著者は、データの統計的分析のため博士 Su 博士を認めたいと思います。著者もありがとう博士 McClure、DVM、博士 DACLAM、麻酔に関する彼女のアドバイスと痛み管理プロトコルが研究に使用します。このプロジェクトは、研究 (12678v) および米国農務省セクション 1433 資金 (2090) 副社長の西保健大学理学部学務係からの補助金によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウエスタン大学の保健学科によって承認されています。
1. 分離とウマ臍帯行列から MSCs の拡大
<ol><li>観察 foaling 後大人の牝馬 (妊娠している) から胎盤を入手して無菌胎盤から臍帯を分離します。おいて臍帯リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) の 4 ° C での転送中に処理まで。</li>
	<li>1% と室温 PBS で 2 回臍帯を洗う P/S 50 mL のチューブに。セクション 2 インチ長さ 150 mm の板と P/S 50 mL のチューブの 2 つのまたは 3 回まで血液のほとんどをすすいだ 1% 室温 PBS で洗浄断章に臍帯。</li>
	<li>船を公開する縦へその緒を切る。2 動脈、静脈、鉗子、はさみを使用してコードから尿の茎などの血管を削除します。メスで削って 150 mm の板の上にゼリーのようなマトリックスの周囲血管臍帯マトリックス (Wharton のゼリー) を収集し、細かい部分にゼリーをみじん切り。</li>
	<li>場所ワルトン 15 ml の PBS の 0.1% (w/v) コラゲナーゼ タイプ IA ソリューションの 50 mL チューブに 2-3 臍帯断片 (約 12-15 g) から。3-4 時間溶解するまで穏やかな揺れで 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>15 分間 300 x g で消化組織を遠心し、上清を吸引します。室温 PBS 1% の 15 mL で消化組織を再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、5 分間 150 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。二回以上洗濯を繰り返します。</li>
	<li>室温 PBS 1% の 15 mL のセルを洗浄再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、100 μ m セル ストレーナー付け, 150 x g で 5 分間遠心によるひずみ、上清を吸引します。</li>
	<li>低血糖ダルベッコを混合することによって培養液 (CM) を準備変更イーグル培地 (LG DMEM) ウシ胎児血清 (FBS) と 1 %p/s. 濾過により培地を滅菌します。</li>
	<li>37 ° C に加温 CM の 10 mL で緊張した細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜる、25 cm2培養フラスコに移す、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい変更 CM 文化文化、継代時に 70-80% の合流点に達するまで 3 日おき。</li>
	<li>文化を通路にフラスコから CM を吸引、室温 PBS の 5 mL で 2 回洗浄、3 ml の 5 分の 37 ° C で 0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のデタッチします。</li>
	<li>トリプシン/EDTA 37.0 ° C に加温 CM の 6 ml を中和する、ピペッティングで混ぜる、150 x g で 5 分間遠心 15 mL チューブに移す、上清を吸引します。CM の 1 mL 中の剥離細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜます。トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。5,000 セル/cm2で 25 cm2培養フラスコに再シードし、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい</li>
</ol>2. UCM mscs キトサン膜上で培養した回転楕円体の準備
<ol><li>1% (w/v) キトサン溶液の 100 mL を準備するには、キトサンの 1 g を加えて 99 mL の蒸留水 (dH2O)、および磁性攪拌器でよく混ぜます。</li>
	<li>氷酢酸の 670 μ L を追加し、キトサンを溶解して粘性になるまで混合を続行します。これは通常 3-4 時間がかかります。</li>
	<li>12 ウェル培養プレートの各ウェルにキトサン溶液 500 μ L を追加し、キトサン ソリューションを均等に分散し、すべて底面のカバー プレートを旋回します。</li>
	<li>キトサン コーティング ソリューション平板層流 24 時間一晩カバーなしキャビネットを乾燥させます。一度乾燥、薄膜を形成・ プレートに付着されます。</li>
	<li>各ウェルに 0.5 N 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の 1 mL を追加してキトサン フィルムを中和し、室温で 2 時間インキュベートします。各ウェルから NaOH を吸引し、それぞれを洗ってよく dH2O の 1 mL で 3 回。それぞれを洗って一度 70% エタノール (エタノール) 1 mL でも。</li>
	<li>キトサン フィルムを殺菌するには、層流れのキャビネットで一晩 70 %etoh それぞれによく、インキュベートの 1 mL を追加します。次の日に各ウェルから残りのエタノールを吸引します。それぞれを洗っても 1 ml 滅菌 PBS の 3 回。キトサン フィルム流カバーなし一晩キャビネットの下紫外光を滅菌します。</li>
	<li>フォームは UCM MSCs の回転楕円体に種子を拡大し 5,000 セル/cm2、各ウェルに、細胞を継代そして 5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい 注: セルは、低酸素症又は治験責任医師の関心に応じて常孵化することができます。</li>
</ol>3 フローサイトメトリー分析表面マーカーの発現
<ol><li>
単一細胞懸濁液の準備
	<ol>
<li>標準プレート<ol>
<li>各ウェルからメディアを削除し、室温 PBS で 2 回洗います。</li>
			<li>室温で 5-10 分の 12 ウェル プレートの各ウェルに、細胞解離試薬の 500 μ L でセルをデタッチします。</li>
			<li>インキュベーション後、染色バッファー (0.5 %bsa を含む PBS) 1 ml を各ウェルに、細胞をデタッチするピペッティングで混ぜます。</li>
			<li>15 mL の円錐管 150 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>キトサン プレート<ol>
<li>先端が 1,000 μ L ピペットを使用して吸引媒体によってすべての回転楕円体を収集します。15 mL の円錐管に集められた媒体。媒体を収集した後、PBS の 1 mL を追加してよく洗うし、同じ 15 mL の円錐管に洗浄 PBS を転送します。</li>
			<li>5 分間 150 x g で回転楕円体を遠心し、上清を除去します。</li>
			<li>細胞解離試薬 (例えばaccutase) を 500 μ l 添加し、室温で 5-10 分の間孵化させなさい。ミックスによるピペット 1 mL 先端まで回転楕円体を切り離して考えるし、表示されなくなります。</li>
			<li>単一細胞懸濁液や 150 x g で 5 分間遠心に染色バッファーの 1 つの mL を追加します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
洗浄のセル
	<ol>
<li>円錐管から上澄みを除去し、再バッファーを染色冷 3 mL のセルを中断します。このステップから氷上実験を通して細胞を保ちます。</li>
		<li>5 分 (洗濯) 300 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>2 回洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セルを汚す
	<ol>
<li>5 分間 300 × g で遠心し、上清を除去します。</li>
		<li>トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。50 μ L ブロックで 1 x 10 の6セルを再停止 (PBS 含む 10% 馬血清) をバッファーし、氷の上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>10 μ L フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗体 (CD44、CD90, CD105、CD34、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) クラス II、または各抗体アイソタイプ コントロール) とバッファーを染色の 40 μ L を追加し、氷の上の 1 h の光から保護します。</li>
		<li>染色バッファー冷 3 mL を加えるとミックス、5 分 300 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。</li>
		<li>二回洗濯を繰り返します。</li>
		<li>再バッファーを染色の 0.5 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
		<li>7 AAD (生存率色素) の 5 μ L を追加し、氷の上で 30 分間インキュベート</li>
		<li>フローサイト メーターによる細胞染色サンプルを分析します。小さく SSC と FSC によって破片を除外し、7 AAD の吸収性の低い実行可能なセルを識別します。プロット FL1 と FL2 に、y 軸と x 軸、それぞれ。アイソタイプ コントロールを使用すると、対角線上のゲートを作成できます。地域で積極的に陽性細胞の割合を測定します。少なくとも 20,000 イベント/サンプル (補足図 1) をカウントします。</li>
		<li>ゲーティング生菌と自動蛍光抗体染色細胞の割合を測定し、染色のアイソタイプ コントロールのセルの割合を減算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 両側膝蓋腱欠損モデル ラットの
<ol><li>ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g) を選択します。このモデルに使用されるラットの比較的大きいサイズに注意してください。</li>
	<li>麻酔し、誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までマスクを介して配信される 2 L/分 100% 酸素を 8% セボフルラン ラット人工眼の潤滑剤を適用します。</li>
	<li>先制鎮痛としてメロキシカム (1 mg/kg の筋肉内注射を管理します。</li>
	<li>暖かい水で満たされ、皮膚傷害を防ぎながら体の温度と位置を維持するために布で覆われた 2 つの 0.5 L 水ボトル間ネズミを配置します。テーブルにそれぞれの端をテープします。低体温症のリスクを減らすためには、バブルラップ (図 1) と体をカバーします。</li>
	<li>5% セボフルラン 1 L 100% 酸素混合背臥床水加熱パッドの上に動物の鼻の円錐形の連続的な流れで麻酔を維持します。</li>
	<li>皮膚外傷を避けるためには、施術部位を切てはいけない。代わりに、両方の抑圧に除去クリームを適用します。舌圧子を使用して、クリームや髪を削除します。</li>
	<li>クロルヘキシジン酸スクラブで手術部位をスクラブし、3 回を 70% エタノールでリンスします。</li>
	<li>抑圧の craniomedial の側面に、遠位、近位方向に滅菌 #15 メス刃で皮膚を切開します。膝蓋骨のレベルに近位部に約 1 cm の切開を開始し、約 5 mm 脛骨結節の遠位はそれを拡張します。</li>
	<li>#15 メス刃を持つ基になる皮下組織の解放によって膝蓋腱を公開するスキンが反映されます。</li>
	<li>
#15 メス刃を使用して、脛骨粗面に膝蓋骨の遠位面から各膝蓋腱 (1 mm) の中央 3 分の 1 を切除します。
	<ol>
<li>各肢 (図 2) の欠陥のサイズを標準化するためのテンプレートとして腱に対して 0.99 mm 径 Kirschner 金網を合わせます。</li>
		<li>(図 3) の腱の中央部分を分離する #15 メス刃を Kirschner 線の各側に 2 全層切開を作る。近位および遠位罰金アイリスはさみ (図 4) で中央部を切除します。</li>
		<li>膝関節の筋膜を閉じる前に 5.5 で説明したように、適切な治療グループの血栓 (混合細胞懸濁液および ACP) を挿入します。十字パターンと筋膜と皮膚 5-0 polyglactin 910 縫合糸 (図 5) を使って皮のパターンを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>対側の抑圧に手順を繰り返します。 注: 1 つの欠陥は無作為に治療 (キトサン エアコンまたは標準プレート上で培養した幹細胞)。対側の欠陥が内部統制として機能する、空のまま。</li>
	<li>手術後管理エンロフロキサシンの 4 錠 (2 mg/錠、経口投与、1 日 1 回) とメロキシカム錠 (2 mg/錠経口投与、1 日 1 回) を 7 日間。これらの用量は実験動物の獣医師が推奨され、IACUC プロトコルで承認します。</li>
</ol>5. 膝蓋腱欠損内の MSCs の配信
<ol><li>2 L/分 100% 酸素マスクを届け誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までに 8% セボフルランを膝蓋腱欠損を作成使用されていない健康なラットを麻酔します。</li>
	<li>収集する 5 mL の血液心臓穿刺によって麻酔 Sprague-dawley ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g)、5 mL シリンジで酸-クエン酸-ブドウ糖 (5:1 v/v) 1 mL を含む 20 G 針で。</li>
	<li>ペントバルビ タール (100 mg/kg)、同じ麻酔中の intracardial 注入による心臓穿刺・採血後のラットを安楽死させます。</li>
	<li>室温で 15 分間 350 x g でサンプルを遠心します。上清を転送し、使用するまで-20 ° C で因数 (各 120 μ L) を格納します。</li>
	<li>体内注入の直前に上記の因数を解凍しミックス 0.5 x 10 と 20 μ L6 MSCs (1.9 または 3.1.2.1) からトリプシン/EDTA を用いた標準的な板から分離または (PBS/中) とフラッシュしてキトサン プレートから収集します。</li>
	<li>解凍プラズマ プラズマをアクティブにし、血栓の形成を誘導する 96 ウェル プレートのウェル内の残りの 100 μ L に 10% 塩化カルシウム (CaCl2) の 6 μ L を追加 (エアコン プラズマをアクティブ化: ACP)。</li>
	<li>細胞懸濁液 (20 μ L) をミックスし、ACP (100 μ L) (図 6) 血栓を形成します。膝関節の筋膜を閉じる前に作成した膝蓋腱欠損内血栓を配置 (4.10.3 の手順を参照してください)。</li>
</ol>6. 機能的予後
<ol><li>ラットのラット顔をしかめるスケール (RGS)37,38に基づいて、着床に腫れ、痛みの兆候を 1 日 2 回を監視します。 注: スコアリング システム (0-6) (0-3) サポート前肢と後肢の時間立っているを含む 3 の活動に基づく歩行の機能を評価するため開発された、時間自力で後肢に立って (0-2) と 17 cm プラスチック製ケージの壁 (0-1) (を登る能力表 1)。</li>
	<li>朝と夕方には平均スコアを計算する各時点のラットの 2 つの後肢に立って活動を評価します。</li>
	<li>ラット正常に登頂両後肢と 17 cm プラスチック製ケージの壁を登る能力を評価します。</li>
</ol>7. 総外観と膝蓋腱の病理組織学
<ol><li>(炎症の評価) に 7 日目にラットを安楽死させるか (組織の治癒を評価) に 28 日の投稿 (100 mg/kg) ペントバルビ タール麻酔 8% セボフルランと 2 L 100% 酸素マスクを介して配信の intracardial 注射治療。</li>
	<li>安楽死した後膝蓋腱-脛骨結節台メスとはさみを収穫します。軟部組織や靭帯膝蓋腱を除いて、抑圧の周りを削除します。</li>
	<li>外見と (図 7) 腱の肥厚のため検体を調べる。</li>
	<li>腱の近位部と外側面に 5.0 Polydioxanone の外科医の結び目を置くことによって試料に合わせます。10% 中性緩衝ホルマリン液で検体を修正し、各腱の中間部分から横断 (5 μ m) を取得します。</li>
	<li>ヘマトキシリンとエオシン、次の標準的なプロトコルを染色、マッソンの Trichrome を使用してセクションを染色します。</li>
	<li>炎症などの病理学的変化と同様、欠陥、内血腫の存在を検出するセクションを確認します。</li>
	<li>コラーゲン生、血管新生、および軟骨形成 (表 2)39度に基づいて、以前に発行されたスコアリング システムを使用してセクションの組織学的スコアを評価します。</li>
</ol>

著者はある利益相反を開示します。

馬のセルは、最終的に馬の自然な伸張の管理の候補者のアプローチをテストしていきますのでこのプロジェクトに選ばれました。確かに、馬の腱損傷は浅指屈筋と人間41アキレス腱の生物学的類似性のため男で寛解の自然なモデルとして訴えています。細胞表面マーカー CD44、CD90, CD105、CD34 と MHC II は、細胞、細胞療法42国際社会によって推薦の基準に従って診療に選ばれました。最近の調査で eqUCM MSCs され、CD44 のために肯定的な培養条件に関係なく CD34 と MHC II の負。CD90 の CD105、表面マーカーの発現の点で MSCs の基準を満たすことにより標準的な条件下で培養した細胞も陽性。さらに、本研究は、eqUCM MSCs は、ヒト MSCs19,20の以前のレポートを確認するキトサン フィルム上培養スフェロイドの形成の最初のレポートです。3 D 細胞培養の技術は何十年も生理学的ニッチに似た環境を作成することを目指して広く検討されています。確かに、今回示したOct4、 Sox2, Nanogと改善された分化の改良された幹細胞性遺伝子発現レベル、潜在的な他レポート19,20に一貫しています。他は改良された免疫調節特性43と硝子軟骨再生44 MSCs 回転楕円体を使用して報告。スピナー フラスコ、回転細胞バイオリアクター、非付着プレートなど様々 な 3次元培養技術、間天然および合成行列、キトサン フィルムはいくつかの理由のため魅力的に見えます。このアプローチは、高価な機器を必要としない、費用対効果と比較されます非付着板に合成行列、キトサン水産業の副産物であるので。キトサン膜の細胞を培養することは技術的に容易です。組み合わせることで、これらの利点は臨床応用をする大規模な45上。
両側膝蓋腱モデルを提案するここで罹患率の面で許容範囲が表示されます。最近の研究では合併症は認められなかった。検出可能な生体力学的・組織学的変更を許可するのに十分な大きさの欠陥によって誘起されるストレスの影響のリスクを特に心配ができました。これらの懸念は、サイズと腱の傷害の前臨床モデルの成熟度に関連する従来研究に基づくこの研究用マウスにラットの選択を求められます。'ウィンドウ欠陥' または中央第三膝蓋腱欠損は、腱の治癒と豊胸を検討するウサギ46とラット30,31に記載されています。組織学31,39, テスト30,31, および前のヴィヴォ蛍光生体ラット腱修復の勉強のため再現性のある膝蓋腱 'ウィンドウの欠陥' モデルが見つかってください。31をイメージングします。この研究では、欠陥のサイズは膝蓋腱の中央 3 分の 1 に相当してテンプレートとして 0.99 mm 直径 Kirschner ワイヤーで標準化されました。これらの寸法は腱治癒手術後の破裂を引き起こすことがなく研究には十分だったラットはマウスと解剖学的より大きいサイズのため怪我・治療・結果の措置の再現性の向上、大規模な欠陥に対応できます。
本研究ではラットに投与鎮痛プロトコルは、RGS37,38の評価と術後疼痛の制御に有効でした。この採点システムは、それは以前ラット37,38の痛みを反映して術後の行動変更の検出として検証されたのでここに下されました。RGS は、軌道強化、鼻・頬が平坦化、耳/ひげの変更などを識別する比較的単純な兆候に基づいています。ラットには、この鎮痛プロトコルの有効性をさらにサポートしていますこの研究を通して通常の食物摂取も維持されます。確かに、以前のレポートは、メロキシカム47などの非ステロイド性抗炎症薬投与の術後の痛みと体重の増減と相関を発見しました。このエージェントは、本研究で選択した、プリエンプティブな管理はラット37,48犬49, に発見されました手術直前に抗炎症剤の投与の研究から派生しました。外科的に誘発される痛みを減衰します。関数は、スコアリング システム両方の骨盤の肢の使用を評価するように設計を使用して術後の疼痛の追加のインジケーターとして評価されました。ここで選択した 3 つの活動は、運動と骨盤の肢の重量を負担する意思の範囲の一般的な評価を提供します。この得点システムはラット50,51で両方の静的および動的な機能回復の研究から派生した、観測機能の成果の経過を比較する設計されました。スコアは、二国間の腱欠陥が通常 28 日以内に戻ると 7 日で機能の一時的な低下を誘発を示します。RGS より整形外科の条件に二次的痛みの検出でより敏感に機能スコアが表示されます。アキレス機能インデックス28など腱の治癒を評価し、足のストライド対策51、または巨視的スコアリング システム52同様の機能テストを使用されています。
このモデルは、未処理の腱と 2 つの幹細胞ベースの治療の成果を区別しながら、研究に登録の動物の数を減らすために設計されました。本研究でテスト治療の効果は、別のパブリケーション36で説明します。ここで使用するモデルは、内部統制を使用して 28 日 (データはここで表示されません)、腱の非破壊力学的テストと組み合わせるそれぞれのラットでの治療の違いの検出を許可しました。
活性調節されたプラズマは、幹細胞、生体適合性、アクセシビリティ、および伸張53,54の管理における現在の臨床応用のためのキャリアとして共通使用するため選ばれました。それ扱われた腱の治癒に貢献している可能性しますが、あります幹細胞のローカル保存を許可し、活性調節されたプラズマのと同じ量が含まれて両方に治療群の比較と干渉しません。未処理の腱の組織学的特徴は、どこ壊死組織と乱れたコラーゲン束外して貧食能および細胞壁溶解酵素によってマクロファージ炎症段階で、腱の治癒の前の記述と一致しているがまで続く 10 日後に損傷54,55,56。増殖の段階で、腱修復57,58から 28 日後に細胞増殖およびサイトの修復の動脈血供給量は最大。標本の低い弾性係数、断面積、腱の明白な肥厚との相関関係を発見しました。これらの結果に基づき、組織学的スコアは望ましくないかもしれない、軟骨、血管新生、コラーゲン線維の解体などの生体力学的強度につながるしない組織の変更を反映するようです。線、細胞外マトリックス組織、プロテオグリカン コンテンツの存在など他の条件を統合することでこのモデルの組織学的特徴に基づく治療を判別能力を向上可能性があります将来的とエラスチン繊維52,59の分布。

腱損傷は、種1にわたって大幅に痛みや筋肉萎縮の最も一般的な原因の 1 つです。獣医学で腱と靱帯損傷は、馬に特別な関心の競走馬のすべての傷害の 82% を含む筋骨格系とそれらの 46% の腱や靭帯の2,3に影響を与えます。瘢痕形成が癒される腱の力学的特性に影響を与えるし、屈筋腱の傷害後運動の使用へのリターンに守られた予後を説明します再傷害は最大で 2 年以内発生パワードップラーを馬の 67%4。再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。自家幹細胞療法はいくつかの励みになる結果5,6を生産しているが、組織の採取、細胞の処理/リプログラミングによる遅延管理の影響に関連する罹患率によって制限されます、幹の特性に (年齢) などの患者さんの健康状態は、7、8 を細胞します。これらの制限は、既製の代替として同種幹細胞を調査するための理論的根拠を提供します。胎児の付属器由来の細胞は、倫理的な問題および胚性幹細胞に関連する奇形腫形成の危険性を回避するために魅力的な候補です。胎児の付属器の中で臍帯マトリックス (UCM)、Wharton のゼリーとも呼ばれますが豊富、集めやすいです。
細胞ソースに関係なく幹細胞性を高めることは同種の再生医療細胞バンクの確立に不可欠です。機能的観点から自己複製と多系統分化9の可能性として幹細胞性を定義できます。幹細胞性の証拠は、アッセイ、遺伝子マーカー Oct4、 Sox2, Nanog9の式と一緒に増殖と分化に依存します。幹細胞性を強化する方法の 1 つは、void のフィラーと UCM MSCs の増殖・分化を高めるキャリアとして機能する生体材料の使用に依存します。このアプローチは、多能性細胞に成熟した細胞を再プログラムする転写因子の操作に関する懸念を排除できます。生体幹細胞の潜在的なキャリアとして考慮される間、キトサンは生体適合性と分解性10魅力的です。この天然アミノ多糖類は、主に上位製貝10品として得られる 2 番目の最も豊富な天然多糖類キチン質のアルカリ脱アセチル化によって形成されます。以前 MSCs とキトサン足場間の相互作用を調査して回転楕円体11,12,13,14,15,の形成の観察16. 我々 はまたキトサン行列12,13,14,15,16,17、軟骨分化の優位性を報告 18。最近では、2 つの独立した研究は、脂肪組織によってスフェロイド形成を説明および胎盤組織由来キトサン フィルム19,20上で培養した MSCs。回転楕円体のこの形成だけでなく、幹細胞性を強化、また生体内注入20後幹細胞の保存を改善しました。
有病率と罹患率の種にわたって寛解の伸張の病態を検討して幹細胞注射など新しい治療法をテストする実験モデルの開発を求めています。馬、コラゲナーゼによる腱鞘炎は腱修復21で MSCs を使用して有効性を発揮する一般的なモデルです。注射は急性炎症性変化を引き起こすので、このアプローチの妥当性は限られている、臨床の伸張は通常慢性の結果に対し22,23ストレスを掛けすぎています。さらに、腱の疾患の化学的誘導は治癒反応を誘発して症例22,23に障害の治癒過程をレプリケートしません。浅指屈筋腱の部分の切除は、馬24で腱鞘炎の手術モデルとして記載されています。最近では、低侵襲アプローチは、浅指屈筋腱25の中核への外傷性の損傷を制限する使用されました。手術モデルは自然な腱の病気につながる可能性があります、25を作成された損傷の範囲内の再現性に欠けがち疲労機構をシミュレートしません。モデル, 罹患率と腱の馬のモデルに関連付けられているコストに関係なく病気は体内の新規治療法の評価のための最初のステップとして齧歯動物モデルに関心を正当化するための制限です。
齧歯動物の実験モデルの主な利点の 1 つは、費用と個体間変動を制御する能力で構成されています。齧歯動物は、その急速な成長率により様々 な生理的要因に関して標準化することができますおよび短い寿命のスパンの変化の源を制限して、その違いを検出するために必要な動物の数を減らします。齧歯動物の腱疾患を誘導する戦略は、化学的誘導部分の腱欠陥21の外科的創造にもに依存しています。手術モデルの化学モデルをより自然な伸張をシミュレートすることが、高い罹患率と損傷した腱の壊滅的な障害につながることができます。その点、ラットだこれらのモデルのマウスよりもより良い候補者のサイズは、組織の治癒の評価を促進することにより、大規模な欠陥を作成できます。ラットは、4 つの主要な腱グループの伸張の実験的研究で使用されている: 腱、屈筋、アキレス、膝蓋腱26。これらのうち、膝蓋腱を含むモデルは、この腱の大きなサイズと27それへのアクセスの容易さのため特に魅力的です。膝蓋腱が脛骨粗面に大腿四頭筋をアタッチします。この伸筋機構内膝蓋骨は、大腿四頭筋の操作を指示し、膝蓋腱の近位の範囲を区別する種子骨です。膝蓋腱の近位と遠位の範囲で骨アンカーの存在生体力学的テストが容易になります。通常膝蓋腱を含むモデルは、コントロール28,29として対側そのまま腱の片側手術の欠陥に依存します。最も一般的な膝蓋腱欠損モデルは、対側の膝蓋腱がそのまままま、脛骨粗面の挿入に膝蓋骨の遠位の頂点から膝蓋腱の中央部分 (幅 1 mm) を切除します。組織、非破壊力学的試験や生体力学的障害、超音波画像診断、 ex vivo蛍光イメージング、肉眼観察および機能テスト28,30 をテスト結果の措置が含まれています。 ,31。一方的なモデルは提案された治療と同じ動物内で同様の負傷の保守的な管理とを比較できないようにします。同様に、いくつかの治療の比較では、別の動物が必要です。二国間のモデルは個体間変動を取り除き、32の研究に必要な動物の数を減らすでしょう。しかし、二国間の傷害の罹患率を高める可能性があり、二国間跛行の治療評価を妨げる可能性が。簡単にいくつかの研究のレポート モデル33,34の罹患率・周術期管理ではなく、治療の効果に関する両側膝蓋腱欠損ラットがフォーカスの使用。
この研究の長期的な目標は、UCM MSCs 宛ての同種移植の幹細胞性と生体内での生存率を改善するための戦略を開発することです。この目標を達成するために最近キトサン フィルムと35低酸素環境下での培養でスフェロイドの形成による UCM MSCs の改良された幹細胞性を報告した.これらの体外プロパティ エアコン UCM と扱われる膝蓋腱欠損の改善された生体力学的特性と関連していた-MSCs これらの結果に基づいて、ラット両側膝蓋腱欠損モデルが候補者をテストするには適しているようだ。腱の傷害の36のトリートメント。研究の目的は、分離とキャラクタリゼーション UCM MSCs の幹細胞、作成と両側膝蓋骨腱障害、手術後の治療のための生物学的デリバリー システムの準備のための詳しいプロトコルを提供するためにはここで報告回復と組織欠陥の中に癒しの評価。

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Collagenase type IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.FS</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma</td><td>C3646</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Hyclone</td><td>SH30574.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Round bottom polystyrene tube</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1085F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td><td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Acid-citrate-dextrose</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code: 400</td><td>Experimental animal</td></tr><tr><td>Rat surgical kit</td><td>Harvard apparatus</td><td>728942</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Surgical Blade #15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Rat MD&#039;s Baytril (2 mg/Tablet),&lt;br/&gt; Rimadyl (2 mg/Tablet)</td><td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Eosin alchol shandon</td><td>Thermo scientific</td><td>6766007</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>143907</td><td>Consumable</td></tr></tbody></table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。有病率と罹患率、生物種間の寛解のこの組織の限られた癒しのプロパティと組み合わせて細胞療法に関する検索を求め、その有効性を検討するための実験モデルの開発を推進します。臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞 (UCM MSC) は、豊富な簡単に収集、倫理的な問題と奇形腫形成の危険性回避まだ原始胚性幹細胞をもっと密接に類似している魅力的な候補者よりも大人の組織由来の MSCs。 重要な関心は、スフェロイドの形成を通じて MSCs のプロパティを強化する戦略としてキトサンを重視しています。UCM-MSCs を分離するこの紙詳細テクニックはキトサン フィルムの回転楕円体を準備し、表面マーカー式回転楕円体形成の効果を分析します。その結果、キトサン膜上に形成した UCM MSC 回転楕円体の体内注入のラットの両側膝蓋腱損傷モデルの作成を説明します。合併症を認めなかった罹患率に関して研究、ストレス上昇の効果、または組織感染症。7 日手術群の合計機能スコアは正常ラットよりも低かったが、手術後 28 日以内に正常に返されます。組織の治癒の組織学的スコアは、異物反応と 28 日で治癒の進行がないこと 7 日間に評価処理の欠陥で血栓の存在を確認しました。この両側膝蓋腱欠損モデルが許容可能な罹患率に関連付けられているは、未処理の腱とトリートメントの違いの検出を許可各ラットにおける内部統制の作成による個体間変動を制御します。

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Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2 処置間テスト許容罹患率に関連付けられていた。

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

evaluation-stem-cell-therapies-bilateral-patellar-tendon-injury-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K ビュー.  Western University of Health Sciences. 準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2 処置間テスト許容罹患率に関連付けられていた。

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Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

医学

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

生物工学

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies

A third of all pediatric fractures involve the growth plate and can result in impaired bone growth. The growth plate (or physis) is cartilage tissue found at the end of all long bones in children that is responsible for longitudinal bone growth. Once damaged, cartilage tissue within the growth plate can undergo premature ossification and lead to unwanted bony repair tissue, which forms a "bony bar." In some cases, this bony bar can result in bone growth deformities, such as angular deformities, or it can completely halt longitudinal bone growth. There is currently no clinical treatment that can fully repair an injured growth plate. Using an animal model of growth plate injury to better understand the mechanisms underlying bony bar formation and to identify ways to inhibit it is a great opportunity to develop better treatments for growth plate injuries. This protocol describes how to disrupt the rat proximal tibial growth plate using a drill-hole defect. This small animal model reliably produces a bony bar and can result in growth deformities similar to those seen in children. This model allows for investigation into the molecular mechanisms of bony bar formation and serves as a means to test potential treatment options for growth plate injuries.

The growth plate is a cartilaginous region in children's long bones where longitudinal growth occurs. When injured, bony tissue can form and impair growth. We describe a rat model of growth plate injury that leads to bony repair tissue, allowing the study of repair mechanisms and growth plate regeneration strategies.

ラット脛骨成長プレート傷害モデルによる修復機構の特徴付けと成長プレートの再生戦略の評価

A third of all pediatric fractures involve the growth plate and can result in impaired bone growth. The growth plate (or physis) is cartilage tissue found ...

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a lesion in the Achilles tendon; prepare PRP and inject it (or the saline solution); remove the tendon; and perform biomechanical, molecular, and histological evaluations. At each step, all the procedures and methods are described in detail, so they can be reproduced easily.
Achilles tendons have been surgically sectioned (removal of a 5-mm long section). Afterwards, PRP or saline solution was injected to study whether PRP has a positive effect on the healing of the tendon. Three groups of 40 animals (a total of 120 rats were used in this study) were subdivided into 2 subgroups: PRP injection group and a saline injection control group. Rats were sacrificed at increasing time points (Group A: 5 days; Group B: 15 days; Group C: 30 days) and tendons were removed. 90 tendons underwent biomechanical testing before performing transcriptomic analysis and the 30 remaining tendons were submitted to histological analysis.

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma PRP on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

This protocol describes the evaluation process of healing tendons in rats that have been injected with allogeneic platelet rich plasma (PRP) or saline solution after removing part of the Achilles tendon. The progress of tendon healing is evaluated at several time points using different types of analyses.

ラットの断面アキレス腱の治癒過程に及ぼす同種多血小板血漿 (PRP): 方法論的説明

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a ...

腱インピンジメントの理解 – メカノバイオロジー研究のためのマウス外植片モデル

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

著者スポットライト:腱インピンジメントのメカニズム生物学を解明する – 多軸マウス後肢外植片モデル 

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited self-repairing capacity and, most importantly, no definitive treatments, tendinopathy still influences patients&#8217; life quality negatively. Tendon-derived stem cells (TDSCs), as primary precursor cells of tendon cells, play an essential role in both the development of tendinopathy, and functional and structural restoration after tendinopathy. Thus, a method that can in vitro mimic the in vivo differentiation of TDSCs into tendon cells would be useful. Here, the present protocol describes a method based on a three-dimensional (3D) uniaxial stretching system to stimulate the TDSCs to differentiate into tendon-like tissues. There are seven stages of the present protocol: isolation of mice TDSCs, culture and expansion of mice TDSCs, preparation of stimulation culture medium for cell sheet formation, cell sheet formation by culturing in stimulation medium, preparation of 3D tendon stem cell construct, assembly of the uniaxial-stretching mechanical stimulation complex, and evaluation of the mechanical stimulated in vitro tendon-like tissue. The effectiveness was demonstrated by histology. The entire procedure takes less than 3 weeks. To promote extracellular matrix deposition, 4.4 mg/mL ascorbic acid was used in the stimulation culture medium. A separated chamber with a linear motor provides accurate mechanical loading and is portable and easily adjusted, which is applied for the bioreactor. The loading regime in the present protocol was 6% strain, 0.25 Hz, 8 h, followed by 16 h rest for 6 days. This protocol could mimic cell differentiation in the tendon, which is helpful for the investigation of the pathological process of tendinopathy. Moreover, the tendon-like tissue is potentially used to promote tendon healing in tendon injury as an engineered autologous graft. To sum up, the present protocol is simple, economic, reproducible and valid.

A three-dimensional uniaxial mechanical stimulation bioreactor system is an ideal bioreactor for tenogenic-specific differentiation of tendon-derived stem cells and neo-tendon formation.

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

要約

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の応用

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ラットの断面アキレス腱の治癒過程に及ぼす同種多血小板血漿 (PRP): 方法論的説明

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

腱由来幹細胞の発熱分化を誘導する三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステムの適用