D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

本研究では、成体（6-8週）の雌C57BL / 6マウスを使用しました。マウスは、ゲント大学のビバリウムのガイドラインに従って飼育し、飼育しました。すべての動物の手順は、動物実験倫理委員会によって承認されました。 マウスの脾臓から単核細胞（MNCを）の調製<ol><li>頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>バックダウン解剖ボード上にマウスを置き、ピンと後肢と前足を修正。 </li><li> 70％で皮膚表面を殺菌（体積/体積）エタノール/ H 2 O </li><li>胸部に腹部正中線に沿って皮膚をカットし、無菌手術器具を使用して脾臓を露出させます。 </li><li>周囲の脂肪組織をトリミングした後、室温で1ミリリットル1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む24ウェルプレートに脾臓を配置します。 </li><li>滅菌メスを用いて脾臓を解剖し、50mlの浴槽内に配置された70ミクロンのナイロンフィルターに作品を転送しますE。 </li><li> 2ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して、静かにセルストレーナーを通して脾臓片をマッシュアップし、5mlの1×PBSで洗浄します。 </li><li> 15mlチューブにフィコール - パックの3ミリリットルを追加し、5ミリリットルの細胞懸濁液と密度勾配媒体をオーバーレイ。 </li><li>ブレーキなしの室温で20分間、400×gで遠心分離します。 </li><li> 、新鮮な15mlチューブに相間を移し、4℃で10分間300×gで10ミリリットルの冷1×PBSおよび遠心分離機を追加します。 </li><li> 0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（FACS緩衝液）を含むPBS 1×2mlの細胞を再懸濁。小さなチューブに移し、細胞懸濁液10μlを、0.4％の10μLと混合</li></ol> 2.濃縮、検出とマウスのiNKT細胞の精製<ol><li>マウス脾臓CD5positive（CD5 +）リンパ球の濃縮。 <ol><li> （オプション）染色で10 5細胞のFITC結合抗CD5（4μlの1：30希釈の/ 10 6細胞 ）暗所で4℃で30分間、200μlのFACS緩衝液および500で再懸濁し、FACS緩衝液μlの洗浄。 1×PBS中の4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の20μMの作業溶液を調製し、FACS緩衝液中に10μlのその5個の細胞を1追加し、室温で5分間インキュベートします。フローサイトメーターで10 4前濃縮された細胞を取得します。 <ol><li> （ 図1A）、細胞ダブレットと凝集体を排除するためにFSC-WのLO細胞にFCS-HとFCS-Wを使用して、電子的にゲート。そして、電子的にゲートアウトDAPI + FSC-W LO集団内（死）細胞（ 図1B）、および電子的に大きさ（ 図1C）によってリンパ球集団を選択するために、SSC-AとFCS-Aを使用しています。 </li><li>リンパ球ゲート内の細胞を用いて、CD5対SSC-Aをプロットし、 図1Dに示すように、電子的にゲートCD5 +リンパ球。フローサイトメーターのプレ濃縮されたサンプルの残りを取得します。 </lI&gt; </ol></li><li> FACS緩衝液に90μlのあたり10 7細胞に細胞数を調整し、10μlの抗CD5マイクロビーズを追加します。 </li><li> 15分間4ºCでインキュベート、FACSは、500μlの冷たいFACS緩衝液中に再懸濁緩衝液および4ミリリットルで1回洗浄。製造業者の推奨に従って磁気細胞分離（MACS）カラムを使用して、CD5 +リンパ球を濃縮します。 </li><li> FITC結合抗CD5とオプション）染色は、10 5細胞 （2.1.1のように1:30希釈/ 10 6細胞 ）およびDAPI4μlの。フローサイトメーター上の10 4濃縮リンパ球を取得し、2.1.1で作成した電子ゲートことを確認します。濃縮された細胞画分に、CD5 +リンパ球を選択します。フローサイトメーター上の10 5個の細胞を取得し、 図1（e）に示すように富む画分に存在する割合CD5 +リンパ球を分析- H。 </li></ol></li><li>検出およびマウスのiNKT CEの単離FACSによるLLS。 <ol><li>抗CD16 / CD32を含むFACS緩衝液中に約10 6個の細胞 20当たりμLおよびPE結合αGalCerの（1:50希釈/ 10 6細胞の4μL）の濃度で濃縮CD5 +リンパ球を再懸濁/のCD1d四量体（1μgの/ 10 6細胞 ）。 </li><li>暗所でRTで30分間インキュベートします。 </li><li>のマウス抗体（mAb）抗CD3εV500（午前1時20希釈の4μL/ 10 6細胞 ）、抗CD19 E450（1:50希釈の4μL/ 10 6細胞）および抗CD8αのE450（4μLを希釈FACS緩衝液で1:50希釈/ 10 6細胞 ）、CD5 +リンパ球に加え、暗所で4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 10 7細胞/ mlの最終濃度で4mlにFACS緩衝液を4℃で10分間、300×gで遠心分離し、再懸濁することによって1mLのFACS緩衝液で細胞を洗浄します。 </li><li> 30μmのセルストレーナーを通して細胞を濾過し、細胞を氷上に置きます。 </li><li>メーカーの推奨14,15に従って細胞選別のためのフローサイトメーターを調整します。 注：細胞選別のためのフローサイトメーターのキャリブレーションは、トレーニングを必要とし、経験豊富なオペレータ、または訓練を受けた技術者により行うことができます。 </li><li> 10 6個の細胞あたりDAPI20μMのワーキング溶液10μlを加え、室温で5分間インキュベートします。フローサイトメーターで約10 4濃縮CD5 +リンパ球を取得します。 FSC-WのLO細胞の電子的にゲートが、細胞ダブレットと集合体（ 図2A）を除外します。その後、FSC-W LO集団内のゲートアウトDAPI + CD8 + CD19 +細胞 （ダンプチャンネル）（ 図2B）、電子的、および2.1.1.1に記載されているように電子的にリンパ球（ 図2C）を選択し 、SSC-AとFCS-Aを使用します。 <ol><li> CD3εと電子的にゲートαGalCerの/ CD1dのことでプロットαGalCerの/のCD1d四量体図2Dに示すように、四量体+CD3ε+ iNKT細胞。割合αGalCerの/のCD1d四量体+濃縮された細胞画分に存在CD3ε+ iNKT細胞を決定するために、2×10 5 CD5 +濃縮リンパ球よりも多くを獲得しません。 </li></ol></li><li> 「1.5」の流速で70μmのノズルを用いて、70 psiで、フローサイトメーターで2.2.7で作成された電子ゲートを使用して、FACSソートαGalCerの/のCD1d四量体+CD3ε+ iNKT細胞。 1ミリリットルの100％FCSを含むFACSチューブにソートされたiNKT細胞を収集します。続いて、4℃で10分間、300×gで細胞を10 mlのRMPI 1640培地および遠心分離機を用いてFACSチューブの側面から選別iNKT細胞をすすぎます。 </li><li>再懸濁し、1mlのRPMI 1640培地にiNKT細胞を選別し、ソートされたiNKT細胞の純度を評価するために、フローサイトメーター上でμLその40を獲得。リンパ球- FSC-W LO DAPIを選択2.2.7で説明したように、S。 （ 図2E - G）と電子的にゲートαGalCerの/のCD1d四量体+CD3ε+ iNKT細胞図2Hに示すように。 </li></ol></li></ol> 3.文化とマウスのiNKT細胞の増殖 0日目<ol><li>コー​​ト室温で1時間、ウェルあたり精製した抗CD3ε（3μgの/ ml）で平底の96ウェルプレート。 200μlの1×PBSおよび一度200μlで完全RPMI 1640培地（10％容量/容量のFCS、100U / mlのペニシリン - ストレプトマイシン、5.5μMのβメルカプトエタノール）で2回洗浄します。 </li><li> 1.11のように0.4％血球計数器を使用して実行可能なソートiNKT細胞（ステップ2.2.8）の数をカウントし、完全RPMI 1640培地中で5×10 5細胞/ mlで4℃で10分間、300×gで遠心分離及び再懸濁組換えマウスIL-2（10ng / ml）を、組換えマウスIL-12（1 ngの/ ml）および可溶性抗マウスCD28（5μg/ ml）を含有します。プレートの抗CD3εコートしたプレートにウェル10 5細胞 /でiNKT細胞をorted、2日間のCO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li></ol> 2日目<ol start="3"><li> 2日間の新鮮なコーティングされていない平底96ウェルプレートと文化のCO 2インキュベーター内で37℃での完全RPMI 1640培地中で静止条件下での細胞に細胞を移します。 </li></ol> 4日目<ol start="4"><li>穏やかにピペッティングすることによってプレートから細胞を除去し、新鮮な15mlチューブに細胞を移します。 4°C、組換えマウスIL-7（5 ngの/ ml）を含む完全RPMI 1640培地中で5×10 5細胞/ mlで再懸濁し、で10分間、300×gで遠心分離し、フラット10 5細胞/ウェルをプレートCO 2インキュベーター中、37℃で4日間、96ウェルプレートの底。 </li></ol> 8日目<ol start="5"><li> 300 xにおける新たなチューブに細胞を回収し、遠心分離可溶性抗CD28（5μg/ ml）を含む完全RPMI 1640培地中で5×10 5細胞/ mlで4℃で10分間再懸濁のために、G。 </li><li>コー​​トウェル当たり精製した抗CD3ε（3μgの/ ml）で平底の96ウェルプレートとは3.1のように洗います。プレート10 5細胞/ウェル中の抗CD3εコーティングされたプレートとは、11日目までのCO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li></ol>日11から18 <ol start="7"><li>繰り返しは3.6から3.4のステップ。 </li></ol>日19-20 <ol start="8"><li>完全RPMI 1640培地中に5×10 5細胞/ mlで300×gで再懸濁で新鮮な15mlチューブ、遠心分離機に細胞を移します。 </li><li>平底96ウェルプレート中にウェル10 5細胞 /プレートで細胞と細胞を実験に使用する前にCO 2インキュベーター中、37℃で2日間休息することを可能にします。 </li></ol> 4.サイトカイン産生のCD1dぷらっとを用いて、マウスのiNKT細胞による電子結合アッセイ<ol><li>コー​​ト平底96ウェルあたり組換えマウスCD1dの100μlの（1×PBS中10μg/ ml）でプレートし、37℃で1時間インキュベートします。 </li><li> 200μlの1×PBSで4回洗浄し、ウェル当たり1×PBS中の2％FCS（ブロッキング溶液）200μlを添加し、37℃で2時間インキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、ウェルあたりαGalCerの200μlの（5 ngの/μl）を追加し、16時間、37℃でプレートをインキュベートします。 [αGalCerの溶液の調製のために、車両が96 mg / mlのスクロース、10 mg / mlのデオキシコール酸ナトリウム及び5 mg / mlのTween 20を含むに溶解αGalCerの55μgのに1,085μ1×PBSを追加]。 </li><li>インキュベーション後、αGalCerの液を捨て、200μlの完全RPMI 1640培地に続いて、PBS 1×200μlでも二回洗浄します。 </li><li>完全なRで遠心細胞300×gで10分間4℃で再懸濁し、21日目にin vitroで拡大iNKT細胞を収集0.5×10 6細胞/ mlの濃度でPMI 1640培地。 </li><li>ウェル当たりのiNKT細胞の再懸濁液の200μlを添加し、CO 2インキュベーター内で37℃で72時間インキュベートします。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって関心の上澄み液と測定サイトカインを収集します。 </li></ol>

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The authors have no competing interests to disclose.

現在のプロトコルにおける重要なステップは、分離およびCD5 +リンパ球 （第1＆2）、（3節）とiNKT細胞の初期めっき（第4節）をFACSソーティングのその後の濃縮を含みます。第1節で実行されるステップの、慎重に異なる細胞間期を遠心分離後に生成されるような密度勾配媒体を介して脾臓細胞懸濁液をレイヤーすることを忘れないでください。磁気細胞分離（第2節）により、CD5 +リンパ球に対するその後の濃縮を染色するために必要な試薬と時間を最小限に抑えるためのその増加のiNKT細胞収量を後の並べ替えをするのに役立ちますFACSソートiNKT細胞（第3節）。最後に、細胞のアポトーシスをもたらすことがiNKT細胞の高い数字でウェルを播種とし ​​ての文化（第4章）の最初の2日間ウェル当たりせいぜい10 5 iNKT細胞をシードしないことが重要です。 および/またはtroubleshooを変更する際の考慮事項の数が重要ですティンこのプロトコル：最初に、使用される動物の年齢が重要です。どちらか古すぎる、または付属の感染症を持っている動物は、分離区別するためにあなたの能力を妨げ、および脾臓からFACSソート十分な細胞があります。 αGalCerの/のCD1d四量体で染色する際に第二に、それはあまりにも高いボリュームが今度は四量体+のクラスタリングを低減αGalCerの/のCD1d四量体の染色効率を希釈するように、低PBS緩衝液中に再懸濁した細胞の量を維持することが重要ですFACSによるiNKT細胞。理想的には、FACS収集中しっかりとクラスタ化されたαGalCerの/のCD1d四量体+ iNKT細胞の存在は、FACSにより、より正確なゲーティングを可能にし、後のソート、分析中に高い割合純度iNKTsをもたらします。下ソートされたiNKT細胞の収量は培養中に他の混入T細胞集団の成長になりますので、これは重要です。第三に、継続的なiNKT CEの文化や拡張中黄色になるメディアをリフレッシュLLS。例えば、特に8日、文化の日の11時に適切なサイトカインを含む新しい培地と黄変培地の50％を交換してください。 iNKT細胞の収量は、このように最大化することができます。 我々の知る限り、これはマウスの脾臓から分離し、iNKT細胞の濃縮のための密度勾配およびCD5 +リンパ球の濃縮工程を含む最初のiNKT拡張プロトコルです。別のアプローチの数がαGalCerの/ CD1dの二量体13を含む脾臓iNKT細胞を濃縮するために検討されている、磁気細胞分離9による Vα14TCR Tgマウス10ならびに非T細胞の枯渇。 iNKT細胞が正常にこれらの方法を用いてインビトロで拡大することができるものの、このような方法は、10のトランスジェニックiNKT細胞を生成する、iNKTs 13を濃縮、または同時にいくつかの非のiNKT細胞株を生じるαGalCerの/のCD1dダイマー大量のいずれかを必要とします9 &lt;/ SUP&gt;。また、ソートされたiNKT細胞（第4節）を維持・拡大するために、プレートに結合させた抗CD3εの使用は 、インビトロ9 でのiNKT拡張時に活性化するAPCの必要性を排除します。この文脈において、APCフリーのiNKT拡張プロトコルは 、インビボで注射前に拡張iNKT細胞から抗原提示細胞を分離する必要がないという利点を有します。しかし我々はまた、記載されているプロトコルは、研究者はへの容易なアクセスを必要とするという事実によって制限されていることを追加するだけでなく、関連する訓練、FACSソーターを校正し、操作する必要があります。残念ながら、FACS選別機は高価であり、彼らはすべての実験室で常に使用できません。現在のプロトコルは、マウスiNKT細胞を単離し、培養するために最適化されているが、それにもかかわらず、本明細書に記載の濃縮ステップは、16のiNKT最近胸腺移住者（のRTE）を単離および研究するために使用することができ、ために豊かにし、他の希少Tを特徴付けるように構成することができますFACSによる細胞集団。 8 iNKT細胞まで生成するために使用することができる最適化されたアプローチを定義します。このようにして生成されたiNKT細胞は、養子免疫伝達実験及びin vivoでのiNKT細胞生物学の研究のためにそれらを有用にする、刺激によりサイトカインを分泌する能力を保持します。

ネズミ不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞は、CD1dの発現皮質胸腺細胞1,2-によって胸腺内で選択された生来のTリンパ球の異なる集団です。 iNKT細胞は、Vβ8、Vβ7またはのCD1dの文脈における内因性ならびに外来脂質抗原を認識することができるVβ2TCRは3のいずれかと対に不変Vα14-Jα18TCR鎖からなるT細胞受容体（TCR）を発現します。例えば、マウスのiNKT細胞を認識し、内因性isoglobotrihexosylceramide（のiGb3）4と呼ばれる脂質抗原と同様に、αガラクトシルセラミド（αGalCerの）5,6、海綿から単離された糖脂質によって活性化されます。 iNKT細胞のTCR依存性活性化は、適応免疫応答のプライミングを促進し、その結果、iNKT細胞は、リウマチ性疾患7及び癌を含む病理の範囲の改善や開発に機能的関与することが示されています&lt;SUP&gt; 8。現在、合成のiNKT細胞リガンドは、免疫病理学的条件の数を調節することが可能である有望な新しいワクチンアジュバントを構成しています。 これは、以前にiNKT細胞しかしマウス組織から単離した後、in vitroで生成することができることが実証されています。これらの研究の多くは、Vα14TCRトランスジェニック（Tg）は、マウス10、またはのiNKT細胞由来のハイブリドーマ11,12を生成するための胸腺腫、主要な抗原提示細胞（APC）、及び/又は細胞株の使用9を用います 。さらに、マウスの多くは、αGalCerのロードされたCD1dダイマー、および長い培養時間などの試薬 ​​の高いボリュームがいくつか公開されたプロトコル少ない倫理的および経済的に9,13をアピールしてください。 この報告では、単離のために、マウスの脾臓からiNKT細胞の体外拡大して適応する方法を説明します。より具体的には、プロトコルは、方法が記載されていますFACS細胞選別のために必要なマウス、試薬および時間を減少させ、in vitroで 、ソート脾臓iNKT細胞を拡大するために最適化されたアプローチを提案しているマウス脾臓からiNKT細胞を濃縮します。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD8&amp;alpha; (53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500-conjugated anti-mouse CD3&amp;epsilon; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; - free]</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m filter</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Water-jacketed CO2 incubator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Kit</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen

急速に刺激によりサイトカインを分泌する能力は、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞系統の機能的な特徴です。 iNKT細胞は、したがって、免疫応答を活性化し、ステアリング適応可能な生来のT細胞集団として特徴づけられます。マウスiNKT細胞の培養および増殖のための改良された技術の開発は 、in vitro および in vivo モデル系でのiNKT細胞生物学の研究を容易にします。ここでは、マウスの脾臓iNKT細胞の単離および拡張のための最適化された手順を説明します。 C57BL / 6マウスから脾臓を取り出し、解剖し、緊張し、得られた細胞懸濁液を、密度勾配媒体を介して積層されています。遠心分離後、脾臓単核細胞（MNC）収集され、CD5陽性（CD5 +）リンパ球は、磁気ビーズを使用するために濃縮されます。 CD5 +画分内のiNKT細胞は、その後^で染色します5; GalCerを負荷されたCD1d四量体および蛍光活性化細胞選別（FACS）によって精製しました。 FACSは、組換えマウスサイトカインの組み合わせを用いてインビトロで、その後、最初に培養し、プレートに結合したT細胞受容体（TCR）の刺激を、マウス組換えIL-7の存在下で拡張される前に、iNKT細胞を選別しました。この技術を用いて、約10 8 iNKT細胞は、それらが、インビトロでの機能アッセイのために、または、マウスにおけるインビボ移入実験のために使用することができ、その後、培養の18-20日以内に発生することができます。

密度勾配を使用して、脾臓単核細胞の単離は、約1時間を要し、赤血球（RBC）を溶解するのに必要な試薬の使用を排除します。生存細胞の高い収率が除去される器官の緊張時に発生するこの方法及び破片を用いて得られます。典型的には、脾臓リンパ球のプール内のiNKT細胞の頻度は、しかし、これは使用される動物の年齢、性別、健康状態に応じて変えることができる総Tリンパ球の1と5％の間の範囲です。約10 6 iNKT細胞は、3匹のマウスのプールした脾臓から取得することができ、iNKT細胞の最高収率は、6〜8週齢のマウスの脾臓から得られます。 マウス抗CD5磁気ビーズの使用が著しくCD5抗原を発現するBリンパ球の小集団から離れて、脾臓MNC画分内のiNKT細胞のために富化、および、この手順を使用して単離された細胞の大部分は、CD5 +のリンパを構成します球。例えば、CD5濃縮後に得られた多国籍企業の5〜8％は、CD5陰性（ 図1H）です。 αGalCerの/のCD1d四量体および抗がマウスCD3εしかし98％を超えるのiNKT細胞の純度をもたらす、脾臓BおよびCD8 T細胞についてFACSダンプチャネルはソート時に「粘着性」リンパ球集団を排除するために使用されるべきであるとを組み合わせ選別のiNKT細胞のFACS用。また、ゲートアウトCD5濃縮工程の間に形成された可能性のダブレット。このFACSセットアップを使用して、我々は99％（ 図2H）の順でのiNKT細胞純度後の並べ替えを取得しました。 IL-2、IL-12および可溶性抗CD28の存在下で、プレート結合抗CD3εと10 6ソートiNKT細胞の刺激は、培養の2日後（ 図3）は、次のiNKT数の3倍の拡大をもたらしました。文化の中で4日目に存在するiNKT細胞の数が3〜4倍の増加におけるIL-7の結果の存在下で、その後の拡張iNKT細胞。 Notably、これらの培養条件を繰り返して別の日に培地の変化との間のセルの目に見える損失（ 図3）ことなく、拡張2ラウンドの後に7×10 7 iNKT細胞の平均値を得ることができます。したがって、マウス脾臓iNKT細胞は、少なくとも18日間で、これらの条件を用いて70倍に拡大することができます。 また、αGalCerのを搭載したプレートに結合した組換えマウスCD1dの刺激による拡大iNKT細胞のサイトカイン産生能を評価しました。 48時間の刺激後に、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-αおよびIL-6を容易にELISAによって培養上清中に検出することができた（ 図4）。拡張iNKT細胞は、したがって、Th1およびTh2サイ​​トカインの後拡張を産生する能力を保持します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig1.jpg" /> CD5 +図1.濃縮マウスの脾臓の多国籍企業からのリンパ球 。前濃縮に存在CD5 +リンパ球 （AD）と磁気細胞分離に富む（EH）は、マウスの脾臓MNC懸濁液の割合を分析するためのゲーティング戦略。セルダブレット（A、E）および死細胞（B、F）は、それぞれ 、FSC-Aプロット対FCS-WおよびDAPI対FSC-Hを使用して除外されています。割合CD5 +濃縮の前と後の両方のリンパ球ゲート（C、G）内に存在する細胞は、それぞれ、DおよびHに示されているが。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53256/53256fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig2.jpg" /> イチジク<html> CD5に富む脾臓多国籍企業からのiNKT細胞を選別URE 2. FACS。パーセンテージαGalCerのを分析するためのゲーティング戦略/前に存在したCD1d四量体+CD3ε+ iNKT細胞（A - D）および（E - H）後のFACSソーティング。ゲーティング戦略はFSC-対FCS-W対FSC-Hをプロットすることにより、細胞ダブレット（A、E）、死細胞および分析からのCD8 + CD19 +リンパ球 （B、F）を排除し、DAPI、CD8およびCD19（ダンプチャンネル） 、それぞれ。 FACS選別の前と後のリンパ球ゲート（C、G）内に存在する割合αGalCerの/のCD1d四量体+CD3ε+ iNKT細胞を、それぞれ、（D）及び（H）に示されています。 CD1dの-Tetを、αGalCerの/ CD1dの四量体。= &quot;_空白&quot;を取得&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig3.jpg" /> in vitroで生成されたiNKT細胞の図3の絶対数 。 in vitroでの拡大の3週間後に示された時点でiNKT細胞の数の増加を折る。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53256/53256fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig4.jpg" /> 図4サイトカインインビトロ拡大iNKT細胞の能力を生成する。20日目に拡張iNKT細胞は、マウスαGalCerのロードされたCD1dのインビトロで刺激しました。 72時間上清を回収し、Iの存在について分析しましたFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-2およびIL-6 ELISAによる。バーはSEMを意味した（n = 2）。表し<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53256/53256fig4large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K ビュー.  Ghent University Hospital. Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents. 

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

免疫・感染学

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or microbial lipid antigens presented by the non-polymorphic MHC class I-related molecule CD1d. Preclinical and clinical studies support a role for iNKT cells in cancer, autoimmunity and infectious diseases. iNKT cells are very conserved throughout species and their investigation has been facilitated by mouse models, including CD1d-deficient or iNKT-deficient mice, and the possibility to unequivocally detect them in mice and men with CD1d tetramers or mAbs specific for the semi-invariant TCR. However, iNKT cells are rare and they need to be expanded to reach manageable numbers for any study. Because the generation of primary mouse iNKT cell line in vitro has proven difficult, we have set up a robust protocol to purify and expand splenic iNKT cells from the iV&#945;14-J&#945;18 transgenic mice (iV&#945;14Tg), in which iNKT cells are 30 times more frequent. We show here that primary splenic iV&#945;14Tg iNKT cells can be enriched through an immunomagnetic separation process, yielding about 95-98% pure iNKT cells. The purified iNKT cells are stimulated by anti-CD3/CD28 beads plus IL-2 and IL-7, resulting in 30-fold expansion by day +14 of the culture with 85-99% purity. The expanded iNKT cells can be easily genetically manipulated, providing an invaluable tool to dissect mechanisms of activation and function in vitro and, more importantly, also upon adoptive transfer in vivo.

We describe a rapid and robust protocol to enrich invariant natural killer T (iNKT) cells from mouse spleen and expand them in vitro to suitable numbers for in vitro and in vivo studies.

インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Isolating Invariant Natural Killer T Cells from a Mouse Model

Source: Meng, M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60048">Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video illustrates a method for isolating invariant natural killer T cells, also known as iNKT cells. The procedure begins with injecting a synthetic glycolipid into a mouse to stimulate the activation and proliferation of iNKT cells in the spleen. Subsequently, single-cell suspensions are prepared from the spleen and incubated with iNKT-cell-recognizing complexes labeled with fluorophores, followed by magnetic bead-based separation, to isolate the iNKT cells.

マウスモデルからの不変ナチュラルキラーT細胞の単離

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫療法

細胞免疫療法

T-Cell Enrichment: A Technique to Isolate T-Cells from Mixed Cell Population by Magnetic Separation

Source: Nguyen, H. D., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/60083">Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes T-cells enrichment from the spleen of a mouse by negative selection using a magnetic separator. The technique involves targeting the other cells in the sample for depletion using antibodies or ligands directed against specific cell surface antigens.

T細胞濃縮:磁気分離により混合細胞集団からT細胞を単離する技術

Source: Nguyen, H. D., et al. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. ...

がん研究

白血病

細胞の単離と特性評価

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

Source: Buchele, V., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58871">Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

同種骨髄移植および脾細胞移植によるマウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. GvHD ...

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

要約

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この動画の章

マウスナイーブCD4

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

メジャーナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウスモデル

腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

マウスモデルからの不変ナチュラルキラーT細胞の単離

T細胞濃縮:磁気分離により混合細胞集団からT細胞を単離する技術

同種骨髄移植および脾細胞移植によるマウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

要約

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マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

マウスモデルからの不変ナチュラルキラーT細胞の単離

T細胞濃縮:磁気分離により混合細胞集団からT細胞を単離する技術

同種骨髄移植および脾細胞移植によるマウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導

メジャーナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウスモデル