This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

このプロトコルは、ジョージア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.準備<ol><li>卵母細胞培養、購入やたての最小必須培地（MEM）を調製し、 表1で説明したように3 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）で補うために。ロードバランス（ゼロに風袋）にポリスチレンボトルを置きます。ためには、BSAを除き、全ての試薬を追加し、250グラムの合計重量のMQ水で最終体積を持ち出します。その後、BSAを追加し、溶解し、フィルター滅菌することができます。 注：記載のMEM培地を、5％CO 2、5％O 2および90％N 2の医療用ガスの混合物で平衡化し、細胞のインキュベーションを必要とします。しかしながら、他の媒体（例えば、CZB）は大気条件下、5％CO 2での細胞のインキュベーションを可能に使用することができます。 </li><li>卵母細胞のマイクロインジェクションのために、購入またはM2培地を準備します。 </li><li> Pを準備します5 IU / 100μlの濃度に君臨するの牝馬の血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）。 </li><li> 1μMの作業濃度に対するsiRNAの株式を購入し、再構成します。 </li></ol> 2.マウス卵母細胞のコレクション<ol><li> 1日目：卵胞の発達を刺激し、排卵前卵胞の数を増やし、前卵母細胞のコレクションに雌マウスの腹腔内に48時間をPMSGの5 IUを管理します。 </li><li> 3日目：卵母細胞の収集および培養のためには、1 / mlのミルリノンを補足したMEM / BSAの3 mlを35mm培養皿を設定します。このホスホジエステラーゼ阻害剤は、前期-I停止に卵母細胞を維持し、胚胞崩壊（GVBD）を防ぐことができます。少なくとも15分間、医療ガス混合物中の培養皿を平衡化。 注：ミルリノン補充した培地は、卵母細胞の収集だけでなく、卵母細胞のマイクロインジェクション、24時間培養ホールド期間後のsiRNA全体で必要とされます。 </li><li> 15を実践確立実験室を使用した雌マウスから卵巣を取得し、予め温めておいて、新しい培養皿に移し、MEM / BSA /ミルリノンを平衡化しました。 </li><li>卵母細胞の収集のための実体顕微鏡のステージ上で培養皿を置きます。リリース卵丘卵母細胞複合体（COCの）手動で27 G針で胞状卵胞を穿刺することによって。 1mlシリンジに取り付けた27 G針で、培養皿の底に1卵巣を修正し、すべての大型卵胞を穿刺するために第2の針を使用しています。各卵巣のために繰り返します。 </li><li>コンパクトな卵丘細胞の2以上の層に囲まれているすべての卵母細胞を収集し、標準的な口のピペット操作手順や卵母細胞吸引の他の手段を使用します。新しい皿にCOCのを移し、37℃で1時間インキュベートします。 </li><li>慎重に750μlのの吸引量に設定した1mlピペットを用いて繰り返し穏やかにピペッティングすることにより周囲の卵丘細胞を除去。ピペッティングのステップを約12回繰り返します卵母細胞を5分間回復することができます。卵丘細胞のすべてまたは大部分が除去されるまで、このように続けます。別の培養皿に剥皮した卵母細胞を移し、37℃で15分間平衡化することができます。 </li><li>使用される3つの実験群に露出した卵母細胞を割り当てる：目的の標的に対する特異的siRNA（I）のマイクロインジェクション、非特異的（対照）siRNAの（ii）のマイクロインジェクション、および（iii）非注射対照群を説明するために培養条件。 </li></ol> 3.卵母細胞のマイクロインジェクション<ol><li>卵母細胞のマイクロインジェクションのためのミルリノン（1μg/ ml）で補足した3ミリリットルM2培地で培養皿を設定します。洗浄、注入した卵母細胞のその後の培養のために、MEM / BSA /ミルリノンを含む培養皿を準備します。 注：M2培地は、HEPESバッファー含まれており、大気条件下で37℃で15分間プレ加温が必要です。 MEMは、説明するように、医療ガスを用いて予備温暖化と平衡化を必要とします上記日間。 </li><li>マイクロインジェクションシステムを準備します。 1μMの特異的siRNA溶液5μlの注射針をロードします。マイクロインジェクションシステムのマイクロマニピュレーターにホールディングピペットや注射針を固定し、較正容積と圧力で射出装置を設定します。 </li><li> 3センチメートル培養皿の蓋の内側にM2培地の200μlのマイクロドロップを置き、マイクロインジェクションシステムの設定や位置合わせのための卵母細胞を追加します。 </li><li>ガイドとして、卵母細胞を用いて、保持し、注射針の位置を調整します。優しく卵母細胞を固定し、セルの最も広い直径に注射針の位置を調整するホールディングピペットに負圧を適用します。どこでも卵母細胞の細胞質にsiRNA溶液の約10 PLのマイクロインジェクションを許可するように設定を調整します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> 図1.卵母細胞のマイクロインジェクションは、設定します。（ <stroNG&gt;それぞれ左右、上に位置するホールディングピペットや注射針で3センチ培養皿から蓋に配置されたM2培地の200μlのマイクロドロップのA）代表画像。 （B）グループは、前期の-Iは、マイクロインジェクションの前に卵母細胞（GV段階）を逮捕した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </li><li>実体顕微鏡のステージに蓋を戻し、新鮮M2培地200μlのマイクロドロップを追加します。マイクロインジェクションステージにマイクロドロップで蓋を戻した後、口のピペット操作によってマイクロドロップ、または代替方法に卵母細胞のグループ（〜10）を追加します。 <ol><li>個々の卵母細胞を顕微注入するために進んでください。ゆっくりと細胞質に注射針の先端を挿入し、保持ピペットで1卵母細胞を固定し、siRNA溶液の注入量を追放。慎重に注射針やMOを撤回マイクロドロップの底の位置に注入された卵母細胞をVEの。マイクロドロップの上部の位置に失敗した注入した卵母細胞を移動します。 </li><li>各卵母細胞にマイクロインジェクションの手順を繰り返します。一度に最適な卵母細胞の生存率、卵母細胞の顕微注入するだけの小さな数を維持するために。このプロセスは、マイクロドロップ内の温度およびpH変化を防止するために、数分以上を取らないことを確認してください。 </li></ol></li><li>吸引除去に成功した卵母細胞を注射するか、または慎重に実体顕微鏡に注入した卵母細胞のマイクロドロップで蓋を移動します。 37℃で洗浄し、平衡化するMEM / BSA /ミルリノン媒体に、口のピペッティングまたは代替の方法で注入した卵母細胞生存能力を転送します。 </li><li>卵母細胞の別のグループを使用して、対照群の非特異的なsiRNAを装填新しい注射針を用いてマイクロインジェクションプロセスを繰り返します。独立した培養皿にMEM / BSA /ミルリノン、転送中の卵母細胞を洗います。 </li><li>文化すべてのグループ医療ガスの雰囲気下、37℃でMEM / BSA /ミルリノンで24時間卵母細胞。 注：「ミルリノンブロック「培養期間は、効率的な標的mRNA /タンパク質の枯渇のために必要とされます。 </li></ol>減数分裂成熟4.卵母細胞の培養<ol><li> 4日目：卵母細胞の各実験群については3ミリリットルMEM / BSAとセットアップ4培養皿（35ミリメートル）。卵母細胞の成熟のために使用する10％（高品質）ウシ胎児血清（FBS）とグループごとに1つのメディア皿を補います。すべての培養皿は、医療ガス混合物で、37℃で平衡化することを許可します。 </li><li> 「ミルリノンブロック」から卵母細胞を解放するには、順次、MEM / BSAを含む皿に卵母細胞を3回洗浄した後、10％FBSを含む培地を含む成熟皿に卵母細胞を移します。文化37℃で17時間、すべての卵母細胞群は、再開と減数分裂の進行を可能にします。 </li><li> 5日目：卵母細胞のFIXaのためのソリューションを準備ンを含む：（I）PEM緩衝液中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）（100mMのPIPES [pHは6.9]、1mMのMgCl 2、1mMのEGTA）、0.5％のTriton-X 100、および（ii）PBS、5を補充したと卵母細胞を洗浄し、ブロックするために使用される％FBS。 注：これらのソリューションは、従来の卵母細胞の固定を37℃に予備加温する必要があります。 </li><li> （4ウェルディッシュの）卵母細胞の固定は（17時間の培養後）、速やかに個々のウェルに口ピペッティングまたは代替の方法により卵母細胞の各実験群を転送予め温めておいた4％PFA溶液を750μLを含有し、37℃でインキュベートについて1時間Cを°。その後、5％FBSを含む予め温めておいたPBS750μlの中で3回（各15分）の卵母細胞の各グループを洗います。 </li><li> 4℃で200μlのPBS / 5％FBS、O / Nでのブロックの卵母細胞は、非特異的結合する抗体を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 5.免疫蛍光分析<ol><li> 6日目： 注：免疫染色は、マルチウェルプレートとOOCで行われますytesが直列それぞれの抗体および洗浄溶液を含む、連続的なウェルに移しています。いずれかの48または96ウェルプレートを使用することができ、単によく大きさに基づいて液量を調整します。 96ウェルプレートについて、ウェル当たり200μlのを使用しています。 - 3洗浄ウェル - 二次抗体溶液 - 3洗浄井一次抗体溶液：卵母細胞は、次の順序でさまざまなソリューションに転送されます。露光量を制限するために、プレートをホイルで覆うことができます。 新しいPBS / 5％FBSを準備し、抗体希釈液（例えば、ウサギ抗ペリセントリン（1 /千）、マウス抗チューブリン（1 / 1,000））を調製し、この溶液を使用してください。 </li><li>一次抗体溶液の（より少ない容量が必要な場合、または100μl）を200μLを含む個々のウェルに各実験群の固定卵母細胞を移し、よくパラフィルムでカバーしています。 （1時間、または4°のCO / Nのために例えば、37℃）、最適な抗体固有の条件に従ってインキュベートします。 注：一次抗体dilutioN並びに特定のインキュベーション時間および温度は、使用される種々の抗体についての最適な条件を決定するための試験を必要とします。 </li><li>一次抗体とのインキュベーション後、PBS / 5％FBS（10〜15分毎）​​に卵母細胞を3回洗浄します。 </li><li>蛍光結合二次抗体 （例えば、1 /千の異なる波長の蛍光色素と結合した抗ウサギおよび抗マウス抗体の希釈物）を含有する溶液中に卵母細胞を移します。 37℃で1時間インキュベートします。 </li><li> （ - 15分毎10）をPBS / 5％FBS中で卵母細胞を3回洗浄します。 </li><li>最後の洗浄工程の後、清浄なガラススライド上に卵母細胞を転送し、優しく余分な洗浄液を吸引除去します。これは、ガラス表面上の卵母細胞を固定します。メディア（DAPIを含む）を搭載した8μlを添加して、慎重に22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップでマウントメディアを重ねます。気泡を捕捉および/または卵母細胞の損傷を防ぐために、ゆっくりとカバースリップを下げます。 注：または、前のスライドに取り付けるにカバースリップの角に（ワセリンと混合）100μmのガラスビーズの小さなボリュームを追加、共焦点顕微鏡分析のための卵母細胞の3次元特性を維持します。 </li><li> 4℃で保存したスライドは、または減数分裂の進行を評価するだけでなく、使用した二次抗体を一致させるために必要なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて発現レベルおよび細胞内タンパク質の局在の分析に進みます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes.">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance.">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li><li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes.">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li><li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome:+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling.">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li><li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

そのようなエレクトロポレーション及びトランスフェクションのような体細胞への外因性核酸の転写のための複数の方法があるが、マイクロインジェクションは、転写休止マウス卵母細胞へのRNA分子の送達のための最適な方法です。現在のプロトコルは、異なる主軸および/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能テストを可能にする特定のmRNAのインビトロ枯渇のための効果的なアプローチを提供します。このアプローチは、効率的な転写産物の枯渇をもたらし、非常に適応可能です。 siRNAは特にPCNT転写産物を標的とするために使用されたが、同様の条件は、目的のほとんどすべての遺伝子を標的化するために使用することができます。 卵母細胞の収集、文化や操作など、このプロトコルのいくつかの態様は、卵母細胞の品質を維持するためと技術的成果物を避けるために、練習と経験が必要です。培地のpH及び/又は温度の変動は、作業eで避けなければなりませんxpediently、慎重に。卵母細胞の小グループのマイクロインジェクション、およびマイクロインジェクションシステム内の加熱されたステージの利用可能性は、有害な温度変化が制限されます。事前検証済みのsiRNAの使用が推奨されており、効率的な標的タンパク質の枯渇は、免疫蛍光またはウエスタンブロット法による確認が必要です。いくつかのステップは、目的の異なる遺伝子を標的とするように変更する必要があります。例えば、ミルリノン添加培地中でお勧めの24時間「保留期間」は、様々なsiRNAのために有効です。しかし、この時間は、特に長い半減期と非常に豊富なmRNAおよび/または標的タンパク質の調整を必要とすることが、以下の豊富なターゲットに対して短縮することができます。しかし、その卵母細胞の品質と減数分裂の可能性が最高の24時間以下の保持期間を使用して保存されている考慮することが重要です。卵母細胞の取扱いと注意も固定および免疫蛍光分析の際に必要とされています。 37℃での卵母細胞の固定は、微小管depolymerを制限低い温度で発生し、よりよい化は、減数分裂紡錘体の構造を保持します。しかしながら、これらの条件は、目的の標的タンパク質に応じて調整する必要があるかもしれません。また、免疫蛍光のための最適な条件（ すなわち、抗体濃度ならびにインキュベーション時間および温度）も、関心のあるすべての抗体のために確立され、前のsiRNAマイクロインジェクションを行うに厳密にテストする必要があります。 この手法は、効果的に卵母細胞の生存率が唯一の文化の中で限られた時間のために持続させることができるように、減数分裂を起こすように卵母細胞の品質と能力を維持し、合理的な期間内に非常に豊富なタンパク質を枯渇されない場合があります。低次形態の表現型は、標的転写物の部分的ノックダウンを用いて観察することができます。しかし、特定のモルホリノの同時注入は、翻訳の阻害のための付加的な並列の戦略として使用されてもよいです。いくつかの制限は、潜在的な下流ANALYの通りもありますマイクロインジェクションした卵母細胞で実現可能であるSIS。例えば、必要なハンドリングと拡張文化が成功した体外受精 （IVF）を受け、着床前の胚発生に対する機能的効果の研究を排除するための卵母細胞の能力を制限することができます。また、大規模なサンプルサイズは、免疫ブロット法または生化学的アッセイなどのいくつかの下流の用途に必要とされているこの方法では達成することは困難です。 いくつかの制限があるにもかかわらず、このアプローチは、卵母細胞内の異なる要因の機能テストを可能にし、異なる研究グループによって首尾よく使用されている特定のmRNA のインビトロで枯渇するのに有効で推進しています。卵母細胞における機能喪失分析は、通常、（条件付き）ノックアウトまたはトランスジェニックRNAiのマウスモデルの生成を伴います。両方のアプローチは、労働及び時間集約されています。対照的に、 インビトロでのsiRNAのマイクロインジェクションは、容易に有意と機能テストのために使用することができます少ない時間とリソース。それはノックアウト/トランスジェニックマウスモデルを生成するタスクに着手する前に、標的タンパク質の機能的意味の洞察を得るために、特に貴重なアプローチです。 siRNAのマイクロインジェクションおよび免疫蛍光分析の組み合わせは、siRNA媒介標的タンパク質の枯渇に応答して、減数分裂の進行の異なる段階中のタンパク質の発現と細胞内分布パターンの研究のための強力な分析ツールを提供しています。卵母細胞から卵​​母細胞へのsiRNAの有効性の潜在的な違いは容易に識別可能であり、成功した標的タンパク質の枯渇と表現型/機能解析間の正確な相関関係を可能にします。さらに、ヒストンH2B-GFP融合タンパク質をコードするキャップされたメッセンジャーRNAと特異的なsiRNA分子の同時注入のためのプロトコルの開発（または他の蛍光マーカー標識）は、ライブセルによりリアルタイムで標的タンパク質の機能の評価を可能にしますLイメージング。 要約すると、最適化された条件で、転写サイレンシングのためのsiRNAのマイクロインジェクションは、免疫蛍光分析などの他の強力な分析ツールと組み合わせる場合は特に、セルのセルごとにマウス卵母細胞中の特定の標的タンパク質の機能をテストするための貴重な機械論的なアプローチを提供します。この組み合わせアプローチが正常MTOC関連タンパク質を枯渇させると、減数分裂紡錘体形成を評価しました。

減数分裂は、配偶子（卵母細胞および精子）で発生する独特の分割処理であり、それぞれ1、減数分裂Iと減数分裂IIの間に相同染色体と姉妹染色分体を分離するためにDNA合成を介在せずに2つの連続した部門が関与します。卵母細胞における減数分裂時の染色体分離におけるエラーは受精胚中に継承され異数性をもたらすことができます。特に、発展途上胚における異数性の発生率は、母体の加齢に伴って増加し、女性1,2における妊娠損失だけでなく、先天性の先天性欠損症の主な原因である、したがって、減数分裂時の異数性の分子基盤を理解するための重要な必要性を強調。 細胞分裂の間、染色体分離は反対スピンドルへの正しい取り付けのための微小管スピンドル装置と安定した染色体微小管の相互作用の確立の組み立てに決定的に依存していますポール。重要なことは、哺乳動物の卵母細胞における減数分裂紡錘体の形成は、体細胞での有糸分裂とは異なり、中心小体3,4を欠いているユニークな微小管組織化センター（MTOCs）によって規制されています。微小管の核形成と組織のために必要不可欠なタンパク質は、微小管集合を触媒するγチューブリンを含む卵母細胞MTOCs、に局在します。また、MTOCs 5でバインド必須の足場タンパク質として機能し、アンカーγチューブリン、ならびにその他の要因ペリセントリン。注目すべきことに、我々の研究は、キーMTOC関連タンパク質の枯渇が減数分裂紡錘体の組織を破壊し、完全に紡錘体チェックポイント（SAC）6,7によって解決されていない卵母細胞における染色体分離のエラーにつながることを示しています。したがって、減数分裂の停止を誘発しないスピンドル安定性の欠陥は、異数性に貢献において重要なリスクをもたらします。スピンドルアセンブリと組織内での重要な役割、卵母細胞MTOC protのにもかかわらず、EIN組成と機能が十分に理解されたままになります。 細胞が減数分裂まもなく8,9の再開前に、転写的に静止してしまうなどの哺乳動物の卵母細胞に特異的な標的タンパク質の機能をテストすることは、困難です。したがって、排卵前の卵母細胞が減数分裂を再開し、受精10,11の後に減数分裂と同様に最初の切断部門をサポートするために母性mRNAの店に依存しています。哺乳動物の卵母細胞中のmRNA転写物のRNA干渉（RNAi）介在性分解の有効性は、十分に確立され、減数分裂成熟の間の翻訳のために募集母性RNAは、siRNAが12-14を標的に特に適しています。したがって、卵母細胞への短い干渉RNA（siRNA）のマイクロインジェクションは、機能テストのために標的mRNAを枯渇させる貴重なアプローチを提供します。 ここでは、マウス卵母細胞及び特定transcriのsiRNA媒介枯渇を単離するための方法を記載PTSはペリセントリン、本質的​​なMTOC関連タンパク質の機能をテストします。加えて、我々は、卵母細胞における減数分裂紡錘体形成を評価するために免疫蛍光分析条件を記述する。

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare&#039;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Recipe outlined in Table 1</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G, potassium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Essential Amino Acids (50x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs targeting Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>Negative control siRNAs&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Micro-injections System</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulators</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injection needles (femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Holding pipettes (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm CA Filter System</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

siRNAのマイクロインジェクションは、in vitroで異なるターゲット因子の効率的かつ高度に特異的な機能テストを可能にした卵母細胞におけるmRNAの分解及びその後のタンパク質の枯渇に有効なアプローチを提供します。その後、免疫蛍光は、特定の表現型分析のために使用されるだけでなく、siRNAを注入した卵母細胞中のタンパク質の枯渇を検証します。現在の例では、抗チューブリンおよび抗ペリセントリン抗体とともにDAPIで個々の卵母細胞の蛍光標識有効：だけでなく、ペリセントリン枯渇の（ⅰ）確認（ii）のコントロールの両方のクロマチンと減数分裂スピンドル構成を総合的に評価し、 PCNT -枯渇した卵母細胞。 非特異的コントロールまたはPCNTのsiRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞の代表的な免疫蛍光画像は、図2〜図7に示されている。17時間の培養後、ほとんどの制御卵母細胞は中期-IIのクワガタに達しました整列した染色体と紡錘体極の明るいペリセントリン標識（ 図2A）で編成さ減数分裂スピンドルをeとが含まれています。特に、ペリセントリンはこれらの細胞で効率的なタンパク質ノックダウンを確認し、PCNTのsiRNAを注入した卵母細胞では検出されませんでした。また、PCNT枯渇卵母細胞の大半は中期-I段階で推移し、ずれた染色体（ 図2B）で無秩序な主軸構造を示します。中期-IIに進行数PCNT枯渇卵母細胞も破壊されたスピンドル（ 図2C）を示しました 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig2.jpg" /> マウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の組織の図2.免疫蛍光分析（A）は 、非特異的siRNAを制御したり、（B、C）特定PCNTのいずれかを注入した卵母細胞の代表的な画像。 -siRNAを。卵母細胞は、一緒に微小管の検出（緑）のための抗アセチル化αチューブリン抗体と抗ペリセントリン（赤）で二重標識しました。 DNAはDAPIで標識され、青色で示されています。挿入図は、紡錘体極の面積の2倍の倍率を示しています。矢印は、ずれの染色体を示します。 *スピンドルポール。鉛：第一極体。 10μmのスケールバー。この図は、馬とViveiros、2014年7から変更されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53586/53586fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> MEM。すべての試薬 ​​のリストとMEMの250ミリリットルを準備するために必要な特定の量の調製のための表1のレシピ 。メディアフィルター0.45μmの酢酸セルロース（CA）、膜フィルターユニットを使用して滅菌し、7日、最大4℃で保存します。 <table border="0"><tbody><tr><td> 化学的な </td><td> Amounトン</td></tr><tr><td>アールの平衡塩溶液（10倍） </td><td> 25ミリリットル</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td> 0.550グラム</td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td> 0.0063グラム</td></tr><tr><td>ペニシリンG </td><td> 0.0188グラム</td></tr><tr><td>硫酸ストレプトマイシン</td><td> 0.0125グラム</td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td> 0.073グラム</td></tr><tr><td> EDTA、二ナトリウム塩二水和物</td><td> 0.1ミリグラム</td></tr><tr><td>必須アミノ酸（50X） </td><td> 5.0ミリリットル</td></tr><tr><td> MEMビタミン混合物（100X） </td><td> 2.5ミリリットル</td></tr><tr><td>フェノールレッド溶液</td><td> 0.2ミリリットル</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td> 0.75グラム</td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing at JoVE.com

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K ビュー.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia. ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。 

ビデオ: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

遺伝学

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

ヒト卵成熟度評価とその臨床応用

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

発生生物学

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at prophase I of the first meiotic division. After puberty and upon meiotic resumption, the nuclear membrane disassembles (nuclear envelope breakdown), and the spindle is assembled mainly at the oocyte center. Initial central spindle positioning is essential to protect against abnormal kinetochore-microtubule (MT) attachments and aneuploidy. The centrally positioned spindle migrates in a time-sensitive manner toward the cortex, and this is a necessary process to extrude a tiny polar body. In mitotic cells, spindle positioning relies on the interaction between centrosome-mediated astral MTs and the cell cortex. On the contrary, mouse oocytes lack classic centrosomes and, instead, contain numerous acentriolar MT organizing centers (MTOCs). At the metaphase I stage, mouse oocytes have two different sets of MTOCs: (1) MTOCs that are clustered and sorted to assemble spindle poles (polar MTOCs), and (2) metaphase cytoplasmic MTOCs (mcMTOCs) that remain in the cytoplasm and do not contribute directly to spindle formation but play a crucial role in regulating spindle positioning and timely spindle migration. Here, a multi-photon laser ablation method is described to selectively deplete endogenously labeled mcMTOCs in oocytes collected from Cep192-eGfp reporter mice. This method contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying spindle positioning and migration in mammalian oocytes.

An optimized protocol is presented that enables the depletion of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes during metaphase I using a near-infrared femtosecond laser.

マウス卵母細胞における細胞質微小管組織化中心の多光子レーザーアブレーション

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

マウスの前期停止卵子におけるDNA損傷の同定

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

著者スポットライト:哺乳類の卵母細胞および着床前胚におけるDNA損傷応答の理解 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

要約

さらに動画を探す

この動画の章

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

ヒト卵成熟度評価とその臨床応用

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

マウス卵母細胞における細胞質微小管組織化中心の多光子レーザーアブレーション

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価