The research was supported by the National Research Council (CNR) of Italy. The authors thank GIRE members for collecting seed samples and are grateful to Alison Garside for revising the English.

1.種子採取と保管<ol><li>不利な気候条件や低品質の除草剤処理に起因するものではない不当な貧弱な除草剤の性能のための耕地、 すなわち、監視します。 </li><li>一度に一つの種からの種子のサンプルを収集し、一意のコードを割り当てます。成熟した種子は、通常、除草剤処理（複数可）を生き残った植物から作物の収穫前に収集されます。ときに成熟した種子は母植物により流されているかどうかを観察するためのタイムリーなモニター。 </li><li>種、収集日、GPS座標、市町村、農業者の名前、フィールドのサイズ、蔓延レベル、作物、除草剤（複数可）シーズン中に使用すると、フィールドの歴史的な記録の割り当てられた固有のコード、名前を示す各サンプルのフォームに記入。 </li><li>フィールドの侵入を代表するものであり、少なくとも30ランダムに選択された植物からの種子を収集します。種子サンプルは、少なくとも5,000成熟種子が含まれていることを確認してください。絶対異系交雑雑草種のための（ 例えば、ライグラス属やアマランサス属 ）、5,000 11周りの種子の総数を維持し、10〜15に植物の数を減らします。 </li><li>別の除草剤抵抗性生物型が選択されているように雑草のパッチが大面積（ヘクタール以上）に散在している場合は、フィールドをサブサンプル。 </li><li>割り当てられた固有のコードで標識された密閉されていない紙袋で種子を保管してください。 </li><li>水分を蒸発させるが、二次休眠の誘導を回避するために高温に（ すなわち、太陽の下で車の中でそれらを残さない）、または極端な温度変動に種子が公開されていません。 </li><li> （籾殻、デ船体の種子などを削除）し、乾燥室で、周囲温度で保管してくださいきれいな。第1の抵抗のテストを行った後、真空封止されたプラスチック袋であることが好ましく、4℃で暗い部屋で長時間の種を保存します。このようにして、種子はかなり長い時間のために彼らの生存能力を維持します。 </li></ol>注：種子の休眠は、農業生態系に適応し、永続化するために雑草を可能にする、柔軟で効率的なメカニズムを提供します。休眠を打破し、種子の発芽を可能にするために、異なるプロトコルは雑草種、 すなわち、休眠16の種類に応じて使用する必要があります。 休眠を削除するには、3つの主な方法があります。 <ol><li>春化 注：同時発芽と実生発生を取得するには、数日から一週間の範囲の種子春化の期間は、多くの種からの生理的休眠を除去する必要がある：例えば、アオゲイトウ 、 シロザ 、 ライグラス属、カラスムギ、タデタデ属、Phalarisは 17-19を paradoxa。最大15日間の長い期間がSchoenoplectus mucronatusのために30日までヒナゲシ 、 タマガヤツリとAmmaniaのcoccineaのために必要とされています<suP&gt; 20。 <ol><li>プラスチック皿にいくつかの脱イオン水を入れてください。ろ紙の二つの層をカットし、水に浸し、余分なを削除します。紙の上で空気乾燥させた種子を置きます。時間の必要な期間、4℃で冷蔵庫にプラスチック皿を転送します。 </li></ol></li><li>乱切 注：一部の雑草種は、機械的休眠、 すなわち種皮特性に他のものより発芽に対してより難治であり、21を発芽さ硫酸を用いて化学乱切の使用を必要とします。 <ol><li>濃硫酸（95から98パーセント）を入れたビーカーを準備します。一杯の水ビーカーを準備します。不織布の袋に種子を入れてください。 </li><li>濃硫酸に、それぞれ、20分または5分間例えば、ノビエ。またはソルガムhalepense種子を浸します。 </li><li>ピンセットを用いて、ビーカーから封筒を取り出し、水を完全にビーカーに入れます。開きます封筒、小ザルに種子を入れ、流水でそれらを徹底的にすすぎます。 </li></ol>バリアント：A.オオバコ·アクアティカは、異なるプロトコルを必要とする22、23 <ol><li>クロロホルムで2分間の種子を浸します。脱イオン水で種子をすすぎ、吸収紙でそれらを乾燥させます。 5分間、80％硫酸中で種子をダンク。 </li><li>小ザルに種子を入れ、十分に流水でそれらをすすぎます。 </li></ol></li><li>収穫後の種子成熟 注：他の雑草種の種子は関係なく、休眠を打破するために使用される方法の、成熟した後、数ヶ月のために全く発芽しないでください。 <ol><li> RTおよび低湿度で少なくとも3〜4ヶ月の期間のための種子を保存した後、休眠打破（ 例えば、オリザサティバのVAR。sylvaticaまたはP. rhoeas）については、上記のプロトコルに従ってください。 </li></ol></li></ol> 3.種子発芽<ol><li> PLASで発芽する種子を置き、0.6％を含むチック皿0.1％の硝酸カリウムと（M / V）、寒天（KNO 3）を添加しました。 <ol><li>脱イオン水を用いて0.6％+ 0.1％のKNO 3の寒天の溶液を調製します。電子レンジで寒天を溶解します。 </li><li>プラスチック皿に寒天溶液を注ぎます。基板を冷却した後、種子に入れます。 </li></ol>バリアント：土壌をプラスチック皿に基質としても使用することができます。この方法は、 ノビエのために特に効率的です。、S. halepenseとライグラス属 。 </li><li>各雑草種の最適条件に応じて、光と温度条件で約一週間発芽キャビネットにプラスチック製の皿を置きます。ほとんどの冬の種について、温度範囲は15/25℃の夜/日と15〜30マイクロモルのM -2秒-1の光合成光量子束密度（PPFD）を提供するネオン管で12時間の光周期です。多くの夏の種については、温度範囲は15/30℃の夜/日です。 バリアント：S例えばS.などOME種、 halepense、熱処理を必要としています。したがって乱切後、Sの種子45℃で4時間のサイクルと20時間24℃で発芽キャビネットで3日間、その後通常の状態で三日：halepenseは、以下の条件に供されます。 </li></ol> 4.苗の移植と成長<ol><li>移植標準ポッティングミックスを充填したプラスチック製のトレイ（325 X 265 X 95ミリメートル）に十五から二十苗（60％シルト質壌土、15％の砂、15％agriperliteと10％の泥炭 - 体積）。 注：移植は、代わりに直接播種、除草剤処理の性能を最適化するために重要な前提条件である、同じ成長段階における植物の均一なスタンドを得ることができます。 </li><li>数プログレッシブトレイ番号を複製、人口コード、除草剤が試験されている&lt;：固有の識別のためのすべての情報を含むバーコードと、各トレイを識別します。/ LI&gt; <li>フィールド容量またはその付近に基板を維持するために必要に応じて加熱された温室効果、水、植物に入れトレイ。 注：成長温度は雑草種に依存して変化します。多くの場合、テストは秋/冬/春の間に行われているので、光は約150マイクロモルのM -2秒-1および12時間の光周期24、19のPPFDを提供400 Wのメタルハライドランプを使用して補充される。夏の雑草種でC 4光合成サイクルは、通常、より高い光強度を必要とするため、試験は後期の春夏または補充した光強度で行われ、約400マイクロモルのM -2秒-1 14時間の光周期です。 </li><li>水稲に寄生いくつかの雑草種のための異なるプロトコルを使用して、 例えば、A。オオバコ·アクアティカ、S. mucronatusとC. 22で説明したようにdifformis。 <ol><li> 24ラウンドの細胞（55ミリメートルの直径、深64ミリメートル）FILとポリスチレントレイに苗を移植60％シルト質壌土、30％の砂と（体積比）の10％ピートと導きました。 </li><li> 12センチメートルでトレイ深いプラスチック容器を水で満たし、彼らが（ 図1）をフローティング防止するために、ネジ止めのステンレス鋼棒によりダウンbattenedを設定します。 </li><li>土壌表面のレベル以下の1〜2センチメートルで容器内の水位を維持し、藻類の増殖を回避するために、（水の10〜12 Lを含む）の各コンテナに硫酸銅1.5gを追加します。 </li></ol></li></ol> 5.の除草剤処理<ol><li>発芽前除草剤との処置： <ol><li>第3章で説明したように発芽キャビネット内の約3日後に、上述の基板を含むプラスチックトレイに発芽種子を移植し、土壌の層（約1cm）でカバー。これは、苗は、除草剤の効果ではなく、過度の埋没深さに起因して出現しないことを確実にするために重要なステップです。 </li><li>フィールドCAPAに基板を取ります水の入った皿の上に、下部にいくつかの穴を有するトレイを配置することで都市。 </li><li>発芽前除草剤25でトレイを治療、移植後のある日。 </li><li>受け皿から毛細管現象により上方および下方の両方から、必要に応じて水を添加しての基板または近接場の容量にしてください。この手順では、良好な治療効果のために（ すなわち、発芽種子がどこにあるか）適切な深さでの除草剤の耐久性に有利に働きます。 </li></ol></li><li>発芽後の除草剤との処置： <ol><li>彼らは2-3葉期に達したときに植物をスプレー（ すなわち、成長段階拡張BBCH成長スケール26の12〜13）。 </li><li>治療後の日から開始し、 ノビエのために、例えば （雑草種や季節の水の要件に応じて灌漑システムを設定します。それが3分間水を提供して1日4回、定期的な間隔で午前9時から9に午後）。水はDISであります自動スプリンクラー灌漑システムを使用してtributed。 バリアント：グリホサートは、植物ステージBBCH 14-21で適用されます。 </li></ol></li><li>除草剤の準備と配布。 注：（前および発芽後）すべての除草剤は、2つの用量で推奨界面活性剤と市販の製剤として適用される推奨フィールド用量（1×）および3回（3回）こと。 <ol><li>必要に応じて、ラベルの指示に従って、バルク中の界面活性剤溶液を調製。最終濃度は、通常、最終的な体積（ 例えば、0.3％）の百分率として、または体積が単位面積（ 例えば、1ヘクタールL -1）毎に分散されるように表現されます。 </li><li>有効成分の右の濃度を維持するために除草剤（溶質）溶液の溶媒として、界面活性剤溶液を使用してください。最初の最も濃縮除草剤溶液を調製する（3回）。場合、界面活性剤溶液中（または脱イオン水に溶解される商品の数量を計算します界面活性剤は、以下の式を使用して）必要はありません。 線量ハーブ = [（投与量フィールド x線量最大 ）×V フィン ] / V·デル ここで、用量ハーブ =除草剤の量（ml）を、用量フィールド =除草フィールド用量（HAミリリットル-1）、用量maxは =最大用量送達、V フィンは =溶液（L）の最終体積は、V デルはによって送出量を=ベンチ噴霧器（Lヘクタール-1）。 </li><li>希釈（2：1、v / v）の除草剤溶液は、低濃度一方（1×）を調製するために3倍。この手順では、除草剤を計量するか、ピペッティング時にミスを作るチャンスを減少させます。体積が単位面積（Lハ-1）ごとに配信するように除草剤溶液濃度が表現されます。 </li><li>低い除草剤用量（1×）での処理のシーケンスを開始します。このように、同じ除草剤との2つの処置の間に噴霧キャビネットを洗浄する必要はありません。 </li><li>除草剤solutioを配布nは215キロパスカルの圧力で、300 Lヘクタール-1（±1％）を配信精密ベンチ噴霧器を使用して、および0.75メートル秒の速度-1、3フラットファン（拡張範囲）油圧ノズルを装備したブームに。 </li><li>除草剤は、漂白剤を1％を使用して変更されたときに二回噴霧キャビネットを洗浄（v / v）で、次いですすぎます。 バリアント：グリホサート、200 Lヘクタール-1 27の噴霧量で塗布されます。 注：特に注意は非常に生物学的な除草剤は、例えば、スルホニル尿素のスルホメツロンやフラザスルフロンは、使用された場合に支払われなければなりません。後者の場合、アンモニアと、ワン漂白溶液で洗浄し、別の操作を行い（2.5％v / v）を、水で注意深くリンスしました。 </li></ol></li></ol> 6.データの収集および分析<ol><li>自動的に各トレイを識別するバーコードリーダーを介して、治療だけでなく、ビジュアル推定バイオマス（VEB）を生き残った植物の数を記録します。植物はお尻です彼らは関係なく、色やその他の外観のアクティブな成長を示していない場合は死んでいるようessed。 <ol><li>試験された除草剤に応じて3週間または4週間の治療（WAT）の後に評価をする（ 例えば、ACCアーゼ阻害剤のための3つのWATおよびALS阻害剤またはグリホサートのための4つのWAT）。 </li><li> すなわち感受性集団（Sを確認してください）すべての実験では、決してまたはめったに除草剤で処理されなかったサイトで収集した人口を含めることにより、一般的な治療の有効性を評価します。 </li><li>処理された植物の数の割合としてExpressの植物の生存は、（2つの複製の平均値）だけ除草剤処理の前にカウントし、平均値あたりの標準誤差（SE）を計算します。 </li><li> VEBは、同じ人口25の処理され、処理されていないチェック、28との間の植物バイオマスを視覚的に比較して得られる。スコアを、除草剤の影響を受けていない植物のための10の範囲（処理されていない検査と比較して）0にいつ植物が明らかに死んでいる、各処理されたトレイに与えられます。 </li></ol></li><li> S生存者よりも多くの除草剤用量1X、Rで5％〜20％の範囲であったときに、植物の5％未満が、除草剤用量1X、SRを生き延びた二つ除草剤用量で処理から得られた結果に基づいて、4つのカテゴリへの帰属集団生存者は除草剤の用量1倍で20％以上と除草剤の投与量の3倍17で10％以上である場合には、植物の20％が除草剤の用量1XとRRを生き延びました。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

1）種子が成熟した除草剤処理（複数可）を生き残った植物から収集する必要がありますプロトコル内のいくつかのステップは、集団における除草剤耐性の成功を評価するために重要です。マザー工場の種子の成熟は、後に種子の発芽における困難を回避することが重要です。 2）種子の適切な保管が発芽を妨げるカビの増殖を回避することをお勧めします。除草剤パッケージのラベルに報告したように3）苗は、右の成長段階で扱われるべきです。処理されるべき植物がほぼ同じ成長段階に達したように、注意が必要です。植物は、活性成分の正確な濃度は、したがって、検証できないミスを回避して噴霧されるように、4）除草剤溶液を調製し、正確に処理されるべきです。 5）各除草剤処理した後、それを完全に回避するために、溶液を調製するために使用される噴霧キャビネットとガラス製品を清掃することをお勧めします高度に生物学的に活性な除草剤が関与している、特に以下の除草剤処理で汚染。 本明細書に提示されるプロトコルは、容易に種と関心の除草剤に応じて必要な修正を加えた雑草種の広い範囲に適合させることができます。具体的には、種子の休眠と発芽のために破壊する方法は、それぞれの新しい雑草種が考慮されなければならない手順（セクション2と3を参照します）。溶射装置は、時には別の除草剤が使用される場合、 例えば、グリホサートは（セクション5.3を参照）を噴霧キャビネットの異なる設定を必要とし、植物はほとんどの除草剤とのよりも後の成長段階で処理される調整を必要とします。 これらのプロトコルを実行するのに必要な時間と空間が制限要因であることができ、通常の試験に適していないかもしれません。しかし、コストを制限するために、唯一の除草剤の用量を使用することができます。このように情報はまだかどうかTに得ることができます彼人口は耐性があります。アプローチの潜在的な制限は全く抵抗性チェックは実験に含まれていないという事実に関連しています。実際には、原因を評価生物型（関与すなわち、異なる種や除草剤）の数が多いため、多くのチェックはとてもコストが増大、各実験に含まれるべきです。 しかし、一つだけ除草剤の投与量15を使用して全植物バイオアッセイに基づいて、代替技術/プロトコルを介しての利点は、より高い信頼性と抵抗レベルを推定する可能性に関連しています。迅速かつ安価な診断スクリーニング試験はまた、 インビボまたはインビトロで 、考案されている（ 例えば、ペトリ皿のバイオアッセイ8、除草剤の標的酵素29で分光光度検定）。しかし、それらは、定性的な情報を提供し、解像度を区別するための除草剤用量を識別するために、時には困難ないくつかの予備的な作業が必要とistantと感受性植物。 インビトロアッセイはまた、使用される活性成分に応じて適合される必要があります。

<html>除草剤はグローバル植物保護市場1の最大50％を占め、雑草防除対策を最も広く使用されています。彼らは労働集約的で時間のかかる土壌栽培慣行を回避するには、比較的安価なツールであり、最終的に費用対効果の高い、安全かつ収益性の高い食糧生産2をもたらします。しかし、一緒に除草剤の使用上の過度の依存を持つ多くの雑草種に大きな生物季節と遺伝的変異の存在は、しばしば除草剤抵抗性雑草集団の選択をもたらします。非常に特定の代謝ターゲット3-5と選択性除草剤の導入が飛躍的に年間で抵抗症例数が増加しています。現在までに、世界中の240雑草種（140双子葉植物と単子葉植物は100）アクション（SOA）4の異なる除草剤サイトに対する抵抗性を進化させてきました。これは、持続可能な作物生産のための雑草管理と一般的に多くのための主要な関心事です。 頻繁に温室で行う信頼性試験、に基づいてe_content &quot;&gt;抵抗の早期検出は、除草剤抵抗性雑草を管理するための重要なステップである。別のアプローチがよう、目的、精度、時間と利用可能なリソースの要求レベルに応じて開発されていますよく6-12を考え雑草種とし ​​て。しかし、新しい雑草バイオタイプの抵抗状態の確認が（必要とされる場合、すなわち、に属する1つまたは複数の除草剤に耐える能力を含むいくつかの生理学的特性を共有する個人のグループ、通常、それらを制御することになる用量で使用される特定の基）、強固な全植物バイオアッセイは、制御された環境4、11で実行される必要があります。 バイオタイプはただ1つの除草剤に耐性めったにあります。各生物型は、従って、一定の抵抗パターンを特徴とする、除草剤、SOAの、すなわち、数と種類は、それは、与えられた抵抗によってに耐性であります各除草剤13のレベル。クロスまたは複数の抵抗5のパターンの早期かつ信頼性の高い決意、14は、圃場抵抗性管理のために重要です。 それは、その除草剤抵抗性は自然寛容とは何の関係もない言及する価値があるいくつかの除草剤、 例えば、ACCアーゼ阻害除草剤、単子葉植物種対2,4-D対双子葉植物種、 スギナarvense対に向けていくつかの雑草種の展示グリホサート。 本稿では、除草剤（複数可）によって制御不良が報告されていた分野でサンプリング推定される除草剤抵抗性生物型をテストするための堅牢なアプローチを提示します。関連する雑草種に関連する標準的なプロトコルに関連する変異体が提示されています。唯一の除草剤の投与量15を使用して全植物バイオアッセイのいずれかに基づいて、代替技術/プロトコル経由での利点、または8が高いreliabに関連しているペトリ皿に種子を処理しますilityとための実験における2つの除草剤の投与量を含めることの抵抗レベルを推定する可能性。しかし、ルーチン抵抗試験のため、同一の方法がそのようにコストを削減し、唯一の除草剤用量で適用することができます。 同様に、抵抗状態の確認を可能にするように、得られた情報は、両方の研究は、以下の工程を最適化し、および/または音響抵抗管理戦略を考案するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Paper bags</td><td>Celcar SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic dishes</td><td>ISI plast S.p.A.</td><td>SO600</td><td>Transparent plastic</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 95-98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven fabric</td><td>Carretta Tessitura</td><td>Art.TNT17</td><td>Weight 17 g m&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Chloroform &gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Potassium nitrate &gt;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8394</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td>Giganplast</td><td>1875/M</td><td>600 x 400 x 110 mm</td></tr><tr><td>Plastic trays</td><td>Piber plast</td><td>G1210A</td><td>325 x 265 x 95 mm</td></tr><tr><td>Polystyrene trays</td><td>Plastisavio</td><td>S24</td><td>537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)</td></tr><tr><td>Copper sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451657</td><td></td></tr><tr><td>Agriperlite</td><td>Blu Agroingross sas</td><td>AGRI100</td><td></td></tr><tr><td>Peat</td><td>Blu Agroingross sas</td><td>TORBA250</td><td></td></tr><tr><td>Germination cabinet</td><td>KW</td><td>W87R</td><td></td></tr><tr><td>Nozzles</td><td>Teejet</td><td>XR11002-VK, TP11001-VH</td><td>The second type of nozzles are used only for glyphosate</td></tr><tr><td>Barcode generator</td><td>Toshiba TEC</td><td>SX4</td><td></td></tr><tr><td>Labels with barcode</td><td>Felga</td><td>TT20200</td><td>Stick-in labels with rounded corners</td></tr><tr><td>Barcode reader</td><td>Cipherlab</td><td>8300-L</td><td>Portable data terminal</td></tr><tr><td>Bench sprayer</td><td></td><td></td><td>Built in house</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Herbicides included in the results:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial product&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Active ingredient&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Altorex</td><td>imazamox</td><td>BASF</td><td></td></tr><tr><td>Azimut</td><td>florasulam</td><td>Dow AgroSciences</td><td></td></tr><tr><td>Biopower</td><td></td><td>Bayer Crop Science</td><td>Surfact to be used with Hussar WG</td></tr><tr><td>Dash</td><td></td><td>BASF</td><td>Surfact to be used with Altorex</td></tr><tr><td>Granstar</td><td>tribenuron-methyl</td><td>Dupont</td><td></td></tr><tr><td>Gulliver</td><td>azimsulfuron</td><td>Dupont</td><td></td></tr><tr><td>Hussar WG</td><td>iodosulfuron</td><td>Bayer Crop Science</td><td></td></tr><tr><td>Nominee</td><td>bispyribac-Na</td><td>Bayer Crop Science</td><td></td></tr><tr><td>Roundup</td><td>glyphosate</td><td>Monsanto</td><td></td></tr><tr><td>Trend</td><td></td><td>Dupont</td><td>Surfact to be used with Granstar and Gulliver</td></tr><tr><td>Viper</td><td>penoxsulam</td><td>Dow AgroSciences</td><td></td></tr><tr><td>Weedone LV4</td><td>2,4-D</td><td>Isagro</td><td></td></tr></tbody></table>

protocols for robust herbicide resistance testing in different weed species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

推定上の耐性集団の抵抗状態を評価するためには、除草剤の有効性を確認するためにアッセイにおける感受性の検査を含むことが基本です。 P.で行ったスクリーニング試験の結果rhoeas集団は、小麦畑に寄生雑草は、感受性の検査（09から36）のと疑わ耐性1（10-91）上の4つの発芽後除草剤の有効性が示されている図2に報告されています。人口09から36は、完全に唯一の植物は、フロラスラム及びトリベヌロン-メチル（ 図2）は、試験した他の二つのALS除草剤の投与量1×生存したヨードスルフロン阻害剤ALSによって制御しました。その代わりに、人口10から91の植物の約60％がヨードスルフロンおよびトリベヌロン - メチルの両方の除草剤の投与量を生き残り、約50％がフロラスラムの1倍用量を生き延びました。これらの結果は、人口10から91は、ヨードスルフロンおよびトリベヌロン - メチルおよび耐性に（RR）は非常に耐性があることを確認します（R）は、フロラスラムします。別の応答は、2,4-D、広くコムギ双子葉雑草を制御するために使用される別のSOA（ すなわち、それは、内因性のオーキシンを模倣する）を有する除草剤で観察されました。 Sチェックの植物の33％のみが、用量1倍で、この除草剤で殺され、VEB値は&gt; 20％（ 図2）でした。人口10から91は、この除草剤かに耐性である場合は、チェック集団に対する有効性の欠如は確認していません。この場合には、再度実験を行うことが推奨され、その結果が確認された場合、S集団を変更します。感受性検査の良好な制御の例を図3に報告されている。 ヒエ属 。人口07-16L完全推奨フィールド用量（1×）ですべての除草剤によって制御されました。この場合には、人口08から42、 すなわち、アジムスルフロン、ビスピリバック-ナトリウム、イマザモックスおよびペノキススラム、試験したすべてのALS阻害剤に高度に交差耐性であることを述べることが可能です。処理されていないCH両集団のECKが左側に報告されます。これらの植物は、VEBを計算するために使用されます。バイオマスの量が視覚的に推定されるバイオマスが処理されていないに匹敵するとき10に、任意の緑の植物組織のない複製のために、処理されていないかを確認するには10のスコアを与え、その後、0からスコアを割り当てることにより、トレイトレイ検査（ 図3）。 出力の別の例を図4、 ライグラス属の植物の生存に報告されています。グリホサートに表示されます。試験された集団は、グリホサートが異なる選択圧（ すなわち、時折または1-2年間の治療または年間3回以上）発揮され、小麦ベースの作付体系に集めました。その成長STで毎年雑草（ すなわち、therophytes）の最小値と最大推奨フィールド量を表す、AEヘクタール-1 gの480と1440：植物は、グリホサートの2つの用量を使用して、初期の分げつ段階（BBCH 14-21）で噴霧しました。年齢。データは、処置の4週間後に採取しました。両方の実験に基づいて、試験した集団の7は、最低用量適用が、集団403の植物の50％のみで、80％以上（集団343、383、384、403、509、512および537）の生存率を持っていたし、 509は最高グリホサート用量を生き延びました。人口509のほんの一部の植物は最低用量を生き延び、人口508は完全に任意の用量で制御したのに対し、一集団は、1倍の用量で40％程度の生存率を示しました。まとめると、これらの実験は、多くの場合、除草剤の使用のフィールド履歴を反映グリホサートに対する抵抗性の異なるレベルを示しました。グリホサート耐性のレベルはより強く処理された集団のために高かった： すなわち、選択圧の年の年間フィールドアプリケーションの数と数が多かったです。 1つの除草剤（ 図4）について記載したプロトコルは、diffeを有する多数の他のものに適用することができのSOA借ります。このように、一つ以上の集団の耐性パターンを決定することができます。 ノビエの抵抗パターンの変動の一例。集団は、表1に報告されている。農家から得られた除草剤の使用と作物管理の歴史的記録をALS阻害除草剤は、選択物質（ すなわち、ペノキススラムまたはイマザモックス）であることが示されました。抵抗試験は、したがって、3 ALS阻害除草剤（アジムスルフロン、ペノキススラム及びイマザモックス）異なる化学ファミリーに属する、と別のSOA、ACCアーゼ阻害除草剤のプロホキシジムを持つ1つの除草剤を用いて実施しました。影響を受けやすい検査（07-16L）は完全に試験された全ての除草剤（ 表1）により制御しました。三つの耐性パターンが検出されました：13集団のみALS阻害剤に耐性であるとして得られた、4集団は、ACCアーゼ阻害剤プロホキシジムに耐性であるようになった、と3つの集団は、複数を示しました<html>両方のACCアーゼ阻害剤プロホキシジムやALS阻害剤に対する抵抗性パターン。多剤耐性集団の二つがALS阻害剤アジムスルフロンとの唯一の治療を生き延びたが、かなりペノキススラムによって制御しながら、それは別の生物型を区別することが可能である各抵抗パターンの中では、 例えば、ALS阻害剤に耐性の4集団は、スルホニル尿素アジムスルフロンでのみ治療を生存し、イマザモクス。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig1.jpg"/> C.図1の例difformis、水稲に寄生雑草種、実験のセットアップ。ポリスチレントレイはプラスチック容器に入れ、浮遊それらを防ぐために、ネジ止めのステンレス鋼棒によってブロックされます。水は水稲の条件を模倣するために、土壌表面のレベルより下1〜2センチメートルに維持されます。写真は、処置の4週間後に採取しました。p_upload / 52923 / 52923fig1large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig2.jpg"/> 2 Pの図2.レスポンス除草剤発芽投稿するrhoeas集団 。ヨードスルフロン、トリベヌロン、フロラスラムと2,4-Dの効果は、植物の生存（青いバー）と目測バイオマスで（3回）することをお勧めフィールド用量（1×）で3回で試験（ VEB;赤いバー）、感受性検査（09から36）の耐性人口（10-91）の。評価は、4週間後に除草剤処理を行いました。植物の生存及びVEBは、処理された植物の数ではなく、処理されたチェックのVEB（％）の百分率として表されます。植物の生存の20％の水平線は、植物が用量1倍で処理されている抵抗性と感受性の集団間の識別閾値を表しています。垂直バー2つの複製の平均値に計算された標準誤差を表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52923/52923fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig3.jpg"/> 2 ノビエのスクリーニングの3ビジュアル結果を図。集団。感受性のチェック、07-16L（S）、および抵抗性の人口、08から42は、（底部に報告された）、2つの用量、1倍と3倍に（右に報告された）4 ALS阻害剤を用いて試験しました。すべての植物は既にその用量で制御されたため、Sチェックの線量1Xの結果のみが報告されています。 VEBスコアの3つの例を赤に報告されている：0 =死んだすべての植物は、10 =すべての植物が生存し、バイオマスが（左に報告された）処理されていない（NT）のチェックに匹敵する、5 =バイオマスは中の約半分であります処理されていないのトレイチェックしてください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52923/52923fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig4.jpg"/> 10 ライグラス属のための植物の生存の4パーセント図。二つの実験で記録されたグリホサート。植物の生存を用いて試験集団 （EXPのための青いバーとオレンジのバーがあります。それぞれ、IおよびII）。データは、処理された植物の数の割合（％）として表されます。二つの感受性のチェックが完全に用量1倍で制御したので、グラフで報告されていません。 2つの用量は、製品ラベルに報告される用量は、最小（1×= 480グラムAEヘクタール-1）と最大（3回= 1440グラムAEヘクタール-1）を試験しました。植物の生存の20％の水平線は、植物が御馳走した抵抗性と感受性の集団間の識別閾値を表し、用量1倍でED。垂直バーは、2つの複製の平均値に計算された標準誤差を表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52923/52923fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52923/52923table1.jpg"/> ノビエの21集団の表1抵抗状態。感受性検査（07-16L）は太字で報告されています。抵抗レベルは、4つのカテゴリーに応じて試験した4つの除草剤のそれぞれについて、（1 ACCアーゼ阻害剤、プロホキシジム、および3つのALS阻害剤、アジムスルフロン、ペノキススラム及びイマザモックス）に報告されている：植物のS = 5％未満が生存除草剤の用量1倍、SR =植物の生存には除草剤の用量1倍、5％から20％の範囲であり、Rは、植物の20％以上は、除草剤用量1Xを生き延び= RR =植物の生存は、除草剤の用量で20％以上でした1倍と3倍の用量で10％を超えます。異なる耐性パターンが強調表示されます：赤=抵抗が唯一の唯一のALS阻害剤（複数可）、ACCアーゼ阻害剤に対するオレンジ=抵抗にACCアーゼ阻害剤、黄色=抵抗にし、少なくとも一方のALS阻害剤。

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Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

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14.5K ビュー.  National Research Council (CNR), Italy. A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

遺伝学

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

環境学

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes onto humans. For this reason, transferable pesticide residue experiments are required for registration and re-registration by the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although such experiments are required, limited specificity is required pertaining to experimental approach. Experimental approaches used to assess pesticide transfer to humans including hand wiping with cotton gloves, modified California roller (moving a roller of known mass over cotton cloth) and soccer ball roll (ball wrapped with sorbent strip) over three treated turfgrass species (creeping bentgrass, hybrid bermudagrass and tall fescue maintained at 0.4, 5 and 9 cm, respectively) are presented. The modified California roller is the most extensively utilized approach to date, and is best suited for use at low mowing heights due to its reproducibility and large sampling area. The soccer ball roll is a less aggressive transfer approach; however, it mimics a very common occurrence in the most popular international sport, and has many implications for nondietary pesticide exposure from hand-to-mouth contact. Additionally, this approach may be adjusted for other athletic activities with limited modification. Hand wiping is the best approach to transfer pesticides at higher mowing heights, as roller-based approaches can lay blades over; however, it is more subjective due to more variable sampling pressure. Utility of these methods across turfgrass species is presented, and additional considerations to conduct transferable pesticide residue research in turfgrass systems are discussed.

Transferable pesticide residue experiments in turfgrass systems are integral components of human risk exposure assessments. Experimental approaches to measure transferable residues should be adjusted to the human interaction of interest and turfgrass system dynamics. Three transferable pesticide residue protocols are presented and the suitability across three turfgrass systems is discussed.

芝草システムズに譲渡残留農薬を定量化するためのプロトコル

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium hirsutum) varieties to improve nematode management. Most protocols involve extracting vermiform nematodes or eggs from the cotton root system or potting soil to determine population density or reproduction rate. These approaches are generally time-consuming with a small number of genotypes evaluated. An alternative approach is described here in which the root system is visually examined for nematode infection. The protocol involves inoculating cotton seedling 7 days after planting with vermiform nematodes and determining the number of females attached to the root system 28 days after inoculation. Data are expressed as the number of females per gram of fresh root weight to adjust for variation in root growth. The protocol provides an excellent method for evaluating host-plant resistance associated with the ability of the nematode to establish an infection site; however, resistance that hinders nematode reproduction is not assessed. As with other screening protocols, variation is commonly observed in nematode infection among individual genotypes within and between experiments. Data are presented to illustrate the range of variation observed using the protocol. To adjust for this variation, control genotypes are included in experiments. Nonetheless, the protocol provides a simple and rapid method to evaluate host-plant resistance. The protocol has been successfully used to identify resistant accessions from the G. arboreum germplasm collection and evaluate segregating populations of more than 300 individuals to determine the genetics of resistance. A vegetative propagation method for recovering plants for resistance breeding was also developed. After removal of the root system for nematode evaluation, the vegetative shoot is replanted to allow the development of a new root system. More than 95% of the shoots typically develop a new root system with plants reaching maturity.

Here, a protocol is presented for the rapid non-destructive screening of cotton genotypes for reniform nematode resistance. The protocol involves visually examining the roots of nematode-infected cotton seedlings to determine infection response. The vegetative shoot from each plant is then propagated to recover plants for seed production.

レニフォーム線虫抵抗に対する綿のジェノタイプのスクリーニング

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

モニタリングの殺虫剤抵抗性のためのバイオアッセイ

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

生物学

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

医学

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

特徴付ける草食動物の耐性機構：上Spittlebugs Brachiaria属。例として

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice (Oryza sativa ssp.)

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously applied herbicides has presented the need for additional management methods. Allelopathy is a physiological process that some plant species possess that provide the plant with an advantage over its neighbors. Allelopathic crop varieties would be equipped with the ability to suppress the growth of surrounding competitors, thus reducing potential yield loss due to weed interference. This paper focuses on the construction and operation of a stair-step assay used for the screening of the allelopathic potential of a donor species (Oryza sativa) against a receiver weed species (Echinochloa crus-galli) in a greenhouse setting. The structure described in this paper serves as a stand for the plant samples and incorporates a timed watering system for the accumulation and distribution of allelochemicals. Allelochemicals produced by the plant roots are allowed to flow downward through a series of four pots separately into a collection tank and recycled back to the top plant through electric pumps. This method of screening provides an avenue for the allelochemicals from the donor plant to reach receiver plants without any resource competition, thus allowing quantitative measurement of the allelopathic potential of the selected donor plant. The allelopathic potential is measurable through the height reduction of the receiver plants. Preliminary screening data for the effectiveness of this method demonstrated height reduction in the receiver species, barnyardgrass (E. crus-galli), and thus the presence of allelopathic residues from the donor plant, weedy rice (Oryza sativa).

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice Oryza sativa ssp.

Allelopathy has shown promise as a useful supplemental weed control strategy in cropping systems. To determine the allelopathic potential of a desired plant specimen, a stair-step screening method is provided.

ウィーディライスのアロパシーポテンシャルにアクセスするための繰り返し可能な階段ステップアッセイ(オリザサティバssp.

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously ...

別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

要約

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植物病原体の遺伝子操作