We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNAのin vitro転写およびmRNAの精製<ol><li>製造業者の指示に従ってNotI制限酵素を用いてPCS2 +プラスミドを含むH2B-PSmOrangeを線形。 注：mRNAの汚染や劣化を防ぐために、手袋や白衣などの適切な保護を使用して、次の手順を実行します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはフェノール - クロロホルムベースの方法を使用して線状化DNAを精製します。 </li><li>製造元の指示に従ってSp6の-mRNA転写のための線形化の鋳型DNA1μgのを使用してください。 </li><li> 37℃で10-20分間、1.0 UのRNaseフリーのDNアーゼIを添加することにより、DNAを削除します。 </li><li> RNAを製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップを使用したmRNAをクリーンアップします。 </li><li> mRNAの純度および濃度を増加させるために、6μlの酢酸ナトリウム（3.0 M、pH5.2）を150μlの96％エタノールを添加することにより、mRNAを沈殿させます。メートルをインキュベート少なくとも30分間、および24時間まで-20℃でixedソリューション。 </li><li> 4℃で45分間18.407×gで紡糸溶液により、mRNAを収集します。液体を捨て、150μlの70％エタノール中のmRNAを懸濁します。混合し、4℃でさらに15分間この溶液を遠心分離。 、液を捨て、氷上で5分間ペレットを乾燥し、20μlの超純RNaseを含まない水でのmRNAを懸濁します。 </li><li> 100のmRNA希釈（99μlの超純RNaseを含まない水に1μlのmRNAの）：1の測光によるmRNAの濃度および純度を評価します。 </li><li>短期保存の場合、-20℃でのmRNAのソリューションを維持します。長期保存の場合、-80℃でのmRNAを保ちます。 </li></ol>ゼブラフィッシュ胚に2 H2B-PSmOrange mRNAのマイクロインジェクション<ol><li> TG（foxD3：GFP）を使用して、注入前の交配ペア夜を設定します。 TG（FLH：GFP）ダブルトランスジェニック魚（または任意の他のGFPトランスジェニック魚）。スペーサーを配置することによって分離された魚を残しますそれらの間の交配の時間を制御します。 </li><li>注射の午前中にスペーサーを取り外し、20分間の魚の伴侶をしましょう​​。 </li><li>時間を交配時には、130頁の最終濃度にH2B-PSmOrangeのmRNAを希釈/ NLとmicroloaderチップを用いたマイクロインジェクションキャピラリーへの転送6μlの注射液（RNaseを含まない水で）。較正されたスライドガラスに注入量を確認してください。 2 NL mRNAの溶液（260頁）を注入する射出圧力を調整します。 </li><li> 1xの胚（E3）培地を含む滅菌プラスチックペトリ皿に卵を収集します。 </li><li>プラスチック製パスツールピペットを用いて射出皿に20〜30の胚を転送します。 </li><li> 1細胞期11で卵黄への細胞の細胞内へのまたはちょうど下の溶液を含む2 NLのmRNAを注入します。 </li><li> 1×E3培地を含むペトリ皿に移す注入された胚は、未受精か正常に発達した胚を除去し、28℃でそれらを成長させます。 注：ライトプロテクトO胚fを実験を通して必要とされていません。 </li><li> 1×E3媒体にゼブラフィッシュの胚を高め、色素沈着を抑制するために、原腸形成した後、0.2 mMのPTU（1-フェニル2チオ尿素）を追加します。細菌汚染の危険性を最小限にするために1日2回培地を変更します。 </li></ol> 3.胚の埋め込み<ol><li> GFP（緑色）とPSmOrange（赤/オレンジ）蛍光ランプ及び適切な発光フィルターを装備した双眼顕微鏡を用いて共発現胚を選択します。 1×E3媒体を含む滅菌ペトリ皿に正の胚を移します。 </li><li>鉗子12を用いて、実体顕微鏡下Dechorionate胚。 </li><li>カット先端ピペット（P200）を用いて、超純水中で調製予め温めておいた1.0％低融点アガロース（LMA）の1.0ミリリットルを含む1.5ミリリットルチューブに1胚を転送します。注：80°CにLMAを温め、胚を埋め込む前に、室温で3〜5分間クールダウン。 </li><li> 150μlのLMAに胚を移し微細なプラスチックチップを用いて、カバーガラスをチャンバー反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +（または他の任意の適切な顕微鏡）について記載した実験においてダウン、例えば背側の胚の向きを調整します。 LMAが重合されると、麻酔のために0.2 mMのPTUと0.02％の3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）を含む魚の水でチャンバーを埋めます。 </li><li>サンプルを画像化する前に、トリカインの効果を確認するために15分を待ちます。麻酔は、明視野照明を装備した実体顕微鏡を使用してモニターすることができる胚の動きを、防ぐことができます。 注チャンバは、二回再利用することができます。 </li></ol> 4. PSmOrange光変換<ol><li>共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、それぞれGFPとPSmOrangeを画像化するための488 nmおよび561 nmのレーザーを使用してphotoconvertする領域を特定するために、検体をスキャンします。 注：反転STAに反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +を使用GE顕微鏡イメージングソフトウェアによってTiEcontrolledと488 nmの、561 nmおよび光電およびイメージングのための640nmのレーザーを装備。しかし、アプリケーションが確実であれば変換し、イメージング用のレーザラインが利用可能であるように、この顕微鏡に限定されるものではありません。 <ol><li>所定の場所に（NA：0.75; WD：1.0ミリメートル; FOV：0.64 X 0.64ミリメートル）20X空気目標を置きます。 </li><li>客観上記の焦点面で測定された0.74ミリワット、561 nmのレーザー：光変換前PSmOrangeタンパク質を検出するために、次の顕微鏡の設定を使用します。 注：これは、このシステム上の40％に相当する（焦点面で測定することが効果的なパワーを決定する唯一の方法です）。 H2B-PSmOrange注入の効率などの実験の必要に応じてレーザパワーを調整し変更することができます。 </li><li>関心領域を強調するためにズーム倍率を追加します。高い倍率は、画像取得時間、したがって、光毒性を減少させます。 </li></ol></li><li>被覆構造zスタックを取得488 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-&gt; 4）で561 nmのレーザーを使用して、関心の秒。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。 </li><li>サンプルをスキャンし、関心領域をphotoconvertにエリアをハイライトする（ROI）ツールを選択します。刺激領域としてROIを修正しました。写真アクティベーション/漂白モジュールを選択し、それぞれのチェックボックスをオンにして、488 nmのレーザーを活性化し、80％（客観的に測定された1 mWのレーザパワー）に488nmレーザーを設定します。 0.5秒/フレームへのスキャン速度を設定します。 </li><li>光変換ユーティリティ（ND刺激）を開き、光変換設定を指定します。 <ol><li>光変換プロトコルを指定するには、「追加」コマンドをクリックします。 </li><li> 「取得/刺激」メニューの「取得」の「フェーズ」1に設定し、画像の数が「ループ」メニュー内の光変換前に取得することを示しています。 </li><li>セント &quot;に設定し、「フェーズ」2imulation「刺激イベントの数を入力するには、実行されます。 </li><li>調整 &quot;フェーズ&quot; 3 &quot;相&quot; 1.オプションで説明したように、画像取得の最後のラウンド前に待機する時間を入力して、「フェーズ」2後の待機「フェーズ」を挿入します。 </li><li>すべてのパラメータを設定したら、刺激の設定を適用し、光変換を実行します。 注意：レーザーパワーを、光変換の各ラウンドのためのスキャンおよび反復回数の周波数が変動し、胚から胚に異なる場合があります。で開始する設定を表1に示します。 </li></ol></li><li> 488 nmの、561 nmおよび上記のように設定を適用する640 nmのレーザーを使用して、最終的なzスタックを取得します。 （4.5 mWまで）高いレーザパワーを使用して、変換PSmOrangeを可視化するために640 nmのレーザーを設定します。 </li></ol> LMAから5.ディスマウント胚<ol><li>顕微鏡からチャンバーを含む胚を削除してください。慎重にアガロースのuから胚を削除鉗子を歌います。 </li><li>新しい滅菌プラスチックペトリ皿にまたは1x E3および0.2 mMのPTUを含む滅菌6ウェルプレートに胚を移します。開発の所望の段階まで、28℃で胚をインキュベートします。 </li></ol> 6. Photoconverted PSmOrangeタンパク質発現細胞の運命を分析<ol><li>ポイント3.3と3.4で説明したように、胚を再埋め込みます。 </li><li>共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、関心のGFPトランスジェニック構造（488 nm）の中でphotoconverted細胞（640 nm）を識別するための試料をスキャンします。 </li><li> 488 nmの、561 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-&gt; 4）で640 nmのレーザーを使用して、関心の構造をカバーzスタックを取得します。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。 </li><li>これは共発現GFPとphotoconvertedタンパク質、細胞を同定するために、次のいずれかの方法を使用します。 <ol><li>カスタム作られた自動フィジーイメージJマクロ3 <ol><li>コンボリューション「GaussianBlur」プラグインを使用して、元のスタック（→プロセス→GaussianBlur→フィルター）と「画像電卓」プラグイン（→プロセス→イメージ電卓）を使用して、元からのスムーズなスタックを引きます。関心の構造を視覚化し、分析のための計算時間を短縮するために、この手順を使用します。 </li><li> photoconvertedセルを強調表示するために、緑と遠赤チャンネルに特定のしきい値を適用します（→イメージ→→しきい値を調整します）。適切な設定で、閾値領域を検出するために、「粒子の分析」ツールを使用します（→粒子を分析→分析）。 </li><li> 「イメージ電卓」プラグインを開き、黄色（→プロセス→イメージ電卓）に緑と遠赤​​のチャンネルに重複の関心領域を表示します。 </li></ol></li><li> 3Dデータ評価のための顕微鏡イメージング・ソフトウェア<ol><li>スタックを表示しますショーのボリュームビューオプション（→3Dビジュアライゼーションメニュー→表示ボリュームビュー）を使用して3D。 、緑、赤と遠赤色のチャンネルを選択明るさとコントラストを調整し、photoconvertedエリア（ 図1）を強調するために3Dスタックをトリミングするグラフィックインターフェースを使用してください。 注：データを分析するための同様の方法は、画像解析のための一般的なソフトウェアのほとんどで利用可能です。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development.">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li><li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoswitchable+orange-to-far-red+fluorescent+protein,+PSmOrange.">A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange.</a> Nature Methods. 8, 771-777 (2011).</li><li>Beretta, C. 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P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish.">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

蛍光レポーターを有するトランスジェニック胚は、胚の発達を理解するために根本的に貢献しています。しかし、特定の構造の特定の視覚化を容易にするプロモーターに必須の必要性が依然として存在します。彼らの不在下では、研究者が興味のある構造の起源と発展について調べるために、このような蛍光タンパク質の光変換などの技術に依存しています。これにより、その発達に関与する分子機構を同定するための重要な前提条件です。ゼブラフィッシュ分野における技術の進歩は、現在のアプローチ14,15にCRISPR-Cas9媒介ノックを使用して、インスタンスのためのトランスジェニック系統、photoconvertibleタンパク質でFPを交換することができます。しかし、この技術は、比較的時間がかかり、常に成功していません。これとは対照的に、普遍的にGFPにH2B-PSmOrangeを表明し、おそらく他のトランスジェニック背景の適用は、EMを介して細胞を追跡する単純明快な技術でありますbryonic開発。 例えば、ゼブラフィッシュ腹habenulaの複数形の起源、脊椎動物の背側間脳内の保存された神経伝導系の一部は、最近ので、その開発の根底にある遺伝カスケードが明らかにされなくなるまでとらえどころのないされています。移動する細胞を追跡するためにPSmOrangeシステムと長期的タイムラプス解析を用いて、我々は左と骨端の右隣発信背側手綱核とは異なり、腹側手綱ニューロンは視床3に、この領域の後方を開発することを示すことができました。この知識は、私たちはその後、腹側手綱ニューロンの開発のために下流の遺伝子TCF7L2のシグナリング標準的なWntの重要な機能を識別することができました。 photoconvertible PSmOrangeシステムの適用は、迅速、簡単であり、胚が照明の前に強力なタンパク質発現のために選択することができる光活性化タンパク質上の利点を有します。合成はmRH2B-PSmOrangeためのNAをコードは遍在全ての核オレンジ蛍光タンパク質を発現するGFPトランスジェニック胚に注入されます。私たちは、注入時に任意の副作用を発生していないと、タンパク質は、少なくとも96時間安定です。タンパク質は、次いで、488nmの励起レーザーを用いてROIにおけるGFPトランスジェニック細胞においてphotoconvertedされ、胚は、その後、約48時間以内に細胞を含む現在遠赤色蛍光タンパク質について分析することができます。条件が胚および標的組織の発達段階に応じて変えることができるように、それは成功した光変換を監視することが重要です。顕微鏡イメージングソフトウェアは、光変換前後の各チャネル（赤、緑、遠赤）の画像を取得します。光変換効率は、光変換前後の異なるチャネル間のROIの平均強度の蛍光を測定評価することができます。何の遠赤色蛍光を光電広告直後に検出されない場合光変換のditionalラウンドが適用されなければなりません。 GFP漂白は、光変換後に一般的です。しかし、トランスジェニック蛍光タンパク質の連続的な翻訳は、約2時間以内に、この問題を克服します。 カスタムはphotoconvertedタンパク質を共発現する細胞の同定を容易にするために、フィジーImageJのマクロを作って、トランスジェニックGFPは3可能です。 H2B-PSmOrangeを発現する安定なトランスジェニック系統の将来の確立はさらに、この手順を簡素化します。また、組織再生などの分野を検索するには魅力的な価値を持っている可能性がある4日後に受精、後に発生事象の分析を容易にします。また、母性発現しPSmOrangeトランスジェニックとタイムラプスイメージング16の組み合わせは、単一細胞レベルでの原腸陥入前に出発細胞遊走のイベントを調査するための強力なツールとなります。さらに、アプリケーションがf、とH2B核タグの交換を含んでいてもよいですまたは例えば、発生中の胚において細胞膜及び潜在的に軸索を可視化するGAP43。 この技術の1つの制限は、接合体タンパク質のみが原腸形成後に発現され始めるので、原腸形成過程の分析には適用されないということです。それはまた、胚の深い位置する細胞内タンパク質をphotoconvertすることはかなり困難であることを考慮しなければなりません。光変換設定は、高いレーザパワーとして適合しなければならず、光変換のために必要な比較的長い刺激時間は注意深い監視を必要とする組織の損傷をもたらすことができます。

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.
Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.
To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:233px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy MiniElute Cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Pasteur</td>
			<td>alpha laboratories</td>
			<td>LW4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Original H2B-PSmOrange Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>31920</td>
			<td>The plasmid described in the paper is available in the Carl lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247 000.013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (5 Inox)</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>2-1633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td align="right">155382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1R+</td>
			<td>Nikon GmbH Germany</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon PLAN Apo &#955; 20x air objective&#160;</td>
			<td>Nikon GmbH Germany</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)</td>
			<td>Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking cells in gfp-transgenic zebrafish using the photoconvertible psmorange system

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

図1は、PSmOrange光変換システムの一例を示す図です。松果体複合体は、脊椎動物の背側間脳に保存された構造です。多くの他の脊椎動物のように、この複合体は、間脳の中心部にある松果体器官および左側parapineal細胞で構成されています。エレガントが、時間のかかるアンケージング実験はparapineal細胞が松果体臓器13の前部に由来することを示しました。 Tgの（foxD3：GFP）; TG（FLH：GFP）トランスジェニック胚は、松果体とparapineal両方の細胞は、開発中に標識されています。 PSmOrangeシステムの適合性を評価するために、我々は報告松果体複雑な開発を再現するためにこれらの胚を使用していました。 PSmOrange、H2B-PSmOrangeの核型をコードする260のPG mRNAは、すべての細胞核においてタンパク質を発現させるために1細胞期の二重トランスジェニック胚に注入しました。注入された胚を24時間後fertilizatまで28℃でインキュベートしました。イオン（HPF）、GFPと強いH2B-PSmOrangeの発現のために選択し、底部に向かって指向の背側でのチャンバーカバースリップシステムでLMAに埋め込まれました。試料は、顕微鏡イメージングソフトウェアによって制御され、488 nmで、561 nmおよび640 nmのレーザーと光変換およびトラッキングのための20X空気目的を備えた倒立共焦点レーザー走査顕微鏡下に置きました。松果体の前部にある二つの細胞クラスターはphotoconverted、すぐに（ 図1A - F）画像化しました。しかしない561 nmレーザー（オレンジ/赤- 図1B）と、 - photoconverted細胞（ 図1C遠赤色）640 nmのレーザーを用いて可視化することができました。これらの細胞におけるGFPの発現は、最初にも起因する（ 図1A、1D、1F） を光退色に減少しました。 52 HPFでGFPおよびH2B-PSmOrangeはphotoconverted H2B-PSmOrangeタンパク質を発現する細胞において検出された（ 図 </strong&gt; 1A &#39; - F&#39;）。確かに、これらの細胞の数は、脳の左側にparapinealを形成し（ 図1A中の矢頭&#39; - F&#39;）。この結果は、parapineal細胞起源に関する以前の報告と一致していると生きている脊椎動物の胚におけるPSmOrange技術の適用可能性を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53604/53604fig1.jpg" /> 。ゼブラフィッシュの胚を生きているにPSmOrange光変換システムを使用してparapineal細胞起源の識別図1（A - F &#39;）TGの背側間脳に焦点を当ててトップに前方と背側のビュー（foxD3：GFP）; TG（FLH：GFP）トランスジェニック胚での松果体（P）とparapineal細胞（PP）ハイライト（Aを - F）26 HPF直後光電と（A &#39; - F＆＃<html> 39;）26時間後に52 HPFで。胚は、mRNAは、H2B-PSmOrangeをコードして注射しました。写真は表示します 3D再構成。 （A、A &#39;）トランスジェニックGFP、（B、B&#39;）の発現がない光電（遠赤チャネル）後H2B-PSmOrange（赤チャネル）および（C、C &#39;）を変換します。白点線の円は、赤/オレンジ色の蛍光を欠いている光変換の面積を、強調表示します。 （D、D &#39;）すべての3つのチャネルのマージ（緑、遠赤、赤）、（E、E&#39;）赤と遠赤チャネルおよび（F、F &#39;）緑と遠赤チャンネル。 （A&#39;-F &#39;）白矢じりは緑、橙/赤と遠赤色蛍光を示しparapineal細胞の位置を強調表示します。 （AF &#39;）スケールバーは、各画像の右下隅に表示されます。PLOAD / 53604 / 53604fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 段階 </td><td> ループの数 </td><td> アクティブレーザー </td></tr><tr><td>集録</td><td> 1サイクル</td><td> 488 nmで、561 nmで、640 nmの</td></tr><tr><td>刺激</td><td> 15 30サイクル</td><td> 488 nmの</td></tr><tr><td>成熟</td><td> 1分</td><td> ＃ </td></tr><tr><td>集録</td><td> 1サイクル</td><td> 488 nmで、561 nmで、640 nmの</td></tr></tbody></table> 表1：H2B-PSmOrange の光変換のための条件。

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Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K ビュー.  Heidelberg University. We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

ビデオ: Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

発生生物学

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...