This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.

倫理の声明：すべてのこれらの実験は、動物のケアとノッティンガム大学の倫理指針に従ってください。 移植のためのヘパリンビーズの作製<ol><li>使用前に徹底的にPBSにヘパリンビーズを洗ってください。注：ビーズをPBS中のスラリーとして4℃で保存することができます。 <ol><li> 1mlのPBSのドロップに20μlのピペットを用いてストックからそれらを除去することによって、移植のためのビーズを選択します。後、3センチペトリ皿に20μlのPBSのドロップにビーズを転送するために2μlに設定し、マイクロピペットを使用しています。 P2ピペットチップで選択ビーズを転送し、解剖顕微鏡ステレオを使用して、サイ​​ズに基づいてビーズを選択し;直径100μmの周りの人々は理想的です。 </li></ol></li><li>ビーズからPBSを削除します。 20μlのピペットとファイン時計職人の鉗子で毛管作用により残液と液体の大部分を削除します。注：これは、成長事実上のように、可能な限り除去することが重要ですそれがビーズに添加したときrが希釈されていません。 </li><li>ビーズ上に直接成長因子をピペット。 FGF18のために、PBS中の0.1％BSA中に0.5mg / mlで再構成された組換えFGF18の0.5μlを添加します。蒸発から液体を防ぐために、皿の縁の周りに水を数滴を置きます。 </li><li> RTで1時間ビーズをインキュベートします。パスツールピペットで皿から水滴を削除し、移植のための準備ができて氷上に置きます。 </li><li> （透明のビーズのために）必要な場合は、それらを視覚化するために移植する前に、2％のフェノールレッドに4-5のビーズを転送します。胚に転送する前に、PBSですすいでください。 </li></ol>移植のためのAG 1-X2のビーズの調製<ol><li> 0.2 Nギ酸で誘導体化ビーズを使用する前に。 <ol><li>これを行うには、1.5mlの微小管にビーズを転送するために、スパチュラを使用しています。 0.2 Nギ酸の1ミリリットルを追加し、1時間振とうプラットフォーム上で洗います。 </li><li>そして、P1000ピペットでギ酸を除去し、1と交換mlの水。 1時間洗浄し、残りのギ酸を除去するために、6回繰り返します。 </li><li> P1000ピペットを用いて残りの液体を削除し、4℃でビーズを格納します。注：この段階で、すべての残留水を除去する必要はありません。 </li></ol></li><li> 3センチメートルペトリ皿に小さなへらを使用してストックから約5〜10マイクロリットル容量のビーズの小さなペレットを削除し、1mlのDMSOを追加（または薬物を溶媒に溶解させ方）。注意：これは、正しいサイズのものを選択するために、そこから数百のビーズを提供する必要があります。 </li><li>その後、別の3センチメートルシャーレ中の溶媒の20μlの低下に約100μmの直径のビーズを転送するために2μlに設定P2ピペットを使用しています。 </li><li> 20μlのピペットと2μlのピペットを用いて任意の残留溶媒で溶媒を除去。適用される薬剤20μlを交換してください。 注：整合性（またはこれまでに溶媒が使用される）DMSO中の100μMの濃度で薬物を溶解するために、いくつかの小分子阻害剤として-80℃で20μLとストアへのアリコートは不安定であり、それを繰り返し凍結融解を回避するのが最善です。必要な場合は、ビーズを浸漬する前に、所望の濃度に薬剤を希釈します。有効濃度は、各薬物のために経験的に決定する必要があるかもしれません。 </li><li> 1時間インキュベートします。これらの分子の多くは光感受性であるため、光から保護します。 </li><li>水に溶解した2％のフェノールレッドを20μlに2μlに設定P2ピペットで転送4-5ビーズを移植する前に。ビーズを可視化するために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してこの手順を実行します。ファイン時計職人鉗子を持つ単一のビーズまたはワイヤループを削除し、胚に転送する前に、PBSですすいでください。これは活性の損失の原因となりますので、使用前に15分以上の場合は2％のフェノールレッド中のビーズを放置しないでください。 </li></ol> 3.準備タングステン針<ol><li> 3〜4cmのウェル長さに微タングステン線をカットします。の終わりに、ワイヤの一枚を挿入ガラスパスツールピペットや位置に固定するためにブンゼンバーナーで溶融。彼らが使用中に破損している場合、スペアがあることを確認するために10針まで準備します。 </li><li>ジェット機炎にワイヤの端部を配置し、（2〜3分程度）タングステンが白色に点灯し、先端が鋭利になるまでそこにそれを保持します。注：必要に応じて、使用中に針を洗浄することができ、ジェット機で再先鋭化。 注：これらの針はまた、ビーズを転送するためのループを作るために使用することができます。静かにベンチに針に触れ、それがループを形成するように曲げます。 </li></ol>ビーズ移植片のための胚の準備4 <ol><li>それらは所望の段階（ほとんどの肢芽の操作のための3〜5日）に達するまで、平滑末端を上にして卵をインキュベートします。鈍鉗子を使用すると、殻を破ると、シェルを削除し、胚を露出するために鉗子を使用するように平滑末端をタップします。卵殻膜も除去されることを確認します。 注：PBS 1-2 mlのを支援するためにパスツールピペットで追加することができますこの膜は、卵黄にこだわっている場合。静かに、卵黄の表面にPBSをピペットで卵黄を損傷しないように注意しながら、ピンセットで膜をつかみ、静かに卵から引き出します。 </li><li> 10ミリリットルの注射器と19 G針で卵から卵白を5 mlまで削除します。胚の生存率を減らすことができ、より大きなボリュームの除去などの卵を密封するために使用されるテープに接触しない胚を確保するために必要な分だけの取ります。 </li><li>胚は15 100 Uペニシリンを含むPBS mlのストレプトマイシンおよび0.1mg / mlにアーティスト墨汁の5-6滴を追加する視覚化するため。 0.5-1は直接1mlシリンジ及び25 G針で胚下mlで注入します。 </li><li>脱水しない胚を確保するために、卵子に1％ウシ胎児血清および100 Uペニシリンおよび0.1mgストレプトマイシン/ mlのPBSを2〜3mlのを追加します。先鋭化時計職人鉗子を使用すると、卵黄膜を除去し、開発肢芽の上に羊膜を開きます。胚が乾燥しないことを確認し、、必要に応じて、より多くのPBS / FCSを追加します。 注：肢芽が明らかに胚の脇腹に対になった派生物として見ることができます。これらの段階では胚は、右側が通常最上でオンになります。その結果、それが右の手足にビーズを移植片と反対側のコントロールとして残したものを使用する方が簡単です。 </li><li>ビーズが移植される肢芽の中に切開​​を作るために先鋭化タングステン線を使用してください。若い段階で、これは困難であるが可能な肢芽を介してすべての方法をカットしないでください。 注：古い胚（HHステージ22以上）においては、グラフト化が、肢自体が小さい芽、これはより困難であるより若い段階において肢芽の特定の領域を選択することが可能です。それは肢芽は、ビーズが四肢近位のままになり、特に若い段階で、そのようにグラフトされたビーズを越えて成長することを覚えておくことも重要です。 </li><li>極細WAのいずれかを使用して、成長因子または薬剤のいずれかからビーズをピックアップtchmakers鉗子やタングステン針から作られたループ。ビーズをDMSOまたはフェノールレッドのいずれかに浸漬されている場合は、胚に適用する前にPBSですすぎます。鉗子/ワイヤループで胚にビーズを転送します。その後、切開部にビードを挿入すると、鋭利なタングステン線を使用しています。 </li><li>胚が水和保たれていることを確実に卵にPBS / FCS 1-2 mlを加えたが、これは胚を損傷し、ビーズが脱落する原因となりますので、胚そのものに直接適用することは避けてください。テープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。 </li></ol>

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	<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. 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E., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+signals+from+the+neural+tube,+floor+plate+and+notochord+induce+myogenic+bHLH+gene+expression+in+the+somite.">Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite.</a> Development. 121, 651-660 (1995).</li><li>McGrew, M. 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D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region.">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li><li>Rosello-Diez, A., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulative+patterning+in+limb+bud+transplants+is+induced+by+distalizing+activity+of+apical+ectodermal+ridge+signals+on+host+limb+cells.">Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells.</a> Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).</li><li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing.">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li><li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development.">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li><li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scatter+factor/hepatocyte+growth+factor+(SF/HGF)+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo.">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li><li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts.">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li><li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5.">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li><li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+(beta)-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals.">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li><li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1/2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification.">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li><li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk.">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li><li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension.">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li><li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity.">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li><li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes.">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li><li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos.">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li><li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals.">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).</li><li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors.">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li><li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system:+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem.">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

卵内の組織の開発に直接適用ビーズ移植片の使用は、それらが適用されるときの発達段階と暴露時間を超える圧倒的な制御を与え、開​​発中の増殖因子シグナル伝達の役割を分析するための強力なツールです。 分子の各タイプのビーズの選択は重要です。それは、経験的にこれらのビーズのそれぞれの阻害剤の有効性をテストする必要があるが、このようなここに記載の阻害剤及びレチノイン酸のような小さな疎水性分子は、通常、誘導体化AGによく1-X2ビーズに結合します。同様に、成長因子のためには、ビーズの異なるタイプをテストする必要があるかもしれません。いくつかのビーズは透明であり、そのように操作中に視覚化することは難しいことができますが、PBSですすぎ、続いてフェノールレッドと短い治療は移植を行うのに十分な長さのためにそれらをラベル付けします。 ビーズを調製する場合、特に阻害剤に浸漬されていますSは、できるだけ光から保護することが重要です。彼らの初期治療中および操作中に彼らを覆い、ビーズのみが転送されているときに削除する必要があります。これらの試薬のいくつかは不安定であり、適切に保存されていない場合は誤解を招く負の結果を与えることができるように、それは解凍したてのアリコートを使用するのが最適です。これは、ビーズの有効性を減らすことができ、このよう移植する前に、あまりにも長い間、フェノールレッドに浸し、それらを残していないことも重要です。 成長因子および薬物の両方のこれらのビーズ移植のために使用される濃度は、しばしば非常に高いです。 FGF18ビーズは、しばしば、100μMの濃度で浸漬されている小分子阻害剤のために0.5 mg / mlのビーズ濃度に浸漬されています。これは、典型的には、ビーズによって吸収され、その後、放出された成長因子および薬物の量を直接測定することは難しいが、おそらく属であるため、これが必要である溶液で細胞を処置するために使用される濃度よりもはるかに高いがこのin vivoでのより低いレベルのTE。その結果、濃度の範囲は、有効用量を決定するために使用される各分子のために試験しなければなりません。 開発中に、24体節や、EC培地25として、卵内または培養物中の胚に使用することができるように、この技術はまた、他の組織の広い範囲に適用可能なものです。その後、同じ方法26で発生中の胚に移植することができ、ペレットのような特定の増殖因子を分泌する培養細胞を成長させることも可能です。 アクセシビリティの組み合わせ、操作と低コストの容易さは、ニワトリ胚の開発の優れたモデルになります。トランスジェニック技術はますます鳥類との両方鶏の遺伝的に改変された行に適用されると7とウズラ27は既にデに新たな洞察を提供しているこれらの修正された鳥とグラフト技術古典胚の組み合わせ利用可能になりますvelopment 8,28。

鳥類胚は長年1の開発のための研究のための強力なツールを提供してきました。彼らの最も有用な特徴の1つは、操作が比較的容易であるということです。外部開発は、このような細胞の運命2,3を研究するための古典的なウズラ-ニワトリキメラシステムなどの例を含む様々なmicromanipulationsを胚にアクセスするために卵を開き、実行することが可能となり、開発4,5の間に特定の組織における過剰発現のためのレトロウイルスの注入発達シグナル源6を識別し、移植片培養。さらに最近では、GFPを発現するトランスジェニックニワトリのラインからの移植片とラベルなしホストとの間で発生するキメラは、古典的な移植や遺伝子修飾の組み合わせが開発7,8に重要な洞察を提供することができることを示しています。 鳥類胚を操作することができる容易さはそれを手足を研究するための優れたモデルをしました開発9。 in vivoでの開発手足に特定の成長因子の適用は、四肢のパターニング10,11を変化させ、このプロセス12への洞察を提供し続け因子を同定してきました。このアプローチはまた、筋肉の発達を調節する因子を研究するために使用されており、そのようなのWnt 13、BMPは14およびHGF 15などの多数の信号のための役割を明らかにしました。 最近、この技術は、肢芽に筋原性遺伝子発現を制御する信号を調査するために使用されており、FGF18とレチノイン酸との間の相互作用は、MyoDの発現16のタイミングを制御することができることを示しています。ビーズ上にロードした後、定義された発達段階で特定の組織に直接移植することができる成長因子および小分子の組み合わせを使用することで、開発中のほぼすべての時間と領域に介入する機会を与えてくれます。これはinveするために使用されています体節のパターニング17,18、神経仕様19、神経堤の移行20と軸延長部21を含む多くのプロセスをstigate。 ここでは、鶏の手足の開発に増殖因子または阻害剤のいずれかに浸したビーズを移植する方法について説明します。これは、in situハイブリダイゼーションと筋特異的遺伝子発現を分析することによって筋形成におけるこれらの信号の影響を決定するために使用されてきました。我々は、レチノイン酸または特定のシグナル伝達経路の小分子阻害剤のような小さな疎水性分子のための成長因子、またはAG 1-X2ビーズのために使用されるヘパリン浸したビーズのいずれかを使用して移植片を記載しています。しかし、他のビーズは、22のFGFおよびShhの23の両方を提供するために使用されているにもご利用いただけます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin acrylic beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H5263</td>
			<td>The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X2 beads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>140-1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affi Gel blue beads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301; 153-7302</td>
			<td>These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF18</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-28</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80&#176;C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U0126</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9903</td>
			<td>Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80&#176;C. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMS-493</td>
			<td>Tocris Biosciences</td>
			<td>3509</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80&#176;C. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Indian ink</td>
			<td>Windsor and Newton</td>
			<td>5012572003384 (30ml)</td>
			<td>While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

grafting of beads into developing chicken embryo limbs to identify signal transduction pathways affecting gene expression

ニワトリ胚を使用して直接成長因子または遺伝子発現およびシグナル伝達経路の活性化におけるシグナル伝達経路の特異的阻害剤のいずれかの効果を試験することが可能です。この技術は、特定の時間に正確に定義された発達段階でのシグナル伝達分子の送達を可能にします。この胚を採取し、遺伝子発現は 、in situハイブリダイゼーション、または免疫染色で観察されたシグナル伝達経路の活性化により、例えば、検査することができる後。 U0126、MEK阻害剤に浸し、このFGF18に浸したビデオヘパリンビーズ、AG 1-X2ビーズでは、 卵内肢芽に移植されています。これは、FGF18はMyoDの及びERKのリン酸化の発現を誘導し、誘導された内因性の両方、およびFGF18のMyoD発現がU0126により阻害されることを示しています。レチノイン酸アンタゴニストに浸したビーズは、FGF18によって時期尚早のMyoDの誘導を増強することができます。 このアプローチは、私たちすることができます異なる増殖因子および阻害剤の広い範囲で編、容易に胚内の他の組織に適合されます。

HHステージでは21のMyoDは染色が開発体節（ 図1A）の筋節に見ることができるが、四肢の筋芽細胞の開発に表現されていない。 図1Bは、FGF18ビーズ移植以下のMyoD 6時間in situハイブリダイゼーションを示しています。対側肢では発現がないながらのMyoDは、ビーズの近くに筋芽細胞に誘導されます。 U0126、MEK、のMyoD（ 図1C）のブロックのFGF18誘導の特異的阻害剤に浸したビーズを共同グラフトします。同様にHHステージ21にU0126ビーズを移植し、24時間後のMyoD発現を探している未処理の対側肢（ 図1D、E）と比較してのMyoDの内因性発現を減少させます。 HHステージ19 FGF18での肢芽でのMyoD（ 図1F）を誘発しません。しかし、FGF18に浸したビーズの同時移植とBMS493は、これを克服することができ、異所性のMyoDが検出されたレチノイン酸アンタゴニスト（Figu再1G） 図1Iは、FGF18は、迅速なリン酸化を誘導することを示していることFGF18を確認するために、MEK胚を介して作用すると1時間、ビーズ移植後に回収し、リン酸化ERKのために免疫染色している、MEK。 図1Hの目標は、移植後FGF18ビーズ1時間の明視野像を示します移植されたビーズの周りのERKの。 図1Jは、これらの画像の重ね合わせを示しています。 0.1％BSAに浸漬対照ビーズ（図1K、L、M）ERKリン酸化を誘導しません<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53342/53342fig1.jpg" /> 手足の 図1 のMyoDの発現は、ERKのリン酸化を介して、FGF18とレチノイン酸によって調節されている。HHステージ21で未操作の制御手足は（MyoDの（A）を発現しないが、早期の式は、FGF18ビーズを移植した後、6時間に検出されましたB）。 FGF18とU0126ビーズブロック共グラフトするこの誘導（C）。内因性のMyoD発現は、HHステージ21（D）で見られるが、これはU0126（E）に浸したビーズを移植することによってブロックされています。以前の肢芽に時期尚早のMyoD発現はFGF18（F）によって誘導されないが、FGF18及びレチノイン酸アンタゴニストBMS493（G）に浸し共グラフトビーズによって誘発されます。 、明視野（H）蛍光（I）および抗phosphoERKについて免疫染色HH21肢の（J）の画像をマージ：HH21の手足に移植されたFGF18ビーズは1時間後にERKリン酸化を誘導します。 BSAに浸しコントロールビーズはERKリン酸化を誘導しない：抗phosphoERKについて免疫HH21肢の（K）、蛍光（L）と合併（M）は 、画像。この図は、モクら、2014 16から変更されています。ブラックアスタリスク：ヘパリンビーズ;白ASTEリスク：AG 1-X2ビーズ;矢印は、肢芽における異所性のMyoDの発現を示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53342/53342fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K ビュー.  University of Nottingham. By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

蛍光タンパク質の発現において<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt;未受精卵へのmRNA注入による

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

発生生物学

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

単離されたカエノラブディティス・エレガンス胚ブラストミアと接着剤ポリスチレンビーズを用いた空間細胞接触パターンのインビトロ再構成

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

遺伝子発現に影響を及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト