We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

dichiarazione etica: Tutte le procedure sperimentali erano in conformità con la direttiva UE sulla uso di animali nella ricerca e sono stati approvati dalla cura degli animali locali e del Comitato Usa (Regierungspräsidium Tuebingen, stato di Baden-Württemberg, Germania) responsabile per l&#39;Università di Tubinga. 1. procedura di iniezione stereotassica <ol><li> Preparare strumenti sterili (forbici, bisturi, pinze, trapano, aghi, materiale di sutura) utilizzando uno sterilizzatore. Disporre strumenti sterili e altre soluzioni necessarie e le forniture di chirurgia quali swap sterili di cotone, disinfettante, sterile tampone fosfato (PBS, pH 7,4), e H 2 O 2 su un telo chirurgico sterile. </li><li> Tirare micropipette di vetro per iniezioni (Figura 1A, inserto) con 3 mm di larghezza scatola filamento su un microelettrodo orizzontale estrattore secondo le istruzioni del produttore. Nota: Per le iniezioni in profondità, il cono elettrodo dovrebbe essere sufficientementelungo per raggiungere le ventrali maggior parte delle coordinate (circa 5 mm. per le coordinate, vedi 1.10). </li><li> Premix 1 ml di soluzione di virus e 0,2 ml di 0,1% soluzione verde veloce in PBS sterile (per una migliore visibilità della soluzione nel pipetta di vetro). Riempire pipette di vetro con la miscela di soluzione di virus e verde veloce con una pipetta microlitro con una punta fine (Figura 1A, nel riquadro). Nota: Lavorare con ricombinanti vettori virali adeno-associati (rAAV) è considerato livello di biosicurezza 1 (BSL 1) il lavoro e deve essere eseguita in un BSL 1 laboratorio. rAAVs utilizzati in questo studio (Figura 1C) sono stati: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sierotipo 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (sierotipo 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1A-DIOhChR2 (H134R) -YFP (sierotipo 2/1) 23 </li><li> Anestetizzare un mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia (isoflurano: 3% di ossigeno per l&#39;induzione). Nota: I topi utilizzati in questo studio sono stati 4 -7 settimane di vita e dei seguenti ceppi e genotipi: C57Bl6 / J wild type (esperimento nelle figure 2A e 3A-D); GAD67-GFP 24 (esperimento nelle figure 2B e 3E-H); TAC2-Cre 25 (esperimento nelle figure 2C e 3I-J). </li><li> Radersi la testa tra le orecchie e gli occhi. Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) per la testa rasata utilizzando tamponi di cotone. </li><li> Applicare una pomata oculare per evitare l&#39;essiccazione degli occhi durante l&#39;anestesia. Sottocutanea iniettare mouse con analgesici (0,1 ml di 5 mg / soluzione meloxicam basata ml). </li><li> Posizionare il mouse nel frame stereotassico (Figura 1A) e mantenere l&#39;anestesia tramite una maschera di anestesia del gas (isoflurano: 2% di ossigeno per la manutenzione). Controllare la profondità dell&#39;anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare. Nota: Mantenere condizioni sterili, nonché possibile durante tutta la procedura chirurgica; indossare maschera usa e getta, Go chirurgicawn, e guanti. </li><li> Fare incisione cutanea sulla parte superiore della testa con le forbici. Tirare delicatamente la pelle a lato con pinze smussato, fissare con fascette per esporre superficie del cranio, e cranio pulito con H 2 O 2. </li><li> Siti di iniezione segno sul cranio con una multa fori marcatori e trapano permanenti di punta per entrambi gli emisferi (Figura 1B). Coordinate per iniezioni in questo studio sono (da Bregma (mm)): mPFC: anteriore 1.9, laterale ± 0.3, 2.1 ventrale; MGM / PIN: posteriore 3.0, laterale ± 1.8, 3.8 ventrale; mpITC / BLA: posteriore 1.45, laterale ± 3,35 e 4,75 ventrale. </li><li> Montare pipetta di vetro riempito sul telaio stereotassico collegato ad un dispositivo di iniezione a pressione e portare la pipetta in posizione Bregma. </li><li> Rompere la punta della pipetta di vetro con pinza sottile diritto-punta. Fate questo delicatamente per evitare la generazione di aerosol di soluzione virus. Assicurarsi che la punta della pipetta è aperto mediante l&#39;applicazione di un paio di impulsi di pressione e osservando estrusione di gocce di Virusoluzione s. </li><li> Vai alle coordinate iniezione desiderati e iniettare la metà del contenuto della pipetta (~ 0,5 ml) utilizzando le seguenti impostazioni del dispositivo di iniezione a pressione: Pressione: 20 psi, durata media di impulso: 30 ms, numero medio di impulsi: 50. </li><li> Lasciare pipetta in posizione per ~ 1 min prima lentamente (1 mm / min) richiamo della medesima. Nota: Assicurarsi che la pipetta non sia bloccato prima di ripetere procedura con lo stesso pipetta sulla emisfero. In caso di punta bloccato, pulire o rompere punta e la posizione della pipetta zero Bregma di nuovo. </li><li> Pulire cranio con PBS (pH 7,4), rimuovere i morsetti, tirare delicatamente la pelle insieme, e suturare l&#39;incisione con sutura singolo pulsante (3 - 4 nodi). Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) intorno alla ferita. </li><li> Arrestare il anestesia e non lasciare incustodita del mouse fino a quando è completamente sveglio. Mantenere singola alloggiati o tornare alla compagnia di altri animali solo se pienamente recuperato. Dopo l&#39;intervento, continuerà a monitorare lo stato di salute, e amminiter analgesico se necessario. Seguire le procedure in base alle leggi formulate dal Comitato di cura degli animali e uso locale. </li></ol> 2. Preparazione di acuta fette <ol><li> Preparare ACSF, soluzione di taglio, strumenti (forbici, bisturi, pinze, spatola, pipetta Pasteur), e blocca agar. Nota: 1 L di artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) è richiesto per ogni esperimento, e viene preparata sciogliendo sostanze chimiche nel doppio distillata H 2 O come precedentemente pubblicato con il 16,23. Soluzione di taglio viene preparata completandola 200 ml di ACSF con 0,87 ml di 2 M MgSO 4 soluzione madre. </li><li> ACSF Ossigenare e soluzione di taglio durante l&#39;esperimento con 95% O 2 e 5% CO 2. </li><li> Profondamente anestetizzare mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia con isoflurano (3% di ossigeno). Controllare la profondità dell&#39;anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare. </li><li> Decapitare mouse usando forbici grandi e subito rilassarsitesta in soluzione di taglio ghiacciata. </li><li> Aprire il cranio da una singola incisione mediana da caudale a rostrale e spingere delicatamente pezzi di cranio ai lati con pinze. Rapidamente rimuovere cervello sollevando delicatamente fuori cranio con una piccola spatola arrotondata. Tagliare il cervelletto con bisturi. Mettere cervello in soluzione di taglio ghiacciata. </li><li> Per i siti di iniezione mPFC: tagliare parte anteriore del cervello (contenente mPFC) con un bisturi e mettere in soluzione di taglio ghiacciata fino affettare. </li><li> Rimuovere soluzione di taglio in eccesso con carta da filtro e incollare la parte posteriore del cervello sul palco vibratome. </li><li> Per fette amigdala inclinati, incollare il cervello su un taglio di blocco di agar (4%) con un angolo di 35 ° (Figura 1D, al centro). Per fette amigdala coronali, siti di iniezione MGM / PIN e siti di iniezione mPFC, incollare il cervello direttamente sul palco (Figura 1D, a destra ea sinistra). Posizionare un blocco di agar aggiuntivo dietro cervello per la stabilità, mentre affettare. </li><li> Place fase in camera di taglio con soluzione di taglio ossigenato ghiacciata che viene mantenuta a 4 ° C utilizzando un gruppo di raffreddamento. Preparare fette acuta dell&#39;amigdala (320 micron) con una lama zaffiro. Mettere le fette in una camera di interfaccia fornito con ACSF ossigenato a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la preparazione di fette amigdala acute, posizionare la camera di interfaccia a bagnomaria a 36 ° C per recuperare fette per 35 - 45 min. Successivamente, riportare la camera di interfaccia per RT. Per la registrazione da queste fette, procedere con passo 3.2. </li><li> Durante l&#39;inizio della fase di 2.10, tagliare delle fette dei siti di iniezione, come descritto in precedenza per le fette amigdala acute (passi 2,8-2,9). Il recupero di fette nel bagnomaria non è necessario qui. Facoltativo: per stimare rapidamente posizione del sito di iniezione, osservare le fette su uno stereoscopio dotato di una lampada fluorescente e appositi set di filtri. </li><li> Fissare fette contenenti siti di iniezione per l&#39;analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e submerli ging in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS soluzione O / N. Per l&#39;analisi dei siti di iniezione procedere con passo 4.1. </li></ol> 3. Visualizzazione e stimolazione delle fibre Presinaptico <ol><li> Preparare microscopio di patch per l&#39;attivazione optogenetic di fibre e cellule: <ol><li> Centrare il diodo montato emissione luminosa (LED) sul percorso di consegna luce. </li><li> Misurare l&#39;intensità della luce LED in corrispondenza del piano focale posteriore e all&#39;uscita di ciascun obiettivo con un misuratore di potenza scelta opportuna lunghezza d&#39;onda di 470 nm. </li><li> Calcolare l&#39;intensità della luce in mW / mm 2 e creare una curva di calibrazione (intensità del LED (%) rispetto emissione luminosa (mW / mm 2)) per ciascun obiettivo per valori misurati per 470 nm. </li></ol></li><li> Recuperare una fetta dell&#39;amigdala acuta dalla camera dell&#39;interfaccia e posto nella camera fetta montato sul microscopio verticale dotato di una lampada fluorescente. Fare attenzione a posizionare la fetta in modo tale che il SLICe superficie rivolta verso l&#39;alto nella camera di interfaccia è anche rivolto verso l&#39;alto nella camera di registrazione. Profumato fetta fresca, ASCF ossigenata ad una velocità di 1 - 2 ml / min ad una temperatura di ~ 31 ° C. </li><li> Osservare fibre presinaptiche nella fetta utilizzando la lampada fluorescente in combinazione con appositi set di filtri per la proteina fluorescente specifica espresso. Utilizzare obiettivo 5x per ottenere una visione d&#39;insieme (Figura 1E), e 60x oggettiva per la valutazione della densità delle fibre all&#39;interno della zona di destinazione. Nota: Per GFP e YFP, utilizzare il filtro impostato &quot;verde&quot; (eccitazione 472/20, divisore di fascio 495, Emissione 490 LP) per mCherry utilizzare il filtro impostato &quot;rosso&quot; (eccitazione 560/40, divisore di fascio 585, Emissione 630/70), come specificato nella tabella materiali / attrezzature. </li><li> Aprire o limitare l&#39;apertura nel percorso ottico del microscopio come desiderato per l&#39;esperimento (Figura 2D). </li><li> Per ottenere una registrazione patch, riempire una pipetta di patch con una soluzione interna e montare iportaelettrodo n. Applicare una pressione positiva alla pipetta di patch e abbassare lentamente in primo luogo nella soluzione bagno e poi sotto il controllo visivo nella fetta utilizzando il micromanipolatore. <ol><li> Avvicinatevi al neurone di interessi con la pipetta di patch di lato e in alto. Rilasciare pressione positiva quando la pipetta è sulla superficie della cellula (fossetta visibile sulla superficie cellulare) ed ottenere un &quot;gigaseal&quot; applicando pressione negativa. </li><li> Applicare in seguito alla rottura di aspirazione la patch di membrana per ottenere la registrazione a cellula intera. Successivamente, stimolare fibre marcate con LED collegato utilizzando la lunghezza d&#39;onda appropriata per attivare ChR (470 nm) durante la registrazione risposte elettriche dalla cella. </li><li> Per la stimolazione sinaptica iniziare con una bassa intensità LED e aumentare fino a raggiungere la ampiezza della corrente sinaptica desiderato. TRIGGER il LED configurando uscite digitali nel software di acquisizione dei dati di controllare i tempi e il polso lunghezza (esempi della Figura3). Nota: altri software e / o TTL che generano i dispositivi possono essere utilizzati per attivare LED. </li></ol></li><li> Ripetere stimolazione con diaframma aperto o ristretto (passo 3.4) nel percorso ottico del microscopio come desiderato per la cella successiva registrati e / o in presenza di farmaci specifici. </li><li> Dopo la registrazione, correggere le fette per l&#39;analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e sommergendo nel 4% PFA O / N. </li><li> Analizzare i dati elettrofisiologici. Nota: Usare un software adatto per la visualizzazione dei dati spazzata registrati per ogni singola linea di stimolazione. Quando si analizzano gli effetti delle droghe, utilizzare routine di rilevamento di picco per ottenere andamento nel tempo degli effetti della droga su ampiezze delle correnti sinaptiche per tutti i singoli spazza. Determinare quando l&#39;effetto della droga raggiunge lo stato stazionario. Per preparare le risposte medi rappresentativi per le figure, utilizzare il software per la media ≥10 singoli spazza ogni condizione sperimentale (cf figura 3B-D, FH, J pannello di destra). Nota: diversi pacchetti software alternativi possono essere utilizzati per l&#39;analisi dei dati. </li></ol> 4. analisi post-hoc dei siti di iniezione <ol><li> Lavare le fette di siti di iniezione (dal punto 2.12) e la registrazione siti (se ri-immagini si desidera, dal punto 3.7) per tre volte in PBS. Questo viene fatto ripetutamente sostituendo soluzione PBS fresco su un agitatore rotante per tre volte per 10 min. </li><li> Preparare soluzione al 2% agar-agar in PBS, e lasciarlo raffreddare a ~ 65 ° C. Mettere le fette appoggiati sul fondo di un piccolo piatto di 30 millimetri di diametro di Petri, incorporare fette in agar-agar e lasciate raffreddare fino solido. </li><li> Incollare un blocco di agar con la fetta o fette incorporato per la fase di un vibratome e mettere in primo piano in camera di taglio con PBS. </li><li> La resezione fette a 70 micron di spessore incorporato. Opzionale: Dopo resezione, fette possono essere colorati, cioè con Neurotrace rivelare citoarchitettura (Figura 3A, C), e / o by colorazione immunofluorescenza per YFP o mCherry per amplificare il segnale proveniente dalla proteina di fusione ChR. </li><li> fette di montaggio su vetrini e vetrino con mezzi di montaggio. Siti di iniezione Immagine e, se desiderato, anche le porzioni di immagine contenenti fibre nelle aree di proiezione usando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a scansione laser (Figura 2A-C). </li></ol>

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	<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse.">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fear+extinction.">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li><li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval.">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li><li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear.">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li><li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices,+ventral+hippocampus,+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear.">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li><li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits.">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li><li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding.">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li><li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala:+implications+for+fear+and+emotional+memory.">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).</li><li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala.">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li><li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory.">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala.">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li><li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin,+parvalbumin,+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse.">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li><li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system.">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit.">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors.">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li><li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine.">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens.">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li><li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule.">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8,+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent.">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li><li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1,+2,+5,+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system.">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li><li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+channelrhodopsin-2+(ChR2)+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex.">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo protocollo descrive un metodo per ex vivo indagini optogenetic dei circuiti neurali e la connettività locale che può essere facilmente implementato sulla maggior parte, se non tutti, in posizione verticale fetta configurazioni di registrazione patch-clamp dotandoli di un ~ 470 LED al porto luce epifluorescenza nm. Uno dei principali vantaggi della stimolazione optogenetic di proiezioni assonale in fette è che permette l&#39;attivazione e ricerca di proprietà di connessioni non accessibili con stimolazione elettrica convenzionale specifico, poiché i tratti di fibre corrispondenti non erano noti, non chiaramente definiti, o meno conservate in una sola fetta cervello. Come esempio relativo tasto per circuiti paura, è illustrato come questo può essere applicato per analizzare le proprietà di input mPFC all&#39;amigdala. Anche nei casi in cui la stimolazione del tratto di fibra elettrica è stato ampiamente utilizzato in studi precedenti, questi tratti spesso portano le fibre provenienti da diverse regioni d&#39;origine. Ad esempio, nei circuiti collegati temere apprendimento, proiezioni da diversi nuclei talamici o regioni corticali sensoriali corrono mescolati tra gli capsula interna ed esterna, rispettivamente. Il vantaggio della stimolazione optogenetic è che permette l&#39;attivazione selettiva di un sottoinsieme di fibre provenienti da una regione definita. Questo è illustrato per gli ingressi del talamo specifici da PIN e MGM alle cellule intercalate e le cellule principali amigdala laterale. Inoltre, i problemi derivanti con stimolazione elettrica, cioè, l&#39;attivazione di altre fibre di passaggio o cellule in prossimità dell&#39;elettrodo stimolante, che possono rendere le connessioni locali nella zona di destinazione possono essere superati. Tuttavia, mentre la stimolazione optogenetic è altrettanto rapida di stimolazione elettrica, ci possono essere limitazioni per quanto riguarda la frequenza di stimolazione che può essere applicata in modo attendibile. Questo dipende inattivazione e deinactivation cinetiche e della variante di ChR che viene utilizzato, 4 nonché expression livelli e metodi, e metodi di stimolazione luminosa 26. Quando si utilizza un LED montato alla porta fluorescenza per stimolazione luminosa, tipicamente l&#39;intero campo di vista di un dato obiettivo è illuminato, con conseguente attivazione di tutte le fibre o le celle nel campo e all&#39;interno di una certa profondità. Questo può solo parzialmente essere limitato a una regione più piccola o un insieme di cellule marcate (in questo esempio, il mpITC) utilizzando un&#39;apertura nel percorso luce fluorescente 23,27. Con LED, potere della luce non è un problema, come i LED blu ad alta potenza sono ora disponibili da molti produttori. Tuttavia, gli spettri di emissione hanno valori massimi mezzo a tutta larghezza di diverse decine di nanometri. Pertanto, i LED pongono limitazioni quando uno stimolo spazialmente precisi per la mappatura subcellulare di connettività e / o la stimolazione monocromatica sono desiderati. Entrambi possono essere migliorata utilizzando laser blu come sorgenti luminose, di solito in combinazione con configurazioni più sofisticate che consentono di catramegeting e / o la scansione del fascio in piccole aree e profondità dei tessuti definiti (ad esempio, vedere 28). Con l&#39;ex vivo approccio optogenetic qui descritto, diverse proprietà di trasmissione sinaptica possono essere studiati. Per valutare monosynapticity della componente primi sinaptica risposta, un&#39;analisi approfondita delle latenze e la loro jitter, così come risposta di ampiezza varianza deve essere utilizzato su un campione rappresentativo di neuroni registrati (ad esempio, vedere 16,17,23). Nei casi in cui l&#39;attivazione di attività di rete può svolgere un ruolo, il metodo di scelta è per isolare il componente monosinaptico diretta mediante l&#39;applicazione combinata di tetrodotossina (TTX) per bloccare potenziali d&#39;azione in combinazione con il K + antagonista 4-aminopiridina (4- AP) per prevenire ripolarizzazione 14,28,29. I recettori che mediano componenti mono e disynaptic di ingressi possono essere identificati utilizzando bloccanti farmacologici. Furthermore, è possibile studiare aspetti della modulazione presinaptica di ingressi optogenetically attivati ​​nell&#39;amigdala 23,30. Un potenziale avvertimento è che ChR2 abbia qualche permeabilità calcio 1,4 e la sua attivazione in fibre presinaptici e terminali è stato suggerito di alterare probabilità di rilascio da vari meccanismi 26,31. Tuttavia, diversi studi, tra cui esempi mostrati espressione ChR2 qui impiegato con successo per identificare input-e indirizzare le differenze specifiche per cellulari in rapporti abbinato impulsi nell&#39;amigdala e in altre aree del cervello 16,23,26,32 e la modulazione inoltre dimostrato di probabilità di rilascio per attivazione di vie di segnalazione specifici terminali presinaptici che non è stato preclusi da ChR attivazione 23,30. Un ulteriore supporto deriva da dati in ippocampo e cervelletto, dimostrando che con il metodo di espressione ChR appropriato e tecnica di stimolazione luminosa, aspetti fisiologici, tra cui l&#39;efficacia di rilascio e di fedeltà otrasmissione sinaptica f può essere studiata in modo affidabile 26. Infine, l&#39;attivazione della fibra optogenetic è stato anche utilizzato con successo per applicare protocolli di stimolazione che inducono sinaptica 31,33,34 plasticità. Diversi aspetti sono fondamentali per il successo di questo metodo. Uno è la precisione del targeting stereotassica di vettori virali. Pertanto, è utile per valutare rapidamente posizione del sito di iniezione prima di ottenere registrazioni e quindi eseguire un&#39;analisi più dettagliata post-hoc. Oltre alla precisione spaziale, la vitalità dei neuroni nel sito di iniezione è un fattore determinante per un esperimento di successo e dipende dalla tecnica di iniezione. L&#39;opzione presentato, utilizzando elettrodi in vetro lunghi e sottili-conico, serve a questo scopo ben sia superficiale e aree cerebrali profonde, ma può avere lo svantaggio che la conicità è molto flessibile. Un&#39;alternativa è quella di utilizzare siringhe microlitro specialmente sviluppati per la consegna stereotassica in neuroscienze (neuro-syringes) con aghi più rigide che possono dispensare piccoli volumi. La specificità di colpire ChR-espressione di tipi cellulari definiti e regioni può essere ulteriormente migliorata mediante espressione condizionale 7, per esempio con il Cre sistema come illustrato per le cellule dell&#39;amigdala intercalato. Ciò consente anche l&#39;uso di promotori forti in vettori virali Cre-dipendenti. Un altro aspetto critico è la scelta del vettore virale. Per esprimere ChR, virus ricombinanti adeno-associato (rAAVs) sono stati utilizzati, che hanno il vantaggio di essere un livello di biosicurezza 1 vettori rispetto ad altri sistemi virali popolari. rAAVs sono state utilizzate per qualche tempo e hanno generalmente vettori sicuri e affidabili con buona tropismo neurali e poco o nessun potenziale immunogenico, ma il loro volume di imballaggio è limitato (circa. 4-5 kb) 35. In questi specifici esperimenti, i sierotipi 2/9 e 2/1 sono stati utilizzati per l&#39;espressione ubiquitaria e condizionale, rispettivamente. In accordo con la letteratura, lasierotipi SE trasdurre cellule nella regione di destinazione, ma non sembrano essere ripreso da assoni a retrogrado cellule etichetta, a differenza di sierotipi 2/5 e 2/6 36,37. Tuttavia, gli esperimenti iniziali dovrebbero escludere che ci siano corpi cellulari CHR-etichettati in aree sporgenti al sito di iniezione, che è particolarmente importante quando si studiano le regioni del cervello collegate reciprocamente quali mPFC e l&#39;amigdala. Diversi studi recenti hanno confrontato l&#39;efficacia di sierotipi rAAV in diverse aree cerebrali in ratti e topi 36,38,39. Un tema che emerge è che i sierotipi più recenti (ad esempio, 2/1, 2/8 e 2/9) sono generalmente più efficiente rispetto al 2/2 sierotipo originale. Anche di nota, espressione rAAV-mediata di ChR, a differenza di altri metodi, non ha causato effetti negativi sulla cellule che esprimono o assoni etichettati 40. Il tempo necessario per ottenere espressione attivazione fibra efficace ex vivo sembra dipendere dalla distanza di proiezione studiato. Qui e coerente con la litetura, per l&#39;etichettatura e l&#39;attivazione di collegamenti a lungo raggio nel topo (mPFC e input sensoriali), un tempo espressione di 4 - 8 settimane è necessario, mentre per studiare la connettività locale nell&#39;amigdala, tempi espressione più brevi di 2 - 3 settimane sono sufficienti 14-17,23,30,34. Per la registrazione delle risposte optogenetically-indotte nella zona bersaglio, due fattori sono fondamentali: 1) la fetta cerebrale acuto deve essere di buona qualità e 2) una notevole quantità di fibre marcate vitali richiede di essere conservato. La qualità di fette può essere migliorata usando lame zaffiro affettare. Conservazione degli assoni e quindi, le dimensioni e la stabilità delle risposte luce può essere migliorata tagliando fette ad un certo angolo come illustrato per proiezioni mPFC-amigdala (Figura 1D e 2A) 16,34. Tuttavia, questo dipende fortemente l&#39;orientamento afferents della regione di destinazione e dovrà essere determinata per ciascuna combinazione di proiezione e target regione. A questo proposito, analisi post-hoc di proiezioni della regione bersaglio può essere utile. Per migliorare la rilevazione di fibre e sbiancamento aggirare che possono essersi verificati durante la stimolazione fetta, immunocolorazione contro il tag fluorescenti sulla proteina di fusione ChR può essere impiegato. In generale, questo metodo di mappatura circuito optogenetic recentemente non solo stata applicata a temere circuiti, ma molti altri sistemi nel cervello. In futuro, il targeting di subnuclei e specifici tipi cellulari mediante la combinazione di una serie crescente di linee di topi geneticamente modificati e vettori virali condizionali fornirà una comprensione ancora più dettagliata della diversità funzionali proprietà sinaptiche dei circuiti locali ea lungo termine specifici. Inoltre, immunomarcatura post-hoc di ChR fluorescenti-taggato in connessioni funzionali indagati potrebbe essere combinato con l&#39;analisi ultrastrutturale (vale a dire, con metodi microscopio elettronico) per fornire approfondimenti di mor precisaproprietà morfologiche delle sinapsi in precedenza.

strumenti precisi per la visualizzazione e l&#39;attivazione simultanea di connessioni specifiche tra aree cerebrali e specifici tipi di neuroni stanno diventando sempre più importante per capire le connettività funzionale sottostanti sani stati funzioni cerebrali e malattie. Idealmente, questo comporta indagini fisiologica di precise proprietà sinaptiche con cui i neuroni comunicano identificati. Ciò è particolarmente vero per i collegamenti tra aree cerebrali che non possono essere conservati in una sola fetta cerebrale acuto. In passato, questo è stato ampiamente raggiunto in esperimenti separati. Da un lato, traccianti neurali iniettate in vivo sono stati impiegati in combinazione con conseguente leggero o analisi al microscopio elettronico di partner pre e post-sinaptici. D&#39;altra parte, quando tratti di fibre provenienti dalla regione di origine sono conservati e accessibili nella preparazione fetta, stimolazione elettrica è stato usato per valutare i meccanismi di comunicazione sinaptici con celle nella regione di destinazione. Con l&#39;avvento della optogenetics, l&#39;espressione mirata di cationi canali luce-dipendenti, come Channelrhodopsins (CHRS) fuso con proteine ​​fluorescenti, consente ora di attivazione dei neuroni e loro traiettorie assonale pur consentendo la loro visualizzazione e post-hoc analisi anatomica 1- 4. Perché assoni CHR-esprimono possono essere stimolati anche se isolate dal genitore somata 5, è possibile in fettine di cervello a: 1) valutare ingressi da regioni cerebrali che non erano accessibili con la stimolazione elettrica convenzionale, in quanto tratti di fibre non sono separabili o la traiettoria specifica non è noto; 2) in modo inequivocabile identificare la regione di origine per gli ingressi specifici che sono stati postulate ma non completamente compresi; e 3) studiare la connettività funzionale tra i tipi di cellule definite, sia a livello locale e nelle proiezioni a lungo raggio. A causa di una serie di vantaggi, questa mappatura optogenetic di circuiti in fettine cerebrali è diventato ampiamente utilizzato negli ultimi anni, e una varietà di vettori virali per l&#39;espressione di CHRS fluorescenti-taggato sono prontamente disponibili da fornitori commerciali. Alcuni vantaggi chiave di attivazione optogenetic sopra stimolazione elettrica convenzionale sono danni al tessuto a causa di posizionamento di elettrodi di stimolazione, la specificità della stimolazione fibra, perché la stimolazione elettrica può altresì assumere fibre di passaggio o di altre cellule vicine, e una stimolazione altrettanto rapido e temporalmente precisi. Inoltre, l&#39;iniezione stereotassica di vettori virali può facilmente essere mirati a specifiche aree cerebrali 6 e specifica espressione condizionale o cellula-tipo può essere ottenuto utilizzando l&#39;espressione Cre-dipendente e / o promotori specifici 7. Qui, questa tecnica viene applicata per la mappatura di lungo raggio e circuiti locali nel sistema paura. L&#39;amigdala è una regione chiave per l&#39;acquisizione e l&#39;espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali 8,9 paura e. Oltre from l&#39;amigdala, la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e l&#39;ippocampo (HC), strutture che sono reciprocamente collegati al amigdala, sono implicati in aspetti di acquisizione, il consolidamento e il recupero di paura e di estinzione ricordi 10,11. Attività in suddivisioni del mPFC sembra giocare un doppio ruolo nel controllare sia alta e bassa la paura afferma 12,13. Questo potrebbe in parte essere mediato da collegamenti diretti da mPFC all&#39;amigdala che avrebbe controllato l&#39;attività e l&#39;uscita amigdala. Pertanto, negli ultimi anni, diversi studi hanno iniziato a ex vivo esperimenti fetta di indagare le interazioni sinaptiche tra afferenze mPFC e cellule bersaglio specifici nell&#39;amigdala 14-17. Durante l&#39;apprendimento la paura, le informazioni sensoriali sulla stimoli condizionati e incondizionati raggiunge l&#39;amigdala attraverso proiezioni specifiche regioni del talamo e corticali. Plasticità di questi ingressi ai neuroni nella parte laterale (LA) del Basolamigdala ateral (BLA) è un importante meccanismo alla base condizionamento alla paura 9,18. Una crescente evidenza suggerisce che i processi di plastica paralleli nell&#39;amigdala coinvolgono elementi inibitori per il controllo della memoria timore 19. Un gruppo di neuroni inibitori cluster sono i mediale paracapsular intercalate cellule GABAergici (mpITCs), ma la loro connettività e precisa funzione non è completamente compresa 20-22. Qui, la mappatura del circuito optogenetic viene utilizzato per valutare la connettività afferenti ed efferenti di queste cellule e il loro impatto sui neuroni bersaglio nell&#39;amigdala, dimostrando che mpITCs ricevono input sensoriali direttamente dalle stazioni talamici e corticali relè 23. espressione specifica del CHR mpITCs o neuroni BLA permette la mappatura delle interazioni locali, rivelando che mpITCs inibiscono, ma sono anche reciprocamente attivato, BLA neuroni principali, mettendoli in nuovi circuiti inibitori feed-forward e retroazione che controllano efficacemente l&#39;attività BLA23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td rowspan="2">can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-20938M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-1-20298P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Recordings, light stimulation, and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>internal patch solutions</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>P027.1</td>
			<td>prepare 2M stock solution in purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer, Microm HM650V</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>920120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>770180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire blade</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td></td>
			<td>custom order, inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td>
			<td>Lumen Dynamics Group, Canada</td>
			<td>2012-12699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch microscope, BX51WI</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B patch amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitdata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PClamp software, Version 10</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to control data acquisition and stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controler, TC05</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 500 0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three axis micromanipulator Mini 25</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>210-100 000 0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator controller SM7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 900 7311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for patch pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&#160;</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>13006--50----ACN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, CoolLED pE</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>244-1400</td>
			<td rowspan="4">CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED 100 Dual Adapt</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>pE-ADAPTOR-50E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, USL 70/470</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>L70-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual port adapter</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set red (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F49-560</td>
			<td rowspan="3">Filters can be bought as set F46-008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F48-585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F47-630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set green (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F39-472</td>
			<td rowspan="3">Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F43-495W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F76-490</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserCheck, handheld power meter</td>
			<td>Coherent, USA</td>
			<td><a>1098293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro Software, Version 6</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td>
			<td><a href="http://www.neuromatic.thinkrandom.com/">http://www.neuromatic.thinkrandom.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Post hoc analysis of injections and projections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar for embedding and resectioning</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, Super Frost</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>61303802</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>3000302</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>alternative mounting media can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>11406--25------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

approcci optogenetic sono ora ampiamente usati per studiare la funzione di popolazioni neuronali e circuiti combinando espressione mirata di proteine ​​luce-attivati ​​e successiva manipolazione dell&#39;attività neurale dalla luce. Channelrhodopsins (CHRS) sono cationi canali luce-dipendenti e quando fuso con una proteina fluorescente loro espressione permette la visualizzazione e l&#39;attivazione simultanea di specifici tipi cellulari e le loro proiezioni assonale in aree definite del cervello. Via iniezione stereotassica di vettori virali, proteine ​​di fusione CHR possono essere costitutivamente o condizionatamente espressi in cellule specifiche di una regione del cervello definito, e le loro proiezioni assonale possono essere successivamente studiato anatomicamente e funzionalmente via ex vivo attivazione optogenetic in fettine di cervello. Questo è di particolare importanza quando si punta a capire le proprietà sinaptiche di connessioni che non potevano essere affrontate con approcci convenzionali di stimolazione elettrica, o per identificare romanzo affeaffitto e connettività efferente che è stato precedentemente poco conosciuta. Qui, alcuni esempi illustrano come questa tecnica può essere applicata per studiare queste domande a chiarire i circuiti paura legate nell&#39;amigdala. L&#39;amigdala è una regione chiave per l&#39;acquisizione e l&#39;espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali paura e. Molte linee di evidenza suggeriscono che la corteccia prefrontale mediale (mPFC) partecipa a diversi aspetti di acquisizione paura e l&#39;estinzione, ma la sua connettività preciso con l&#39;amigdala è appena iniziando a essere capito. In primo luogo, si mostra come ex vivo di attivazione optogenetic può essere utilizzato per studiare gli aspetti della comunicazione sinaptica tra le afferenze mPFC e cellule bersaglio nell&#39;amigdala basolaterale (BLA). Inoltre, è illustrato come questo approccio optogenetic ex vivo può essere applicato per valutare modelli di connettività nuovi utilizzando un gruppo di neuroni GABAergici nell&#39;amigdala, il cluster paracapsular intercalate cellule (mpITC), come esempio.

Questa sezione mostra il flusso di lavoro di un approccio optogenetic ex vivo e risultati rappresentativi di diverse strategie sperimentali per studiare le proprietà fisiologiche delle proiezioni sensoriali e modulatorie a lungo raggio a BLA e neuroni mpITC così come le proprietà di connettività locale fra mpITC e BLA. Dopo l&#39;iniezione stereotassica del vettore virale selezionato le coordinate desiderate nel cervello del mouse (Figura 1A-C, tempo di espressione virale 2 - 6 settimane, a seconda della sperimentazione), fettine di cervello acute dei siti di iniezione e le aree di proiezione nella amigdala sono preparati l&#39;angolo adatto per esperimenti di patch-clamp e dalla regione del cervello iniettato per l&#39;analisi post-hoc dei siti di iniezione (Figura 1D). Prima di iniziare le registrazioni e la stimolazione optogenetic, cellule fluorescente o pro assonaleproiezioni nella zona di destinazione (amigdala) devono essere controllate sul microscopio in posizione verticale per le registrazioni patch-clamp utilizzando la lampada fluorescente allegata (Figura 1E). Al momento l&#39;ottenimento di una registrazione da una cellula bersaglio putativo nella regione di proiezione della fetta del patch-clamp, viene avviata stimolazione luminosa mentre il punto di tempo, intervallo e durata degli impulsi sono controllati tramite il software di patch che fa scattare il diodo ad emissione luminosa (LED). A seconda della strategia sperimentale (Figura 2A-C, destra) l&#39;apertura nel percorso luce fluorescente o è completamente aperto o limitato (Figura 2D). Pur mantenendo la lunghezza dell&#39;impulso costante e il più breve possibile (idealmente ≤1 msec), intensità di uscita del LED è aumentato lentamente per valutare la cui intensità è necessario per ottenere l&#39;ampiezza desiderata della risposta sinaptica in un particolare esperimento (Figura 2E). Dopo la registrazione, fette amigdala sono post-fisso. Su resezione e facoltativositi di colorazione, di iniezione e di registrazione vengono esposte su un microscopio confocale per verificare posizione di iniezione e di escludere i dati provenienti da iniezioni fuori luogo. Immagini di siti di iniezione e le proiezioni assonale associato nell&#39;amigdala per le tre strategie sperimentali (ingressi mPFC a BLA, ingressi talamo a mpITCs, e l&#39;attivazione mpITC locale) sono mostrati in figura 2A-C. La figura 3 mostra i risultati rappresentante di registrazione ottenuti da BLA neuroni principali, interneuroni BLA locali e neuroni mpITC che illustrano le proprietà di risposte luce evocata per le diverse strategie sperimentali utilizzati (Figura 3a, E, I). Per individuare i neuroni GABAergici (interneuroni locali e mpITCs) per la registrazione, topi reporter GAD67-GFP sono stati utilizzati 24. Per mPFC e le proiezioni talamo sensoriali, diversi aspetti della trasmissione sinaptica possono essere studiati. La precisione temporale accoltiva- e le proprietà cinetiche delle CHRS utilizzati in questo studio consentono stimolazione affidabile con impulsi accoppiati ad un inter-stimolo intervallo di 50 msec. Questo consente per l&#39;analisi dei rapporti abbinato impulsi (PPR) delle correnti post-sinaptici (PSC), che può essere sia di facilitare o deprimente seconda proiezione e tipo di cellula bersaglio, e servire come indicatori di probabilità di rilascio presinaptico (Figura 3B, F, H) . Inoltre, l&#39;analisi delle latenze sinaptiche permette per la dissezione di diversi componenti di risposta post-sinaptici. In questo esempio, latenze più lunghe del inibitorio PSC (IPSC) contro eccitatori PSC componente (EPSC) indicano un ingresso disynaptic e monosinaptico, rispettivamente (Figura 3C). In altri casi, un&#39;analisi più approfondita di ulteriori proprietà EPSC quali jitter risposta o il coefficiente di variazione di dimensioni della risposta può essere necessaria per trarre conclusioni sulla sua mono o disynala natura PTIC 17,23. Inoltre, l&#39;applicazione di bloccanti farmacologici per i recettori specifici in grado di identificare la natura del PSC (ad esempio, glutammatergica EPSC e GABAergici IPSC, Figura 3C-D). Come previsto, la componente iniziale di ingresso mPFC era glutamatergica, mentre la componente in ritardo era GABAergico. Il blocco completa sia EPSC e IPSC con il glutammato bloccante dei recettori CNQX sostiene inoltre che l&#39;IPSC è disynaptic. Per indagare la modulazione della trasmissione sinaptica a fibre optogenetically attivati, gli effetti di agonisti e antagonisti per i recettori metabotropici (qui recettori GABA B) in ampiezza e PPR possono essere valutate per valutare le influenze su siti pre e post-sinaptici. In questo esempio, la concomitante diminuzione di ampiezza con un aumento PPR è indicativo di una modulazione presinaptica di fibre di luce-attivato (3G, H). Infine, interazioni locali di cellule dell&#39;amigdala può essere valutata, per esempio,quando i topi che esprimono Cre sotto il controllo del promotore TAC2 25 sono iniettati con una CHR esprime vettore doppio floxed virale (Figura 1C). Perché TAC2 e quindi, CHR è espresso in mpITC e l&#39;amigdala centrale (Figura 2C), attivazione di luce è stata limitata alla mpITC chiudendo il diaframma fluorescente percorso della luce (Figura 2D). In queste condizioni, i potenziali di azione luce evocata può essere raggiunta in mpITCs infetti. Brevi latenza risposte sinaptiche inibitorie del BLA indicano la presenza di un collegamento funzionale tra inibitoria mpITC e BLA neuroni principali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53628/53628fig1.jpg" /> Figura 1. stereotassica iniezioni, Preparazione di acuta Fette cervello, e la visualizzazione di fibre presinaptici. (A, B) di iniezione stereotassica virus. A) Immagine di topo anestetizzato collocato in una cornice stereotassica con teschio esposto e lapipetta di iniezione. Nel riquadro: Zoom in immagine di pipetta di iniezione riempita con una soluzione di virus mescolato con verde veloce. Barra di scala: 3 mm. (B) Schema di un teschio mouse con posizioni contrassegnate di fori per le diverse aree di iniezione. (C) Scheme mostrando diversi costrutti virali utilizzati in questo studio. Grigio scuro: sequenza del promotore; blu: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); verde / rosso: proteina fluorescente. Tempo di espressione era 2 settimane per proiezioni amigdala locali e 4 - 6 settimane per proiezioni da mPFC e MGM / PIN. (D) Preparazione di fette di cervello acute: Schema che mostra il posizionamento di cervello di topo sul palco affettatrice per ottenere fette da diverse aree di iniezione e di proiezione. (E) Visualizzazione di fibre in fettine di cervello acuto da un mouse GAD67-GFP iniettato con virus ChR2-mCherry in MGM / PIN. Le immagini sono prese sul microscopio cerotto in posizione verticale con diversi set di filtri: espressione GAD67-GFP, medie; fibre MGM / PIN etichettato con mCHerry, a destra. barra della scala: 200 micron. mPFC, corteccia prefrontale mediale; mpITC, mediale paracapsular cellule intercalate; BLA, basolaterale; MGM Grand, mediale nucleo genicolato, parte mediale; PIN, posteriore intralaminare nucleo del talamo; LA, amigdala laterale; BA, amigdala basale; CeA, nucleo centrale dell&#39;amigdala. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53628/53628fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53628/53628fig2.jpg" /> Figura 2. siti di iniezione, Aree di proiezione, e optogenetic stimolazione di proiezioni assonale. (AC) immagini confocale di siti di iniezione rappresentativi e le aree di proiezione del BLA, e gli schemi delle strategie sperimentali. (A) A sinistra: mPFC sito di iniezione in un mouse C57Bl / 6 macchiata di Neurotrace. barra della scala:500 micron. Medio: le proiezioni del BLA corrispondente in una fetta amigdala inclinato. barra della scala: 200 micron. A destra: Schema di campo tutta l&#39;illuminazione di proiezioni mPFC e la registrazione del neurone del BLA. (B) A sinistra: MGM / PIN sito di iniezione in un mouse GAD67-GFP. barra della scala: 500 micron. Medio: proiezioni corrispondenti a mpITC e LA di una fetta amigdala coronale. barra della scala: 200 micron. A destra: Schema di campo tutta l&#39;illuminazione di proiezioni MGM / PIN e la registrazione di un neurone mpITC. (C) A sinistra: l&#39;espressione locale di ChR2-YFP in una Neurotrace macchiato fetta amigdala di un mouse TAC2-Cre. barra della scala: 200 micron. Nel riquadro: Zoom in di mpITCs esprimono ChR2-YFP. barra della scala: 20 micron. A destra: Schema di illuminazione ristretta del cluster mpITC e la registrazione di un neurone BLA. (D) Foto di registrazione da camera durante il parto luce e l&#39;immagine dei neuroni in fettine di cervello acuto (gruppo mpITC) in un mouse GAD67-GFP con aper aperte e ristrettetura. barra della scala: 30 micron. (E) le correnti post-sinaptiche eccitatori (EPSCs) evocati da diverse intensità LED (in alto) e la trama del potere luce contro evocati EPSC ampiezza (in basso) da un neurone rappresentante mpITC su attivazione optogenetic di fibre provenienti da MGM / PIN. Barra di scala: 100 Pa / 10 msec. Nota:. Figura 2A viene modificato da riferimento # 16 e Figura 2C da riferimento # 23 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53628/53628fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53628/53628fig3.jpg" /> Figura 3. Risultati esemplare dal optogenetic attivazione del Long Range e proiezioni locali. (A) Schema della strategia sperimentale per (BD). (B) EPSCs rappresentativi rilevati da un neurone principale BLA eBLA interneurone dopo stimolazione optogenetic paired-pulse (50 msec inter-stimolo-intervallo) di fibre da mPFC suscitando accoppiato facilitazione del polso e la depressione polso abbinato, rispettivamente. Barra di scala: 100 Pa / 25 msec. (C) l&#39;attivazione optogenetic di fibre provenienti da mPFC suscita feed-forward inibizione. Sinistra: Rappresentante EPSC (a -70 mV) e la corrente post-sinaptica inibitoria (IPSC, a 0 mV) in un neurone principale BLA. L&#39;IPSC ha una più lunga latenza sinaptica rispetto al EPSC. Barre di scala: 200 Pa / 10 msec e 200 Pa / 2 msec. A destra: luce evocata bifasico EPSC / sequenza IPSC (a -50 mV) viene bloccata da antagonista AMPA / kainato CNQX (10 micron), che supporta ulteriormente la natura disynaptic del IPSC. Barra di scala: 50 pA / 5 msec. (D) Effetti del successivo blocco di EPSC / sequenza IPSC (a -50 mV) da parte del Cl - antagonista Picrotoxin (PTX, 100 micron) e PTX + CNQX. L&#39;IPSC è bloccato da PTX e per il restante EPSC da CNQX. Barre di scala: 50 Pa / 5 msec. (E) Schema della strategia sperimentale per (FH). F) EPSCs rappresentativi rilevati da un mpITC e un neurone principale BLA su optogenetic stimolazione accoppiato impulsi di fibre provenienti da MGM / PIN. Barra di scala: 50 pA / 20 msec. (G) EPSCs in un altro neurone mpITC sono bloccati dal bloccante dei canali del sodio Tetrodotoxina (TTX, 0.5 micron), che indica che essi dipendono dalle attività dei canali del sodio. Barra di scala: 50 pA / 20 msec. (H) gli ingressi talamiche ai neuroni mpITC sono modulati da recettori presinaptici GABA B. EPSCs sotto condizione di controllo, riduzione EPSC ampiezza e concomitante aumento del rapporto di impulso accoppiato durante l&#39;applicazione del agonisti GABA B Baclofen (2 mM), e recupero di sia in ampiezza iniziale razione impulsi accoppiato upon co-applicazione del GABA B antagonista CGP55845 (10 pM). Questi cambiamenti sono indicativi di una modulazione presinaptica da recettori GABA B. bar Scala: 50 pA / 20 msec. (I) Schema della strategia sperimentale (J). (J) Light-evocati potenziali d&#39;azione registrati da un ChR2-YFP che esprimono mpITC neurone. IPSCs luce evocata registrati da un neurone principale BLA a differenti potenziali di partecipazione (-90, -70, -50, -20, e 0 mV) invertire tutto il potenziale di equilibrio calcolato per Cl -. Barre di scala: 20 mV / 100 msec e 10 pA / 10 msec. Nota:. Figura 3B-D viene modificato da Riferimento # 16, e la Figura 3H e J di riferimento # 23 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53628/53628fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l&#39;attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell&#39;attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

15.8K Views.  University of Tuebingen.  approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l'attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell'attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati. 

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

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Neuroscienze

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...