This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.

Etica Dichiarazione: Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e le linee guida etiche del l&#39;Università di Nottingham. 1. Preparazione di Beads eparina per innesto <ol><li> Lavare accuratamente perle di eparina in PBS prima dell&#39;uso. Nota: Beads possono essere conservati a 4 ° C come una sospensione in PBS. <ol><li> Selezionare perline per innesto rimuovendoli dal magazzino con una pipetta 20 microlitri in una goccia 1 ml di PBS. Quindi utilizzare una micropipetta set a 2 ml di trasferire perle in un calo del 20 microlitri di PBS in una capsula di Petri 3 centimetri. Scegli perline in base alle dimensioni e, utilizzando un impianto stereo dissezione microscopio, trasferire perline selezionati con la punta della pipetta P2; quelli intorno a 100 micron di diametro sono l&#39;ideale. </li></ol></li><li> Rimuovere la PBS dalle perline. Rimuovere la maggior parte del liquido con una pipetta 20 microlitri e il liquido residuo per azione capillare con orologeria pinza sottile. Nota: È importante rimuovere il più possibile così la crescita factor non è diluito quando viene aggiunto ai talloni. </li><li> Pipettare il fattore di crescita direttamente sulle perline. Per FGF18 aggiungere 0,5 ml di FGF18 ricombinante ricostituito a 0,5 mg / ml in 0,1% di BSA in PBS. Mettere alcune gocce di acqua intorno ai bordi del piatto per evitare che il liquido da evaporare. </li><li> Incubare le perline per 1 ora a RT. Rimuovere le gocce d&#39;acqua dal piatto con una pipetta Pasteur e disporli sul ghiaccio pronta per l&#39;innesto. </li><li> In caso di necessità (per perle trasparenti) trasferimento 4-5 perle al 2% rosso fenolo prima di innesto per aiutarli a visualizzare. Risciacquare in PBS prima del trasferimento per l&#39;embrione. </li></ol> 2. Preparazione di AG Beads 1-X2 per innesto <ol><li> Prima dell&#39;uso derivatize perline con 0,2 N di acido formico. <ol><li> Per fare questo uso una spatola per trasferire perline in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml di 0,2 N di acido formico e lavare su una piattaforma di agitazione per 1 ora. </li><li> Quindi rimuovere l&#39;acido formico con una pipetta p1000 e sostituirlo con 1ml di acqua. Lavare per 1 ora e ripetere sei volte per rimuovere residuo acido formico. </li><li> Rimuovere il liquido residuo con una pipetta p1000 e conservare le perline a 4 ° C. Nota: Non è necessario rimuovere tutta l&#39;acqua residua in questa fase. </li></ol></li><li> Rimuovere una piccola pallina di perle di circa il 5-10 volumi microlitri dal magazzino con una piccola spatola in una capsula di Petri 3 centimetri e aggiungere 1 ml di DMSO (o qualsiasi solvente il farmaco è dissolto in). Nota: Questo dovrebbe fornire diverse centinaia di perline da cui selezionare quelli della giusta misura. </li><li> Quindi utilizzare una pipetta P2 impostata su 2 microlitri di trasferire perle di circa 100 micron di diametro per un calo del 20 ml di solvente in un altro piatto di Petri 3 centimetri. </li><li> Rimuovere il solvente con una pipetta 20 microlitri e qualsiasi solvente residuo con una pipetta 2 microlitri. Sostituire con 20 ml di farmaco da applicare. NOTA: Per coerenza sciogliere il farmaco ad una concentrazione di 100 mM in DMSO (o che mai è utilizzato solvente),un&#39;aliquota in 20 microlitri e conservare a -80 ° C, come alcuni piccoli inibitori molecolari sono instabili ed è meglio evitare ripetuti di congelamento-scongelamento. Se necessario diluire il farmaco alla concentrazione desiderata prima di ammollo perline. Concentrazioni efficaci possono avere bisogno di essere determinati empiricamente per ogni farmaco. </li><li> Incubare per 1 ora. Proteggere dalla luce come molti di queste molecole sono sensibile alla luce. </li><li> Prima innesto trasferimento 4-5 perle con una pipetta p2 impostato 2 microlitri in 20 ml di 2% di rosso fenolo disciolti in acqua. Eseguire questo passaggio usando un microscopio da dissezione stereo per visualizzare le perline. Rimuovere una singola goccia di orologiai pinza sottile o un cappio e risciacquare in PBS prima del trasferimento per l&#39;embrione. Non lasciare perline in 2% rosso fenolo per più di 15 minuti prima dell&#39;uso come questo può causare la perdita di attività. </li></ol> 3. Preparazione tungsteno aghi <ol><li> Tagliare multa filo di tungsteno in 3-4 cm di lunghezza. Inserire un pezzo di filo al fine diuna pipetta Pasteur di vetro e si fondono in un becco Bunsen per fissare in posizione. Preparare fino a 10 aghi per assicurare che non vi siano parti di ricambio se danneggiati durante l&#39;uso. </li><li> Posizionare l&#39;estremità del filo in una fiamma ossidrica e tenerla lì fino a quando il tungsteno diventa bianco e la punta è affilata (circa 2-3 minuti). Nota: Durante l&#39;uso l&#39;ago può essere pulito e ri-affilata nella fiamma ossidrica, se necessario. NOTA: Questi aghi possono essere utilizzati anche per creare dei cicli per il trasferimento di perline. Toccare delicatamente l&#39;ago per la panchina e si piega a formare un anello. </li></ol> 4. Gli embrioni Preparazione per Bead innesti <ol><li> Incubare le uova con l&#39;estremità smussata fino a quando non raggiungono lo stadio desiderato (3-5 giorni per la maggior parte le manipolazioni gemma arto). Utilizzando pinze smussato toccare la punta smussata per rompere il guscio e quindi utilizzare le pinze per rimuovere il guscio ed esporre l&#39;embrione. Assicurarsi che la membrana guscio d&#39;uovo viene rimosso anche. NOTA: 1-2 ml di soluzione salina può essere aggiunto con una pipetta Pasteur per assistere conquesto se la membrana aderisce al tuorlo. Pipetta delicatamente la PBS sulla superficie del tuorlo, afferrare la membrana con le pinze, facendo attenzione a non danneggiare il tuorlo, e tirare delicatamente via dall&#39;uovo. </li><li> Rimuovere fino a 5 ml di albume dall&#39;uovo con una siringa da 10 ml e un ago 19 G. Prendere solo quanto necessario per garantire l&#39;embrione non entrare in contatto con il nastro utilizzato per sigillare l&#39;uovo come rimozione di volumi più grandi in grado di ridurre i tassi di sopravvivenza degli embrioni. </li><li> Per visualizzare l&#39;embrione aggiungere un 5-6 gocce di artisti china a 15 ml di PBS contenente 100 U penicillina e 0,1 mg di streptomicina / ml. Iniettare 0,5-1 ml direttamente sotto l&#39;embrione con una siringa da 1 ml e un ago 25 G. </li><li> Aggiungere 2-3 ml di PBS 1% con siero fetale bovino e 100 U di penicillina e 0,1 mg di streptomicina / ml nell&#39;uovo di garantire l&#39;embrione non disidratarsi. Utilizzando affilate orologiai pinze rimuovere la membrana vitellina e aprire il sacco amniotico sulle gemme degli arti in via di sviluppo. Assicurarsi che l&#39;embrione non si secchi e, Se necessario, aggiungere altro PBS / FCS. NOTA: Le gemme degli arti può essere visto chiaramente come escrescenze appaiati sul fianco dell &#39;embrione. A queste fasi dell&#39;embrione girerà come il lato destro è normalmente superiore. Il risultato è normalmente più facile innestare perle nelle arti di destra e utilizzare quelli lasciati come controlli controlaterale. </li><li> Utilizzare un filo di tungsteno affilato per fare un&#39;incisione nella gemma arto dove sarà impiantato il tallone. Evitare di tagliare tutto il percorso attraverso la gemma arto, se possibile, anche se a fasi più giovani questo è difficile. NOTA: in embrioni più anziani (HH stadio 22 e sopra) è possibile selezionare specifiche regioni del bocciolo arto per l&#39;innesto, ma nelle fasi più giovani questo è più difficile come l&#39;arto gemma in sé è piccolo. E &#39;anche importante ricordare che la gemma arto crescerà oltre il tallone innestato così, soprattutto nelle fasi più giovani, il tallone rimarrà nell&#39;arto prossimale. </li><li> Prendete una perlina sia dal fattore di crescita o di droga utilizzando wa extra finetchmakers forcipe o un ciclo fatto da un ago di tungsteno. Se il cordone è stato immerso in uno DMSO o rosso fenolo, lavare in PBS prima di applicare per l&#39;embrione. Trasferire il tallone per l&#39;embrione con la pinza / cappio. Quindi utilizzare il filo di tungsteno affilato per inserire il tallone nell&#39;incisione. </li><li> Aggiungere 1-2 ml di PBS / FCS all&#39;uovo assicurare che l&#39;embrione è mantenuta idratata ma evitare di applicare direttamente sulla dell&#39;embrione stesso come questo può danneggiare gli embrioni e causare il tallone da sloggiato. Sigillare l&#39;uovo con nastro e tornare alla incubatrice. </li></ol>

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B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors.">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li><li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system:+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem.">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;utilizzo di innesti tallone applicati direttamente allo sviluppo di tessuti in ovo è un potente strumento per analizzare il ruolo del fattore di crescita di segnalazione durante lo sviluppo dando il controllo senza precedenti sopra lo stadio di sviluppo in cui vengono applicate e la durata dell&#39;esposizione. La scelta del cordone per ogni tipo di molecola è importante. Piccole molecole idrofobe, come gli inibitori qui descritte ed acido retinoico, di solito si legano bene al derivatizzato AG 1-X2 perline sebbene sia necessario verificare l&#39;efficacia di ciascun inibitore su queste perle empiricamente. Analogamente, per i fattori di crescita può essere necessario testare diversi tipi di tallone. Alcune perle sono trasparenti e quindi può essere difficile da visualizzare durante le manipolazioni ma un breve trattamento con rosso fenolo, seguito da un risciacquo in PBS li etichetta per un tempo sufficiente per eseguire l&#39;innesto. Nel preparare perle, in particolare quelli che sono stati impregnati con inibitores, è importante proteggere dalla luce, per quanto possibile. Durante il trattamento iniziale e durante la manipolazione devono essere coperti e solo rimossi quando perline vengono trasferiti. E &#39;meglio usare aliquote appena scongelati come alcuni di questi reagenti sono instabili e possono dare risultati negativi fuorvianti se non conservato correttamente. E &#39;anche importante non lasciarli ammollo in rosso fenolo per troppo tempo prima dell&#39;innesto come questo può ridurre l&#39;efficacia del tallone. Le concentrazioni utilizzate per questi innesti tallone, di entrambi i fattori di crescita e farmaci, sono spesso molto elevata; Perline FGF18 sono immersi in una concentrazione di 0,5 mg / ml e perline per piccole molecole inibitrici sono spesso imbevuto ad una concentrazione di 100 mM. Anche se questo è molto più elevata rispetto alle concentrazioni tipicamente utilizzati per il trattamento di cellule in soluzione è necessario in quanto la quantità di fattori di crescita e farmaci assorbiti da perline e poi rilasciati sono difficili da misurare direttamente ma presumibilmente generite livelli inferiori a questo in vivo. Come risultato un intervallo di concentrazioni deve essere testato per ciascuna molecola utilizzata per determinare una dose efficace. Questa tecnica è anche applicabile ad una vasta gamma di altri tessuti, come la 24 somiti, durante lo sviluppo e può essere utilizzato su embrioni in ovo o in culture, come la cultura EC 25. È anche possibile coltivare cellule in coltura che secernono fattori di crescita specifici i pellet che possono poi essere innestati in embrioni di sviluppo nello stesso modo 26. La combinazione di accessibilità, facilità di manipolazione e di basso costo rende embrioni di pollo un ottimo modello di sviluppo. Poiché le tecnologie transgeniche sono sempre più applicate a specie avicole e linee geneticamente modificate sia polli 7 e quaglie 27 diventano disponibili la combinazione di embrione classica tecniche con questi uccelli modificati innesto è già fornendo nuove intuizioni deluppo 8,28.

Embrioni aviaria hanno fornito un potente strumento per lo studio di sviluppo per molti anni 1. Una delle loro caratteristiche più utili è che sono relativamente facili da manipolare. Sviluppo esterno consente di aprire l&#39;uovo per accedere l&#39;embrione ed eseguire varie micromanipolazioni con esempi come il sistema chimera quaglia-chick classico per lo studio il destino della cellula 2,3, l&#39;iniezione di retrovirus per sovraespressione in tessuti specifici durante lo sviluppo 4,5 e la cultura espianto di identificare le fonti di segnalazione di sviluppo 6. Più recentemente chimere generato tra gli host non etichettati con innesti da una linea pollo transgenici che esprimono GFP ha dimostrato che la combinazione di innesto classica e la modificazione genetica in grado di fornire importanti intuizioni sviluppo 7,8. La facilità con cui l&#39;embrione aviaria può essere manipolato ha reso un ottimo modello per lo studio degli artisviluppo 9. L&#39;applicazione di fattori di crescita specifici per gli arti in via di sviluppo in vivo è stato fondamentale per identificare i fattori che alterano arto patterning 10,11 e continua a fornire intuizioni in questo processo 12. Questo approccio è stato utilizzato anche per studiare i fattori che regolano lo sviluppo muscolare e ha scoperto ruoli per numerosi segnali, come Wnts 13, BMP 14 e HGF 15. Recentemente questa tecnica è stata utilizzata per studiare i segnali che controllano l&#39;espressione genica myogenic sul nascere degli arti e ha dimostrato che le interazioni tra FGF18 e acido retinoico può controllare i tempi di espressione MyoD 16. Usando una combinazione di fattori di crescita e piccole molecole che possono essere caricati su perline e poi innestate direttamente nei tessuti specifici a stadi di sviluppo definiti dà la possibilità di intervenire in quasi ogni momento e regione durante lo sviluppo. Questo è stato usato per investigate molti processi tra cui somite patterning 17,18, specificazione neurale 19, neural crest migrazione 20 e l&#39;estensione dell&#39;asse 21. Qui si descrive un metodo per perline imbevute di entrambi i fattori di crescita o inibitori nello sviluppo di arti di pollo innesto. Questo è stato utilizzato per determinare gli effetti di questi segnali su miogenesi analizzando muscolo espressione genica specifica con ibridazione in situ. Descriviamo innesti utilizzando eparina imbevuto perline, che sono utilizzati per fattori di crescita, o perline AG 1-X2 per piccole molecole idrofobe quali acido retinoico o piccole molecole inibitrici di vie di segnalazione specifici. Tuttavia altre perle sono disponibili che sono stati utilizzati per fornire sia FGFs 22 e 23 anche Shh.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin acrylic beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H5263</td>
			<td>The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X2 beads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>140-1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affi Gel blue beads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301; 153-7302</td>
			<td>These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF18</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-28</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80&#176;C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U0126</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9903</td>
			<td>Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80&#176;C. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMS-493</td>
			<td>Tocris Biosciences</td>
			<td>3509</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80&#176;C. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Indian ink</td>
			<td>Windsor and Newton</td>
			<td>5012572003384 (30ml)</td>
			<td>While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

grafting of beads into developing chicken embryo limbs to identify signal transduction pathways affecting gene expression

Usando embrioni di pollo è possibile testare direttamente gli effetti delle due fattori di crescita o inibitori specifici di vie di segnalazione di espressione genica e attivazione di vie di trasduzione del segnale. Questa tecnica permette la consegna di molecole di segnalazione in stadi di sviluppo ben definiti per i tempi specifici. Dopo questo embrioni possono essere raccolte e l&#39;espressione genica esaminati, ad esempio in situ ibridazione, o l&#39;attivazione di vie di trasduzione del segnale osservato con immunocolorazione. In questo video di eparina perline imbevuti di FGF18 o AG perline 1-X2 imbevute di U0126, un inibitore di MEK, si innestano nel bocciolo arto in ovo. Questo dimostra che FGF18 induce l&#39;espressione di MyoD e ERK fosforilazione e espressione MyoD sia endogena e FGF18 indotta è inibito dalla U0126. Perline imbevuto di un antagonista dell&#39;acido retinoico possono potenziare l&#39;induzione prematura MyoD da FGF18. Questo approccio può essere noied una vasta gamma di fattori di crescita e inibitori e si adatta facilmente ad altri tessuti embrioni.

Nella fase HH 21 MyoD non è espresso in mioblasti sviluppo arto sebbene colorazione può essere visto in myotome dei somiti sviluppo (Figura 1A). Figura 1B mostra ibridazione in situ per MyoD 6 ore dopo un innesto FGF18 tallone. MyoD è indotta in mioblasti vicino al tallone, mentre non vi è alcuna espressione nell&#39;arto controlaterale. Co-innestando un branello imbevuto U0126, un inibitore specifico di MEK, induzione blocchi FGF18 di MyoD (Figura 1C). Allo stesso modo l&#39;innesto una perlina U0126 in fase HH 21 anni e cerco espressione MyoD dopo 24 ore riduce l&#39;espressione endogena di MyoD confronto con l&#39;arto controlaterale non trattata (figura 1D, E). In gemme degli arti a HH fase 19 FGF18 non induce MyoD (Figura 1F). Tuttavia co-innesto di perline imbevuto di FGF18 e l&#39;antagonista acido retinoico BMS493 in grado di superare questo e viene rilevato MyoD ectopica (Figuri 1G) Per confermare che FGF18 si agisce attraverso gli embrioni del MEK sono state raccolte 1 ora dopo perlina trapianto e immunostained per ERK fosforilata, l&#39;obiettivo di MEK. Figura 1H mostra un&#39;immagine campo chiaro di una FGF18 cordone di 1 ora dopo l&#39;innesto mentre la Figura 1I mostra che FGF18 induce una rapida fosforilazione di ERK intorno al tallone innestato. La figura 1J mostra una sovrapposizione di queste immagini. Perline di controllo immersi in 0,1% di BSA non provocare ERK fosforilazione (Figura 1 K, L, M) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53342/53342fig1.jpg" /> Figura 1. MyoD espressione negli arti è regolato da FGF18 e acido retinoico attraverso la fosforilazione di ERK. Membra di controllo non manipolata in HH fase 21 non esprimono MyoD (A), ma l&#39;espressione prematura viene rilevata 6 ore dopo l&#39;innesto di un cordone di FGF18 (B). Co-innesto di FGF18 e U0126 perline blocchi questa induzione (C). Espressione MyoD endogena è visto in fase HH 21 (D), ma questa è bloccata da perline imbevute di U0126 (E) l&#39;innesto. In gemme degli arti anteriori espressione MyoD precoce non è indotta da FGF18 (F), ma è indotta dalla co-innesto perline imbevute di FGF18 e l&#39;antagonista dell&#39;acido retinoico BMS493 (G). Perline FGF18 innestate in arti HH21 inducono fosforilazione ERK dopo 1 ora: campo chiaro (H), fluorescenti (I) e uniti (J) immagini di un arto HH21 immunostained per l&#39;anti-phosphoERK. Perline di controllo imbevuti di BSA non provocare ERK fosforilazione: (K), fluorescente (L) e uniti (M) immagini di un arto HH21 immunostained per l&#39;anti-phosphoERK. Questa cifra è stata modificata da Mok et al, 2014 16. Nero asterischi: perle di eparina; aste biancorischi: AG perle 1-X2; frecce mostrano espressione MyoD ectopica in gemme degli arti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53342/53342fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

grafting-beads-into-developing-chicken-embryo-limbs-to-identify

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Views.  University of Nottingham. By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Video: Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

L&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

Doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno degli embrioni di pollo utilizzando l'innesto del tubo neuraleGFP del pulcino e l'iniezione di colorante carbocianina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

In vitro ricostituzione dei modelli di contatto cellulare spaziale con Caenorhabditis isolato elegans Embrione Blastomeres e Perline in polistino adesivo

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...