4 C、D）またはシトリン、セルリアン比（ 図 4 E、F）の集団のヒストグラムとして提示することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig1.jpg" /> F胆汁酸センサー（BAS）の igure 1. デザイン。（A）遺伝的にコードされた胆汁酸センサーの作用様式の構造表現。これは、ドナーフルオロフォア（セルリアン）とアクセプターフルオロフォア（シトリン）FXR-LBDを介して連結されたとFXR補因子ペプチド（LXXLLモチーフ）に融合した構成されています。 （B）BASの概略ドメインアーキテクチャ。 Q204F / V224Lの蛍光体変異はセルリアンとシトリンの間に分子内相互作用の形成を促進します。 CytoBAS構築物は任意のターゲティング配列を欠いているので、サイトゾル局在化を示し、一方NucleoBAS構築物は、C末端核局在化シグナル（NLS）を含有し、したがって、核内に蓄積します。 （C）抱合胆汁酸輸送を監視するためのツールとして、BASと代表共焦点ベースのFRET実験。シトリン/セルリアン比の変化は細胞内で、30μMのTCDCAの添加のみEXP後に観察されませんressing NucleoBAS。 5μMGW4064を添加した場合、大幅に増加シトリン/セルリアン比が観察されました。 TCDCAの（D）輸入（30μM）NTCPとOSTαβ同時トランスフェクト細胞では、センサのかなりの活性化を引き起こします。その後のGW4064（5μM）治療はシトリン/セルリアン比のさらなる増加につながります。結果は平均±SDとして表され、N = 6個々の細胞である。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig2.jpg" /> 図 2。ローカライゼーションFRET-BAS生細胞において構築物。CytoBAS（A）またはNucleoBAS（B）をトランスフェクトしたU2OS細胞の共焦点顕微鏡像。 （C）U2OS細胞共同TRANNucleoBASとNTCP-mKate2で​​sfected。スケールバーは10μmで表しています。 （D - F）NucleoBAS-TGR5- T EPAC VVトランスフェクトされた細胞の時系列。 （D）GW4064は、FXRを活性化させるには、TGR5（450分の525 nmの比率を増加させた）、ではありません。 （E）TCDCAは（450分の525 nmの比の減少）、原形質膜にTGR5を活性化するが、核内でFXRを活性化するために細胞に侵入することができません。 （F）CDCAは、核内に、原形質膜上のTGR5と同様にFXRを活性化する（細胞質では減少、核内で450分の525 nmの比率を増加させた）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig3.jpg" /> 図 3。ゲーティングparameteフローサイトメトリーRS。（A）SSC-A / FSC-ウィンドウでP 1のゲートは、死細胞を排除するために使用されます。 FSC-H / FSC-ウィンドウ（B）は 、P2のゲートは分析からダブレット事象を排除するために描かれています。 （C）シトリン（20分の525 nm）の/セルリアン（40分の450 nm）の窓、NucleoBAS（およびCytoBAS）で陽性細胞が（ゲートP3）が選択されています。 （D）最後に、シトリン中（20分の525 nm）で/セルリアン（40分の450 nm）の窓、P4のゲートは、FACS実験のシトリン/セルリアン-high細胞が含まれています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig4.jpg" /> 図 4。 NucleoBASを使用して、胆汁酸輸送を測定する代表的FACS実験。（ </strong<html>シトリン/セルリアン-高い生活NucleoBAS発現U2OS細胞（A）およびU2OS細胞制御バッファ（左）、30μMで処理した後NucleoBAS、OSTαβとNTCP（B）を共発現量を示す&gt;、B）のFACSプロットTCDCA（中央）または10μMGW4064（右）。 NucleoBAS及び（D）または（C）OSTαβおよびNTCPなしに同時トランスフェクションを発現するU2OS細胞におけるTCDCAまたはGW4064での30分間のインキュベーション後シトリン/セルリアン高細胞の割合を示した（C、D）バーグラフ。 （E、F）TCDCA（黄色）との30分間のインキュベーション後OSTαβおよびNTCPの有無にかかわらずNucleoBASを発現しているU2OS細胞、GW4064（赤）または対照緩衝液（青）の集団においてシトリン/セルリアン比の分布を示すヒストグラム。すべての条件を3回測定しました。バーは平均値+標準偏差（SD）を表す（N = 3）。ttps：//www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 補足ファイル1： テンプレートのBAS一般的 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_1._template_BAS_general.xls" target="_blank">にこのファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ファイル2：テンプレート BASツァイスライカは、データをインポートしました。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_2._template_BAS_Zeiss_Leica_imported_data.xls" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor at JoVE.com

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

real-time-monitoring-intracellular-bile-acid-dynamics-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K ビュー.  Academic Medical Center. We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types. 

ビデオ: Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

多重経皮電気化学センシングのための中空マイクロニードルベースの​​センサ

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

生物工学

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

高強度のリアルタイムモニタリングの超音波（HIFU）アブレーションを重視しました<em&gt;インビトロ</em集束超音波のための調和運動イメージングの使用&gt;犬の肝臓（HMIFU）

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与<em&gt; ex vivoで</em&gt;生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...