This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.

試験材料の調製注：試験のためにバイオチップを調製するために、RTgill-W1細胞のいくつかのコンフルエントなフラスコを準備する必要があります。 16バイオチップを播種するために必要なフラスコの数の良好な推定値は、1コンフルエントT175フラスコです。 <ol><li>無菌技術を使用して、クラスII生物学的安全キャビネット（biohood）で次の手順を実行します。 biohoodとフードに配置された任意の材料を消毒するために70％エタノールを使用してください。 <ol><li>フィブロネクチン1mgのバイアルを解凍および10μg/ mlの濃度のために滅菌L-15培地100mlに希釈することにより、流体バイオチップのためのフィブロネクチン基板を準備します。 -20℃での滅菌50mlコニカルポリプロピレンチューブ中の40ミリリットルずつフリーズします。バイオチップを播種する数時間前に室温で解凍します。解凍したら、再冷凍しないでください。 </li><li> 200mMの5mlのL-アラニル-L-グルタミン（商標）、ウシ胎児血清を50mlを添加することにより、細胞培養培地を準備plement、およびL-15培地を500mlのペニシリン/ストレプトマイシン溶液5ml（10,000単位のペニシリン/ mlの10,000μgのストレプトマイシン/ ml）のストック。これは、9％の血清を含む細胞培養培地560 mlで得られます。冷蔵。 注：これは、培養フラスコ及びバイオチップに使用される完全な細胞培養培地となります。 </li></ol></li><li>粉末培地バイアル<ol><li>事前に自動化された粉末ディスペンサーを使用して、L-15ex粉末の0.5％±60 mgの0.1ドラムスナップキャップバイアルを準備します。再封可能な金属化ポリ袋に粉末が分配された日付とバイアル及び（50の量で）冷蔵バイアルにラベルを付けます。 3 1グラムのシリカゲル乾燥パックを含む各。 注：L-15ex粉末培地バイアルは検査の前に行われ、最大9ヶ月間保存することができます。 </li></ol></li><li>脱イオン（DI）水を用いて家庭用漂白剤を希釈することにより100ミリリットル20％の漂白剤の溶液を作ります。漂白溶液の5mlを各双方向に必要とされることが推定ochip。 </li><li>オートクレーブ可能な生体適合性チューブの27ミリメートルのセクション（播種される各バイオチップ用の2つのセクション）を切断することにより、バイオチップチューブアセンブリを作成し、ポリカーボネートスリップルアー継手とチューブの両端にフィット。 134℃で8分間オートクレーブ滅菌袋とオートクレーブ内チューブアセンブリを配置します。同じ設定で別々の袋にもオートクレーブバイオチッププラグ（バイオチップあたり2）。 </li><li> °C at121 30分間オートクレーブDI水。 注：この水は、播種後、バイオチップを洗浄するために使用されます。 10ミリリットルは、各バイオチップのために必要とされるであろうと推定しています。 注意：それぞれのバイオチップのチャネルの実際の体積を2mlであるが、滅菌水5mlを漂白溶液を除去した後、各チャネルを介して洗浄されます。 </li><li>生体適合性チューブの27ミリメートルのセクションを切断し、チューブの両端にオス型スリップルアー継手を取り付けることにより、シリンジ注入管アセンブリを作成します。 134＆で8分間、紙ヒートシール殺菌パウチオートクレーブ内チューブアセンブリを配置します＃176; C。 </li></ol> 2.流体バイオチップの播種手順注：バイオチップやメディアは、無菌技術を使用して、クラスII生物学的安全キャビネット内で処理されているすべての手順を実行します。 <ol><li>前にスケジュール播種に二十四時間、滅菌プラスチック製計器ケースでbiohood、所定の位置に、メーカーのパッケージからバイオチップを取り外します。 </li><li>次のように20％漂白剤溶液を用いてバイオチップを滅菌 注意：歴史的には、この漂白手順は、製造業者によって行わバイオチップのプラズマ滅菌が有効でなかったことをイベントでは、長期保存中にバイオチップ内の真菌の増殖を防いでいます。 <ol><li> 20ミリリットル注射器注入管との無菌注射器アセンブリ取り付けられbiohoodで作業を使用して、バイオチップの各チャンネルに20％の漂白剤溶液の2ミリリットルを注入。バイオチップは、漂白剤溶液で1時間静置します。 </li><li> 1時間、真空ASP後真空吸引管に取り付けられた雄性不稔スリップルアーアセンブリを使用して、両方のチャネルからの怒りの漂白剤溶液。バイオチップをすすぎ時にドレインとしてバイオチップチューブアセンブリのいずれかを使用します。 </li><li>無菌注射器注入アセンブリに取り付けられた滅菌20ミリリットル注射器を使用して、余分な水がbiohoodで容器に排出することができ、滅菌水5mlでチップの各チャンネルをフラッシュします。それからちょうど漂白剤について記載され、プラスチック機器の例に戻ってバイオチップを配置し、次の日に細胞を播種するまでbiohoodに残すように水をオフ真空吸引。 </li></ol></li><li>バイオチップを播種する前に六十分は、バイオチップの各チャンネルには10μg/ mlのフィブロネクチン溶液2mlを注入します。 60分間biohoodにバイオチップのままにして、（ステップ2.2.3で説明したように）その後、細胞をバイオチップを播種する前に、フィブロネクチンから吸引真空。を参照してください（無菌のバイオチップチューブアセンブリの2セクションを配置バイオチップのポート上のセクション1.4）。 </li><li>アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）製品説明シート16で概説した手順を使用して、すべての16のバイオチップのための1つのコンフルエントRTgill-W1 T175フラスコをトリプシン処理。 <ol><li>細胞のコンフルエントなフラスコ（複数可）からメディアを吸引除去。 </li><li> PBSの15ミリリットルと細胞層を洗浄した後、吸引します。 </li><li>各T175フラスコ中の細胞層にトリプシン/ EDTAの6ミリリットルを加え、細胞を〜5分間トリプシン処理することを可能にします。 </li><li>トリプシン処理を停止するために各フラスコへの完全なL-15細胞培養培地の15 mLを加え。 </li><li>無菌の使い捨て容器に細胞懸濁液を兼ね備えています。 注：コンテナのサイズを播種されるバイオチップの数に依存し、150〜500ミリリットルから変化させることができます。細胞懸濁液5mlをバイオチップごとに必要とされるであろうと推定しています。 </li></ol></li><li>計数のためにマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液と場所の〜1ミリリットルを削除します。 10X objectiと明視野顕微鏡を使用してVEのと血球計数器は、細胞の10μlのアリコートを計数し、2.5×10 5細胞/ mlの細胞懸濁液を得るために必要な完全なL-15細胞培養培地の体積を計算します。 注意：文化を継続するフラスコに播種するために、細胞懸濁液を使用している場合、これがそうする点であろう。完全なL-15の細胞培養培地を用いて細胞懸濁液の濃度を調整します。 </li><li>バイオチップの各チャンネルの外側ポートに細胞懸濁液2.5ミリリットルを注入し、滅菌シリンジ注入管アセンブリ（セクション1.6を参照）にsyringeattached滅菌20ミリリットルを使用して（ すなわち 、添付のチューブを持っていないポート）、余分な細胞懸濁液の一部はbiohood廃棄物容器にチューブから流出することを可能にします。 注：これは、チャンネル全体および取り付けられたチューブは、細胞懸濁液の完全なことを確実にするでしょう。 <ol><li>ルアーfittiとホースの自由端部を挿入することにより、各バイオチップのチャネルのための囲まれたループを作成します。各チャンネルの外側ポートにngの。 </li><li> 70％エタノールで湿らせたペーパータオルで、閉じたループのオフに余分なメディアを拭き、20℃のインキュベーターに戻ってプラスチック製のボックスにバイオチップを配置します。各バイオチップに固有の識別番号を付けます。 </li></ol></li><li>日4及び7に、20℃のインキュベーターからバイオチップを除去し、温度平衡に完全なL-15を有するバイオチップのすべての細胞培養培地で培地を補充します。使用を除くステップ2.6だけではなく、L-15細胞培養培地（無細胞懸濁液）と同じ手順に従ってください。 4日目給餌した後、20℃のインキュベーターにバイオチップをバックに置きます。 <ol><li> 7日目給餌した後、削除して、チップからホースを破棄し、バイオチップでオートクレーブ処理ドレンプラグを挿入します。 </li><li>テストのために使用するまで6℃のインキュベーター中ボックスにバイオチップを置きます。 注：チップは、最大9ヶ月間冷蔵温度で保存し、テスト私のためにまだ生存していることができますnはECISリーダー。 </li></ol></li></ol>バイオチップ3.留学生センターのテスト<ol><li>使用している場合は、試験化学物質を準備します。 （参照ブレナンら 、試験化学物質の製造のための2012年7）。 </li><li>キャリングケースからECISリーダーと試験装置を取り外します。 6℃のインキュベーターから準備されたバイオチップを削除します。ペーパータオル上でバイオチップを置きます。 ECISリーダーをオンにします。 </li><li> 10ミリリットル注射器を使用して、標識された0.5オンス透明なプラスチックの試験ジャーにラベルされた0.5オンス透明なプラスチック制御ジャーと試験サンプルの10ミリリットルに制御10mlの水を分配します。 注：1）正確な測定のための気泡を除去するようにしてください。 2）注射器や瓶は、色分けされています。テストのための制御や赤青。 </li><li>ホイル袋から2粉末培地バイアルを取り外します。粉末培地バイアルの1を開きます（必要に応じて多目的ツールを使用）および対照水でジャーに1バイアルの全内容を注ぎ、に全体バイアルを落とします解決策としても。試験瓶に、この手順を繰り返します。キャップとは、粉末が溶解していることを確認するためにjarファイルを横に振ります。 </li><li>それぞれのバイアルからの制御（青シリンジ）またはテスト（赤シリンジ）のいずれかのソリューションの9ミリリットルで着色された10ミリリットル注射器のそれぞれを埋めます。シリンジから気泡を除去。 </li><li>バイオチップポートからプラグを取り外し、ドレインを接続します。 </li><li> ECISリーダーに取り外し可能なプラスチック製のトレイにバイオチップを置き、ふたを閉じます。 </li><li>外側のバイオチップポートに充填された注射器を取り付け、シリンジプランジャを取り付けます。 </li><li>メイン画面で、「次へ」を選択プレテストを開始します。 注意：Readerソフトウェアは、インピーダンスをチェックします。インピーダンスは（通常は1,000〜3,000オームの間で）ユーザが設定した範囲内にある場合は、画面を図3に示すように、「カートリッジが合格」し、ユーザに指示し、「次へ」を選択すると、ソフトウェア）は3.10に進みます登録されます。インピーダンスは内でない場合なぜなら、不良バイオチップまたは（通常起因する電極の位置ずれに）読者へのバイオチップの接続不良の設定範囲は、画面は「カートリッジに失敗しました」に登録され、ユーザが「中止」するいずれかのオプションを持っていますかテスト」を確認してください」。 <ol><li> ）3.9のステップに戻って「中止」を選択します。 「確認」を選択し「カートリッジが合格」メッセージを受信し、「次へ」を選択した後）3.10に進みます。 注：これは、バイオチップを取り出し、視覚的欠陥やメッセージは、新しいバイオチップに進む前に、受信された「カートリッジが失敗しました」場合に漏洩するためにそれを検査することをお勧めします。 </li></ol></li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" /> 図3：許容可能なインピーダンスの読みを持つバイオチップのECISリーダースクリーンショットスクリーンショット4コのそれぞれのオームでの初期インピーダンスの測定値を示しています。ntrol電極（CE）と流体バイオチップ内の4試験試料電極（SE）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="10"><li>読者にメッセージが表示されたら、ソフトキーボードを使用してサンプル情報を入力し、完了したら「同意する」を選択します。 注：ECISリーダーソフトウェアが自動的に日付、時刻、ユーザによって入力された他の情報と各データセットをスタンプします。このようなバイオチップの数、及び化学濃度の種類として。インピーダンスデータの二分は、挿入されたバイオチップから収集され、画面上のタイマーがカウントダウンする時間を。 </li><li>赤い箱の中に点滅している画面上の指示によりメッセージが表示されたら、2分後、「次へ」を押してください。点滅する緑色のボックスが表示されたら、「今すぐサンプルを注入し、「バイオチップchannに同時に取り付けられた注射器からの制御およびテストメディアを注入しますELS。終了したら、バイオチップ上の所定の位置に注射器を残します。 注意：インピーダンス値は60分間1分間に1回収集されます。 ECISリーダーソフトウェアは、処理チャンネルは、試験開始後10分および60分の間の任意の点で制御チャネルと統計的に異なっていると判断した場合は、画面上の表示は、サンプルが「汚染」されていることを示します。治療は、制御チャネルとは異なるされていない場合は、画面には、テスト実行の最後にある「検出なし汚染」と表示しません。 </li><li>汚染されたかどうかなどの記録テスト結果は、各試料について、汚染します。 </li><li>テスト実行の終わりには、バイオチップを取り外して廃棄します。テスト中にバイオチップを収容された注射器、試験バイアルおよび取り外し可能なプラスチック製のトレイをすすぎ、空気乾燥させます。 注：ECISリーダーは、オンボードのオペレーショナル・ソフトウェア用のストレージ、制御モデルとテストを実行してから、生成されたテストファイルの4ギガバイトを持っています。これは、いくつかの目を可能にしますousandテストファイルは、読者に格納されます。所望であれば、ファイルは、USBジャンプドライブで取得し、研究目的のために更なる分析のためにコンピュータに転送することができます。 </li></ol>

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Opinions, interpretations, conclusions, and recommendations are those of the authors and are not necessarily endorsed by the U.S. Army. Citations of commercial organizations or trade names in this report do not constitute an official Department of the Army endorsement or approval of the products or services of these organizations. Authors Linda M. Brennan and Mark W. Widder, both of the US Army Center for Environmental Health Research, declare that they have no competing financial interests. Michael Mayo, Michael McAleer and Alex Greis are employees of Nanohmics that produces the disposable biochips and instruments used in this Article.10251980

ECIS技術は、実験室の設定でよく行われ、人間の健康に関連のある濃度での潜在的な水の汚染物質を検出することができました。技術の移植性とパッケージングは​​、現場での使用にそれを助長させます。 次のように技術の成功のためのプロトコルにおける重要なステップは次のとおりです。1）、文化、播種、及びバイオチップの供給中に無菌状態を維持2）RTgill-W1細胞ので、テストのための準備ができるまで冷蔵条件でシードされたバイオチップをキープ非常に長い彼らは25℃以上の温度にさらされている後に生存しないであろう、3）正確粉末培地バイアル中にL-15exを比較検討し、正確でシフトによって引き起こされる可能性が偽陽性を、生産避けるために、水試料を測定メディアではなく、サンプル毒性の浸透圧は、4）テストを実行するためのECIS画面上でユーザの指示に従ってください。双場合、読者のソフトウェアがユーザーに警告しますバイオチップは、第一のリーダに挿入されたときochipは（初期インピーダンスの読みに基づいて）テストのために受け入れられません。インピーダンス・レベルはテストのために受け入れられない場合、ソフトウェアは、新たなバイオチップが使用されるまで、ユーザーがテストを続行することはできません。容認できないインピーダンス測定値の理由は、通常、ECISリーダーピンまたはバイオチップの接着縁部の一方に沿って流体漏れを持つバイオチップの電極のわずかな位置ずれによるものです。 ECISセンサーのみが飲料水でテストされず、表面水とされているため、この技術にはいくつかの制限があります。バイオチップ上にあるRTgill-W1細胞は長期間凍結またははるかに25℃以上の温度に耐えることができない（時間枠は、時間から温度に依存日にすることができます。バイオチップは、冷蔵への温度範囲で最高の機能室温7。彼らは右のRされた後、しかし、すぐに使用できる状態にあります低温貯蔵からemoved。ポータブル保冷容器は現在、温度感受性の供給のためのフィールドに陸軍担当者によって使用されています。これらの同じ容器は播種バイオチップの輸送のために使用することができます。 この技術に対する別の制限は、それが広帯域毒性センサーであっても、それはそのようないくつかの農薬などのコリンエステラーゼ阻害する化合物を、すべての場合、十分に応答しないということです。この機能のギャップを埋めるために、ECISセンサは、毒性試験のより広い範囲をユーザに提供するために、水試料を試験する場合、市販の迅速な農薬試験アッセイと組み合わせて使用​​するように設計されています。キットには、30分以内に有機リンおよびカルバメート系農薬を検出するように設計された迅速な酵素アッセイです。 アルセン、現在検出するために軍事予防医学の人員によって使用されるフ​​ィールドの水試験システム、 - ECISセンサはWQAS-PM（予防医学水質分析システム）を補完します飲料水試料中のIC、鉛、またはシアン。 ECISセンサは汚染物質が何であるかを特定しないであろうが、特定の金属または有機化合物が存在する場合、その水は人間の消費に適していないかもしれないことを示す、示します。 ECISのテスト結果は、時間内にご利用いただけます。陽性の検査結果がある場合、水試料は、次に、汚染物質を同定するためのさらなる分析のために送信することができます。 上述したように、ECISリーダは、異物検出の広いスペクトルをカバーするために、別個の酵素ACEキットを含むシステムの一部であるように設計されています。これらの読者の両方が兵士によって、フィールドでの使用のためのフィールドの輸送のための頑丈なケースにパッケージされています。

全体的な目標は、ECISバイオセンサーにおける細胞播種、ストレージおよび流体バイオチップのテストのための方法を開発することでした。このバイオセンサーの開発のための目標は、兵士によって使用されている飲料水供給の汚染の可能性を検出できるフィールドポータブルデバイス用の米軍仕様に適合することがありました。毒性センサーのための要件は、デバイスが、フィールド・ポータブルであること、それは、人間の健康に関連する濃度で（時間以内）急速に有害産業化合物の広いスペクトルを検出することができ、および生物学的成分は、の貯蔵寿命を有することがありました少なくとも9ヶ月。傷みやすい部品の冷凍が、冷凍ではないが、許容できるものでした。 歴史的には、（そのような抗体、酵素、または核酸など）、それらの生物学的成分を持つフィールドポータブル水の検査技術は、検体特異1-3となっています。バイオセンサーのこのタイプの欠点は、ONLことですYは、一度に化学物質の一種を検出します。複数の化学物質が存在することが疑われる場合、複数のセンサが必要とされています。特定のセンサがテストレパートリーにない場合は、水中での化学汚染物質が容易に検出されない可能性があります。 広範な毒性センサが、一方、この技術のギャップを埋める可能性があります。これらは通常、それら4-8に細胞成分を持っています。広範な毒性のバイオセンサの利点は、彼らは時間5,9,10の比較的短い期間で、混合物および未知数を含む化学汚染物質の広い配列の存在を検出することができるということです。 また、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）として知られている可能性のある毒性センサー、のような細胞単層の電気インピーダンスの測定を使用する概念は、最初イェーヴァー及びKeese 11で説明しました。過去20年間では、細胞viabの敏感な指標であることが示されていますilityと細胞毒性。基本的には、バイオチップ上の電極に接着されている細胞単層は、高周波と低電圧とアンペア数交流信号にさらされます。細胞のコンフルエントな単層が電子の流れを妨げます。細胞単層の完全性（例えば、有毒な化学物質を導入する場合のように）危険にさらされたとき、ECISセンサは、電気インピーダンスの変化を記録する11-14。 図1は、バイオチップ上の細胞単層に対してECISの原理を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" /> 図1：単純化ECISリーダー電気回路図とバイオチップ上の細胞単層のECISイラストの原理 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 12記載ECISセンサ技術で使用されました。それらは、頻繁なメディアの変更を必要と限られた貯蔵寿命を有し、人工的なCO 2環境下、37℃のインキュベーション温度を必要とするので、これらの細胞は、しかしながら、現場での使用には実用的ではなかったです。これは、ニジマスの鰓上皮細胞（RTgill W-1細胞）由来の市販の細胞株は、周囲CO 2で、室温で試験することができることが発見された、バイオチップにおけるコンフルエントな単層を形成し、冷蔵温度で保存することができヒトの健康12に関連する濃度での化学物質の広範囲に迅速な応答（1時間以下）でした。毒物学で、だけでなく、基礎研究におけるRTgill-W1細胞のアプリケーションは、Leeらによって検討されている。15 播種、ストレージ、および含む流体バイオチップのテストのための方法ECISのバイオセンサーにおける流体バイオチップ上のRTgill-W1の細胞の単層は、ここで説明されています。流体バイオチップは、冷蔵状態で最長9ヶ月間保存することができ、別々に出荷され、飲料水のsupplies.The伴うECISリーダー、または試験ユニットの試験のために、冷蔵コンテナで出荷することができます。バイオチップは、彼らに二つの成分を持っています。二つの別々の流体チャネル、およびインピーダンスセンシング用のチャネル毎に4つの電極パッ​​ドを含んで、下部電子層と上部ポリカーボネート層。パッドごとに10の作用電極があります。各電極は直径250μmです。組み立てられたバイオチップは、ECISテスト部に挿入されたときのインピーダンス測定値を取得するための金電極接続を有します。 2囲まれた流体のU字型チャネルの各々はRTgill-W1細胞懸濁液2mlのホールド2は、単一の感知電極上のコンフルエント細胞の倍率ECISリーダで流体バイオチップを示します。 図2：ECIS Readerで流体バイオチップからの拡大エリアは、単一の検知電極上RTgill-W1細胞のコンフルエントな単層を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td><td>16000-085</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).</td></tr><tr><td>Fibronectin, bovine plasma</td><td>EMD Millipore Corp.&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.emdmillipore.com&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>341631-1 mg</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 &amp;#956;g/ml and freeze @ -20 &amp;deg;C in aliquots. Use as substrate for biochips.</td></tr><tr><td>L-15 media without L-glutamine</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>12-700F</td><td>Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-15ex powdered media with phenol red</td><td>US Biological&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.usbio.net</td><td>L1501</td><td>Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 &amp;deg;C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips.</td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; or Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-516F</td><td>Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>CC-5012</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T175 culture flasks</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>12-565-30</td><td>Used for culturing RTgill-W1 cells.</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Chlorox&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.chlorox.com</td><td></td><td>Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.</td></tr><tr><td>70% ethyl alcohol</td><td></td><td></td><td>For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.</td></tr><tr><td>Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)&amp;nbsp;</td><td>American Type Tissue Culture Collection&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.atcc.org</td><td>CRL-2523</td><td>Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>35050-061</td><td>Store at room temperature.&amp;nbsp; Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).</td></tr><tr><td>Penn/Strep Stock 10K/10K</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-602E</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).</td></tr><tr><td>Pharmed BPT tubing</td><td>U.S. Plastic Corp.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.usplastic.com</td><td>57317</td><td>Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.</td></tr><tr><td>Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies</td><td>Value Plastics&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>MTLS210-9</td><td>Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.</td></tr><tr><td>20 ml syringes, slip-tip</td><td>VWR Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; us.vwr.com</td><td>BD302831</td><td>Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.</td></tr><tr><td>0.1 dram snap-cap polypropylene microvials</td><td>Bottles Jars and Tubes, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.bottlesjarsandtubes.com</td><td>30600</td><td>Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.</td></tr><tr><td>60 mil Lexan fluidic ECIS biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.</td></tr><tr><td>Autoclavable Plastic Instrument Box&lt;br/&gt; 17 1/2&quot; x 7 3/4&quot; x 2 3/8&quot;</td><td>Medi-Dose EPS&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; medidose.com</td><td>IB701</td><td>Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paper heat-seal sterilization pouches, 7 &amp;frac12;&amp;rdquo; x 13&amp;rdquo;</td><td>CardinalHealth&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.cardinalhealth.com</td><td>90713</td><td>Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.</td></tr><tr><td>Quantos automated powder dispenser</td><td>Mettler Toledo&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.mt.com</td><td>QB5</td><td>Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.</td></tr><tr><td>ECIS reader</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.</td></tr><tr><td>3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags</td><td>Uline&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.uline.com</td><td>S-16893</td><td>Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.</td></tr><tr><td>Leatherman squirt ps4</td><td>Amazon&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.Amazon.com</td><td></td><td>Used to open powdered media vials.</td></tr><tr><td>1 g silica gel desiccant packets&amp;nbsp;</td><td>Uline&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.uline.com</td><td>S-3902</td><td>Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.</td></tr><tr><td>Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>09-740-25C or E</td><td>Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.</td></tr><tr><td>Plugs for biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Drains for ECIS biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader.&amp;nbsp; Allows for excess media to drain from channels during test injections.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>S17040</td><td>Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.</td></tr><tr><td>Brightfield microscope w/ 10X objective</td><td>Leitz Labovert</td><td></td><td>Any brightfield microscope is acceptable.</td></tr><tr><td>Class II biological safety cabinet</td><td></td><td></td><td>Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 0.6 ml</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>02-681-311</td><td>Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells.</td></tr><tr><td>Slip 10 cc red syringes</td><td>Procedure Products, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-R</td><td>Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip.</td></tr><tr><td>Slip 10 cc blue syringes</td><td>Procedure Products, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-B</td><td>Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip.</td></tr><tr><td>&amp;frac12; oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps</td><td>SKS Bottle &amp;amp; Packaging, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.sks-bottle.com</td><td>0605-30</td><td>Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing.</td></tr><tr><td>50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.fishersci.com</td><td>12-565-269</td><td>Used to hold 40 ml aliquots of 10 &amp;#956;g/ml fibronectin at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test</td><td>ANP Technologies, Inc.&lt;br/&gt;www.anptinc.com</td><td>ACE-400</td><td>Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water</td></tr></tbody></table>

preparation and testing of impedance-based fluidic biochips with rtgill-w1 cells for rapid evaluation of drinking water samples for toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

このホワイトペーパーで説明ECIS技術は、米国環境保護庁（USEPA）で検査を受けた技術のテストと評価プログラム（TTEPを）〜後援の。サーティーン化学物質は、飲料水の可能な汚染物質であり得る有毒産業化合物の広範囲の代表として、試験のために選択しました。テスト中、13の9は、8人の健康に関連のある濃度で、時間内にECISによって検出した。 表1は 、この汚染物質の試験の結果を示す。 図4を 「汚染された」結果は上のように見えるであろうものの代表でありますECISリーダー画面。ほとんどの場合、携帯インピーダンスは、対照と比較して、汚染されたサンプルの減少となりました。時折、特定の化合物は、インピーダンスの増加を引き起こす可能性があります。 また、 表1にまとめました</strong&gt;きれいな水のテストです。 「検出なし汚染」の代表的なスクリーンショットのために（ 図5を参照）フォーティきれいな水のサンプルが実行されたと全く汚染はサンプルのいずれにおいても検出されませんでした。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" /> 図4：「汚染」水試料のECISリーダースクリーンショット汚染された水試料からの正規化インピーダンスのグラフィックと結果の例。。青い線は、制御電極のそれぞれの正規化されたインピーダンスを表します。赤い線は、試験試料電極のそれぞれの正規化インピーダンスを表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" /> 図5：「いいえ汚染が検出されない「水のサンプルのECISリーダースクリーンショット汚染されていなかった水試料からの正規化インピーダンスのグラフィックと結果の例。。青い線は、制御電極のそれぞれの正規化されたインピーダンスを表します。赤い線は、試験試料電極のそれぞれの正規化インピーダンスを表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>カテゴリー</td><td>汚染物質</td><td colspan="3">濃度テスト済み（mg / Lで）1 </td><td colspan="2">検出さ≤1時間 n = 4/4チップ</td></tr><tr><td rowspan="8">農薬</td><td>アルジカルブ</td><td colspan="3"> 0.17 </td><td colspan="2">いいえ</td></tr><tr><td>アルセン<html> IC（亜ヒ酸ナトリウム） </td><td colspan="3"> 4.5 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>アジド（アジ化ナトリウム） </td><td colspan="3"> 46.​​7 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>フェナミホス</td><td colspan="3"> 0.56 </td><td colspan="2">いいえ</td></tr><tr><td>メタミドホス</td><td colspan="3"> 1.4 </td><td colspan="2">いいえ</td></tr><tr><td>メチルパラチオン</td><td colspan="3"> 33.6 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>パラコート（二塩化） </td><td colspan="3"> 4.6 </td><td colspan="2">いいえ</td></tr><tr><td> Pentachlorophenate（ナトリウム） </td><td colspan="3"> 71.9 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td rowspan="5">工業化学物質</td><td>アンモニア</td><td colspan="3"> 924 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>銅（銅II硫酸） </td><td colspan="3"> 103 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>シアン化物（ナトリウム） </td>3 &quot;&gt; 14 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>マーキュリー（塩化） </td><td colspan="3"> 24.7 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>トルエン</td><td colspan="3"> 444 </td><td colspan="2">はい</td></tr><tr><td>きれいな水2 </td><td>なし</td><td colspan="3"> NA </td><td colspan="2">いいえ</td></tr><tr><td colspan="7">テストした1濃度はらヴィーダーによる原稿と同じです。 （2014年）。 </td></tr><tr><td colspan="7"> 2 40きれいな水のサンプルが汚染を含んでいない実行しました。 </td></tr></tbody></table> 表1：ECISで検出水試料中の汚染物質。

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Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

毒性のための飲料水試料の迅速な評価のためのRTgill-W1細胞とのインピーダンスベースの流体バイオチップの製造および試験

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

9.0K ビュー.  U.S. Army Center for Environmental Health Research. This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described. 

ビデオ: Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability to provide more dynamic information about cells under physiological conditions than classical biochemical assays, this label-free real-time cell assay based on the electric impedance principle is attracting more attention during the past decade. However, its practical utilization may be limited due to the relatively expensive cost of measurement, in which costly consumable disposable gold microchips are used for the cell analyzer. In this protocol, we have developed a general strategy to regenerate arrayed gold microelectrodes equipped for a commercial label-free cell analyzer. The regeneration process includes trypsin digestion, rinsing with ethanol and water, and a spinning step. The proposed method has been tested and shown to be effective for the regeneration and repeated usage of commercial electronic plates at least three times, which will help researchers save on the high running cost of real-time cell assays.

This protocol describes a general strategy to regenerate commercial arrayed gold microelectrodes equipped for a label-free cell analyzer aimed at saving on the high running costs ofmicrochip-based assays. The regeneration process includes trypsin digestion, rinsing with ethanol and water, and a spinning step, which enables repeated usage of microchips.

リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

生化学

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

神経科学

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

生物工学

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

ドライ フィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオ プラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

電気セル基板センシングによるMOFによる細胞挙動変化の評価

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

著者スポットライト:金属有機フレームワークに対するヒト肺上皮細胞の応答評価の進歩 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

毒性のための飲料水試料の迅速な評価のためのRTgill-W1細胞とのインピーダンスベースの流体バイオチップの製造および試験

要約

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リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

ドライフィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオプラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング

有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング

毒性のための飲料水試料の迅速な評価のためのRTgill-W1細胞とのインピーダンスベースの流体バイオチップの製造および試験

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リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

ドライ フィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオ プラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング

有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング

ドライフィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオプラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作