Name: measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
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我々は、Cの線虫遺伝学センターを認めますエレガンス株 。資金援助は、テリー·フォックス·研究所から提供されました。また、RolandeとマルセルGosselin大学院学生の身分とマギル統合がん研究研修プログラムのがん研究FRN53888でCIHR / FRSQ訓練助成金からEPに付与されたサポートを認めます。

試薬の調製<ol><li> C.のためのメディアの準備エレガンスの成長（ここでは、野生型動物とflcn-1（ok975）変異動物）。 <ol><li>トリスHCl、トリス塩基、Bactopetoneの31グラム、塩化ナトリウムを20gとコレステロールの0.08グラムの2.4グラムの5.5グラムを含有する修飾Youngren唯一バクトペプトン（MYOB）ドライミックスを準備します。振とうしながらよく混ぜます。 注：この混合物は、MYOB培地10 Lを調製するのに十分です。 注：通常の増殖培地（NGM）プレートはMYOB板27の代わりに使用することができます。しかし、同じタイプのプレートは、系統間の独立した反復間有効な比較のために使用されるべきです。このプロトコルでは、我々は唯一のMYOBのプレートを使用していました。 </li><li> MYOB乾燥混合物の6グラム、寒天の17グラムを追加することで、MYOB媒体の1 Lを調製し、122℃で45分間、H 2 O、オートクレーブで1 Lに構成しています。プレートを注ぎ、室温で2日間乾燥させてください。 </li><li>無菌技術を用いて、cultu 100mlの接種E.とLBブロス培地の再大腸菌 OP50細菌と37℃でO / Nを成長させます。 </li><li> E.と種子MYOBプレート大腸菌 OP50細菌。それは48時間室温で成長できるようにします。 </li></ol></li><li> RNAiを用いて遺伝子のダウンレギュレーションのための準備<ol><li> MYOBのRNAi送りプレートを準備します。ステップ1.1.1と1.1.2のように進みます。オートクレーブ処理後、培地を約55℃まで冷却し、1ミリリットルM 1のイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）および1ミリリットルの100mMアンピシリンを追加することができます。 </li><li>ストリークE.大腸菌 HT115制御EVまたはプレート寒天アンピシリン上flcn-1特異的RNAi（50μg/ mlの）/テトラサイクリン（15μgの/ ml）のいずれかを発現するプラスミドで形質転換された細菌。 37℃で培養O / Nを成長させます。 </li><li>コロニーを選択し、Eを接種制御EVまたはflcn-1特異的RNAiのいずれかを発現し、37＆＃でLB /アンピシリン（50μg/ ml）中、O / Nでの培養を成長させるプラスミドで形質転換した大腸菌 HT115細菌176; C。 </li><li> E.によるシード·プレート大腸菌 HT115 EV細菌やHT115 flcn-1のRNAi細菌。 注：使用前にRTでプレートを48時間にしてください。給電によるのRNAiノックダウンが有効になっている場合は、DS-RNA 28の送達の他の方法を使用します。 </li></ol></li><li>パラコート（PQ）を使用して酸化ストレスを誘導します。 <ol><li> 7 H 2 O·KH 2 PO 4、のNa 2 HPO 4、5gのNaClをし、MgSO 4 0.25gの6gの3gを混合することによってM9バッファーを調製します蒸留水で1リットルに起動します。 RTで122℃、店舗ボトルで45分間オートクレーブソリューション。 </li><li>アッセイの日に、M9 / PQを含む溶液を準備します。このプロトコルは、100 mMのPQを使用します（M9バッファーの4ミリリットルに溶解PQの0.1028グラムを、ウェル当たりM9 / PQの40μlの全96ウェルプレートを埋めます）。 注意：PQが危険と毒性の高い化合物です。適切なガイドラインに従って処理します。 注：最初に新しいのを実行しています電車や新たな条件、それは7-10時間以内に動物を殺すために使用するのに最適な濃度を決定するためにPQの濃度を増加さに生存をアッセイすることをお勧めします。 </li></ol></li></ol>年齢同期L4人口の調製<ol><li> E.を接種した新鮮なMYOBプレートに20妊娠大人の雌雄同体を転送大腸菌 OP50細菌。アッセイの間に必要な虫の数に基づいて、いくつかのプレートを準備します。 </li><li>彼らは6時間産卵することを可能にした後、白金線虫を用いて、母親を削除選びます。産卵数を評価するために顕微鏡下でプレートを確認してください。 </li><li>卵が孵化し、48時間、20℃で成長させます。この時点で、動物が後期L4 /若年成人の段階にあります。同じステージの動物を選択し、PQ液含有ウェルに移します。 注：48時間のインキュベーションが唯一の野生型動物と同様に成長する突然変異体に適用されるので、それが発達監視することが重要ですそれはそうでなければ、他のタイムラインを使用する必要があり、野生型の現像速度に準拠を保証するために、新たにテストされた変異体の割合。 </li><li>あるいは、同期技術​​を使用しています。次亜塩素酸溶液を用いて、L1幼虫ワームの同期人口を（;光から分離するためにアルミホイルで瓶を包む水25ml、5.25％の次亜塩素酸ナトリウムの125ミリリットル、4 M NaOHを50ミリリットル）を生成します。強烈な漂白がアッセイ中に動物の行動に影響を与える可能性があるので、このアッセイのために、それは、推奨されません。 注意：ガイドラインに従って次亜塩素酸溶液を処理します。 注：ダウン、目的の遺伝子を調節する特異的RNAi細菌を播種したRNAiプレートに母親の転送を除いて、セクション2で説明したように雌雄同体を同期させるためにRNAiを使用する場合。 RNAiのでノックダウンが弱い場合には、複数の世代のための給紙を推奨します。 </li></ol> 3.酸化ストレス抵抗性アッセイを&lt;実行/ P&gt; <ol><li> 96ウェルプレートの各ウェルに100 mMのPQ溶液をピペット40μL（新しく調製）。すべての条件（処理、突然変異体など ）を複製するように、少なくとも12のウェルを使用してください。白金線虫ピックを使用して、十分に開始時刻と終了時刻を示すあらゆるに5-8 L4幼虫動物を転送します。 </li><li>別の条件を開始すると、開始時刻と終了時刻を確認します。ワームを転送し、開始時刻から時間後に死亡した動物の得点間のインキュベーション時間で2​​0℃でプレートを置きます。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して、生存時間ごとにカウント。ゆっくりカウントを開始する前に、プレートを振ります。死んだ動物として、あっても高強度の光をスポットした後、移動しないワームを示しています。また、生きている動物の数を示しています。 注：高倍率でワーム形状、尾と頭の動きを見ると、生きているから死んだ虫を決定するのに役立ちます。 </li><li>ほとんどのワームは死んでいるまで、この手順を時間ごとに繰り返します。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。毎回ポイントでの生存割合の決意<ol><li>すべてのウェルに移した動物の数を追加することによって、条件あたりの動物の数を計算します。破損または転送時に殺される動物を無視します。 </li><li>すべての時点について、条件ごとに死んだ動物の合計数（12ウェル中の死んだ動物の合計）を計算します。すべての時点について、死亡率（死亡した動物の数の動物の総数で割り、100を掛けた）及び生存率（100パーセントマイナス死）を計算します。 </li><li>このアッセイを、少なくとも3つの独立した回を繰り返します。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

C.エレガンスは、それが容易に培養することができるので、 生体内での遺伝的に酸化ストレス耐性を研究するための魅力的なモデル生物であり、急速に遺伝的に同一の子孫の多くをもたらします。酸化ストレス抵抗性を測定するための複数の方法は、以前に記載されており、それらは、PQ、ロテノン、H 2 O 2、及びジュグロン25,26,29-32などの種々のROS光源と培養プレートの補充に基づいています。ここでは、100 mMのPQを用いて96ウェルプレート中の液体中の酸​​化ストレス耐性を測定するプロトコルを説明します。同様のアッセイは、グリアら 33によって行われました。このアッセイは、他のROS源を用いて、液体中の酸​​化ストレスを研究するために適合させることができます。例えば、我々としても23数個のH 2 O 2濃度にflcn-1が増加する抵抗の損失を示しました。 このアッセイは、技術的な可能性がありLY運動性欠陥や、ドーパミントランスポーターのDAT-1 34に変異を保有する菌株として水泳誘発性麻痺の表現型を表示するいくつかの株のために挑戦。それは必ずしも減少し、酸化ストレス抵抗性ではなく、運動の欠陥を意味するものではありませんので、この場合は、移動できないことが混乱しています。また、死亡した動物のカウントが慎重に完了する必要があると研究者らは、Cに注意を払わなければなりませんこのような尾の動き、と頭の動き、あるいは遅い体の動きなどの行動の詳細をエレガンス 。 PQの濃度が高すぎると、動物の死亡速度は非常に高速である場合には、一方が遅く死亡率を得るためにPQの濃度を低下させることを検討してください。他の人がこのようなDAF-2変異動物37のように非常に耐性がありながら、いくつかの動物は、このようなAAK-2変異動物26,33,35,36として酸化ストレスに非常に敏感です。この場合、異なる共同で生存をアッセイPQのncentrationsを考慮すべきです。 RNAi実験のために、陰性の結果は、RNAi治療の非効率性に起因する可能性があります。この場合には、mRNAレベルの測定は、遺伝子ノックダウンに成功したかどうかを決定することが重要です。 このプロトコルは、さらに、C.の水泳行動を追跡する検出器を使用して酸化ストレス耐性のハイスループットスクリーニングに適合させることができます液体38,39でエレガンス 。これは、潜在的にCの耐久性の監視を可能にしますエレガンスと酸化ストレスの下で曲げ体の頻度などの遊泳行動。身体の動きの速い速度は、ストレス下での高いワームの適合性を示している可能性があります。 下等真核生物におけるストレス耐性を酸化的につながる経路が高度に進化にわたって保存されており、酸化ストレス関連疾患およびヒトの老化にリンクされています。 MitohormesisとバランスのとれたGENERATIOROSのnが寿命を延長し、健康スパンを向上させるために不可欠です。しかし、過剰なROSは、細胞、組織/器官、および生物に対して非常に損傷を与えます。変更された場合、最適なROSのバランスを提供することを、経路を見つけることはこのように不可欠であり、酸化ストレスに対する耐性を調節する薬物についてのスクリーニングは、共通分母を持つ複数の疾患の治療法の開発を助けることができる：酸化ストレス。 C.これらのスクリーニングを行いますエレガンスは、酸化ストレスにリンクされているヒト疾患の理解と治療のための大きな可能性と価値を持って有利な、高速で安価で、かつ信頼性の高い方法です。

A reference was corrected in the publication of <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

真核生物では、ミトコンドリアの電子伝達系で起こる酸化的リン酸化は、ATPの形でエネルギー生産の主な要因です。活性酸素種（ROS）は、このプロセスの自然な副産物です。シグナル伝達分子としての重要な役割にもかかわらず、過剰なROSは、DNA損傷、タンパク質のカルボニル化、および脂質酸化につながることができます。 ROS産生と解毒の間の不均衡は、エネルギーの枯渇につながる酸化ストレス、細胞の損傷を引き起こし、細胞死1,2をトリガします。酸化ストレスは老化および癌、糖尿病、心血管および神経変性疾患3-9を含む多くの生命を脅かす疾患の発展に貢献しています。 細胞は適切なROSレベルを維持し、酸化的損傷1,2に対してその成分を保護するために酵素的および非酵素的防御戦略を進化させてきました。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の酵素はconveに第一幕RTスーパーオキシド後カタラーゼまたはペルオキシダーゼ酵素によって水に変換されるH 2 O 2へ。非酵素的な防衛戦略は、主に必須の細胞成分を保護する細胞高分子と比較して、ROSと速く反応する分子を含みます。 ROS解毒酵素の保護の役割にもかかわらず、いくつかのROS分子は、抗酸化防御機構を脱出し、酸化的損傷につながります。検出、修復、および損傷した細胞成分の分解は、酸化ストレス1,2間に本質的な防御戦略です。 ストレス耐性、特に酸化ストレスに関与するシグナル伝達経路は、進化的に高度10,11に保存されています。生物の条件が部分的にしか再現されている細胞培養実験とは異なり、モデル生物における酸化ストレスの研究12,13は、大きな意義を持っている。C.エレガンスは、CUL、容易かつ安価にすることができます自由生活線虫であります寒天培地上の細菌叢上tured。それは、（長さ約1mm）小型で、通常の遺伝子操作を容易に自己受精ふたなり、として成長します。それは大規模な遺伝子スクリーニング14を実行するための強力なツール作り、世代あたり約300の子孫を生成する、迅速なライフサイクルと高い生殖能力を有しています。 C.エレガンスゲノムが完全に配列決定され、遺伝子の40〜50％は、ヒトの疾患関連遺伝子15〜18の相同体であると予測されます。 RNAiを用いて、目的の遺伝子のノックダウンは、迅速かつCで簡単です。 エレガンス。遺伝子のダウンレギュレーションはE.動物に供給することによって達成することができます関心19のmRNAを標的とする二本鎖RNAを発現するプラスミドを保有する大腸菌細菌。そのため、大規模なRNAiスクリーニングを使用して、遺伝子機能の決意は、癌20,21を含むヒトの疾患を理解する上で大きな影響を与えています。 Oの研究Cでxidativeストレス耐性エレガンスは、酸化ストレスに対する抵抗13,22の保存されたメカニズムの同定につながりました。同定されたいくつかの経路は、低酸素、熱、および浸透圧ストレスなど、他のストレスに長寿と抵抗を調節する一般的な経路です。これらの経路は、インスリンシグナル伝達、TORシグナリング、およびオートファジーを含みます。その他の主な経路は、そのような、または損傷修復におけるこのような熱ショックタンパク質とシャペロン11,13,22としてスーパーオキシドジスムターゼ酵素とカタラーゼ酵素としてROSの解毒を伴います。 このプロトコルは、Cの酸化ストレスに対する抵抗性を決定する方法について説明します液体中のエレガンス 。我々は以前Cでflcn-1（ok975）の喪失時の酸化ストレスに対する抵抗性の増加を示しているので、私たちはプロトコルを示すためにflcn-1（ok975）と野生型動物を使用しましたエレガンス 23。また、この増加した抵抗性が依存することを示していますAMPKとオートファジーは、細胞生体エネルギーを改善し、ストレス耐性23を促進するシグナル伝達軸上。 PQは、反応性酸素種24を生成するために電子伝達系を妨害する酸化的ストレッサーです。同じアッセイを適合させることができ、他のROS源またはROSの生成化合物は、H 2 O 2およびロテノンとして使用することができます。同様のアッセイは、PQの低濃度は25,26を使用しているプレート上で開発されています。このアッセイの利点は、非常に高速であり、結果は、一日で得られることがあります。さらに、96ウェルプレート中の酸化ストレス耐性アッセイを行うために使用される液体の総体積はPQ含有プレートを調製するために使用される量に比べて低いです。したがって、使用PQの量は、液体アッセイであり、安価なアッセイをレンダリングし、有害廃棄物の生産を制限する、低いです。しかし、プレートアッセイと比較して、このアッセイの制限はラを含みます液体アッセイにおける食品のCKと空気と比較して、液体中の酸​​素濃度が低いです。これらは、いくつかのケースでは、結果に影響を与える可能性がある重要な要因です。したがって、このアッセイで得られた結果を支持することが推奨される酸化ストレス耐性の他の方法を使用して再現性を確認しました。

<table><tbody><tr><td>Agar bacteriological grade</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride biotechnology grade</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminomethane</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methyl viologen dichloride hydrate</td><td>Aldrich chemistry</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 stereo zeiss microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well clear microtiter plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flcn-1&lt;/em&gt; RNAi source</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates

活性酸素種の産生と解​​毒の間の不均衡の結果である酸化ストレスは、心血管および神経変性疾患、糖尿病、老化、および癌を含む慢性ヒトの疾患、の主要な原因です。したがって、細胞系においても全生物を使用していないだけで酸化ストレスを研究することが重要である。C.エレガンスは、高度に進化的に保存されている酸化ストレスシグナル伝達経路の遺伝学を研究するための魅力的なモデル生物です。 ここでは、Cの酸化ストレス耐性を測定するためのプロトコルを提供します液体中のエレガンス 。簡単に言えば、そのようなパラコート（PQ）およびH 2 O 2などのROS誘導試薬はM9緩衝液に溶解され、溶液は、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに等分されます。シンクロナイズドL4 /若年成人C.エレガンス動物をウェルに転送される（5~8匹/ウェル）、生存率が測定されますほとんどのワームは死んでいるまで、毎時間。プレート内のストレッサーの低濃度を使用して、酸化ストレス耐性アッセイを行う場合には、高齢化は、データの誤った解釈につながる可能性が酸化ストレス、時に動物の行動に影響を与える可能性があります。しかしながら、本明細書に記載のアッセイで、この問題は、L4 /若い成体動物を使用しているので、発生しにくいです。また、このプロトコルは、安価であり、その結果、遺伝的スクリーニングのための魅力的なこの技術をレンダリング一日で得られます。全体的に、これは、酸化ストレスに関連するヒト疾患のより良好な特徴付けに変換することができ、酸化ストレスシグナル伝達経路を理解するのに役立ちます。

比較すると、野生型C.エレガンスはflcn-1（ok975）変異動物をここでは、野生型Cの抵抗を決定するために、100 mMのPQを使用しました酸化ストレス、熱、および無酸素23に抵抗することが示されているflcn-1（ok975）動物と比較してエレガンス 。処理の4時間後、野生型の48.3パーセントはflcn-1で77.8パーセント生存率（ok975）動物と比較して生存しました。予想されるように、flcn-1（ok975）変異動物は、野生型（ 図2および表1）と比較して、100mMのPQに対してより耐性でした。 制御EVまたはflcn-1のRNAi細菌を与えた野生型動物を比較します RNAiを用いflcn-1のダウンレギュレーション、前節で提示結果と同様に、100 mMのPQに対する耐性を増加させました。この結果は、RNAiを模倣機能喪失型Mを用いて、遺伝子機能のダウンレギュレーションを示しています<html> utation（ 図2および表1）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52746/52746fig1.jpg" /> Cで96ウェルプレート中の酸化ストレス耐性決意の方法の図1の回路図、図エレガンス 。 MYOBプレート上で増殖させた大腸菌 OP50細菌を与えた同期L4 /若い成体動物は、100mMのPQを含む96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移し、虫の多くは死んなるまで生存時間ごとに測定されます。のRNAiノックダウンの場合には、同じ手順を同期動物はIPTGを補ったプレート上で増殖させることを除いて続き、そしてE.が供給されます発現時に標的遺伝子をノックダウンしますプラスミドを有する大腸菌 HT115細菌。 ファイル/ ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg &quot;/&gt; C.における酸化ストレスにFLCN-1が増加抵抗の図2.損失エレガンス 。 -動物対照で処理またはflcn-1 RNAiを重量の100 mMのPQ（A）重量とflcn-1（ok975）変異動物と（B）から（A、B）の生存率。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="5"> 100mMのPQ％の生存率 </td></tr><tr><td> 1時間</td><td>株のRNAi </td><td>パーセント生存率（±SD） </td><td> P値</td><td>多数の実験</td><td>ワームの合計数</td></tr><tr><td></td><td>重量</td><td> 82.38±1.31 </td><td align="right"> 0.0002 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> flcn-1（ok975） </td><td> 99.03±1.67 </td><td></td><td align="right"> 3 </td&gt; <td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td>重量;コントロール</td><td> 91.70±0.55 </td><td align="right"> 0.0462 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td>重量; flcn-1（RNAiの） </td><td> 95.93±2.48 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2時間</td><td>株のRNAi </td><td>パーセント生存率（±SD） </td><td> P値</td><td>多数の実験</td><td>ワームの合計数</td></tr><tr><td></td><td>重量</td><td> 72.13±7.13 </td><td align="right"> 0.005 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> flcn-1（ok975） </td><td> 96.33±2.28 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td>重量;コントロール</td><td> 80.27±5.34 </td><td align="right"> 0.0261 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td>重量; flcn-1（RNAiの） </td><td> 91.23±1.42 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3時間</td><td>株のRNAi </td><td>パーセント生存率（±SD） </td><td> P値</td><td>多数の実験</td><td>ワームの合計数</td></tr><tr><td></td><td>重量</td><td> 55.37±4.72 </td><td align="right"> 0.0004 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> flcn-1（ok975） </eM&gt; </td><td> 87.00±1.36 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td>重量;コントロール</td><td> 70.77±3.50 </td><td align="right"> 0.0027 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td>重量; flcn-1（RNAiの） </td><td> 87.63±2.67 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4時間</td><td>株のRNAi </td><td>パーセント生存率（±SD） </td><td> P値</td><td>多数の実験</td><td>ワームの合計数</td></tr><tr><td></td><td>重量</td><td> 48.30±6.39 </td><td align="right"> 0.002 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> flcn-1（ok975） </td><td> 77.80±3.12 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td>重量;コントロール</td><td> 63.77±0.66 </td><td align="right"> 0.0122 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td>重量; flcn-1（RNAiの） </td><td> 80.57±6.68 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5時間</td><td>株のRNAi </td><td>パーセント生存率（±SD） </td><td> P値</td><td>多数の実験</td><td>ワームの合計数</td></tr><tr><td></td><td>重量</td><td> 41.60±8.33 </td><td align="right"> 0.0062 </td><td align="right"> 3 </td><td align = &quot;右&quot;&gt; 210 </td></tr><tr><td></td><td> flcn-1（ok975） </td><td> 67.43±1.42 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td>重量;コントロール</td><td> 60.53±2.58 </td><td align="right"> 0.0313 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td>重量; flcn-1（RNAiの） </td><td> 71.53±5.24 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6時間</td><td>株のRNAi </td><td>パーセント生存率（±SD） </td><td> P値</td><td>多数の実験</td><td>ワームの合計数</td></tr><tr><td></td><td>重量</td><td> 34.86±5.88 </td><td align="right"> 0.0021 </tD&gt; <td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> flcn-1（ok975） </td><td> 60.34±2.05 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td>重量;コントロール</td><td> 44.43±3.93 </td><td align="right"> 0.0042 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td>重量; flcn-1（RNAiの） </td><td> 62.13±3.44 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr></tbody></table> 表1の結果の概要と図2から、酸化ストレス抵抗性の統計分析。

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Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

15.4K ビュー.  McGill University. C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates. 

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

生化学

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

環境学

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

遺伝学

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

発生生物学

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

生物学

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

そのまま線虫の酸素消費量の測定

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C.エレガンスサバイバルアッセイ:短期毒性試験

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

の酸化ストレス抵抗を測定

要約

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カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

線虫の大規模栽培のプレート・ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

そのまま線虫の酸素消費量の測定

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

C.エレガンスサバイバルアッセイ:短期毒性試験

の酸化ストレス抵抗を測定

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カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

そのまま線虫の酸素消費量の測定

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

C.エレガンスサバイバルアッセイ:短期毒性試験

カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

線虫の大規模栽培のプレート・ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製