このプロトコルでは、Mitis Groupストレプトコックシを介して生成された過酸化水素によって引き起こされる病原性を解明するために、自由な生きている方法c.エレガンスを使用する方法を示す。この技術の主な利点は、1リットルのメディアに対してトッド・ヒューイット粉末30g、酵母エキス2g、20gのアガーを2リットルのエルリン・マイヤーフラスコに加える化学源とは対照的に、活性酸素種の持続的な生物学的供給源を使用して、ワームの病原性とストレス応答の活性化を研究できることです。
フラスコの内容物に970mlの脱イオン水を加え、攪拌棒に入れます。開口部をカバーするためにアルミホイルを使用してください。121°Cの温度でフラスコにメディアをオートクレーブし、30分間平方インチあたり15ポンドの圧力を加えます。
その後、フラスコを攪拌プレートにセットし、穏やかな攪拌で冷まします。ラミナーフードの下に、適切なサイズの無菌ペトリ皿にメディアを注ぎます。メディアを2時間乾燥させます。
その後、プレートを摂氏4度で1ヶ月まで保管します。ミティスグループレンサ球菌の準備の前に、THY寒天プレートをインキュベーターで摂氏37度に温めます。その後、場所にレンサプチコッシの所望の株をストリークアウトする無菌ループを使用します。
その後、プレートをキャンドルジャーに入れ、瓶を摂氏37度で一晩で約18時間インキュベートし、微小性好水性環境を提供します。翌日、キャンドルジャーからプレートを取り出し、滅菌ループを使用して孤立したコロニーを選びます。2 ml の THY ブロスを含む 15 ml の滅菌コニカル チューブを接種します。
キャップをしっかりと閉じ、静電気条件下で37°Cでチューブをインキュベートします。37°Cのインキュベーターで事前に暖かいTHYプレートは、THYプレートに1000単位のカタラーゼを含む溶液50マイクロリットルを追加します。滅菌スプレッダーを使用してカタラーゼ溶液を広げ、プレートを層流フードで30分間乾燥させます。
レンサ球菌株でプレートを播種するには、ピペットを使用して一晩栽培された培養物の80マイクロリットルをプレートに加え、無菌スプレッダーを使用して寒天表面全体に細菌を完全に広げます。一晩キャンドルジャーに摂氏37度でプレートをインキュベートします。コントロールとして、2つのNGMプレートに、播種用に大腸菌OP-50の一晩成長培養物の80マイクロリットルを加える。
一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、キャンドルジャーからプレートを取り出し、プレートを室温まで冷却します。滅菌ワームピックを使用して、NGMフィードプレートから30 L4幼虫をレンサ球菌播種THYプレートに移します。
プレートを摂氏25度でインキュベートします。解剖顕微鏡の下で、いくつかの時点で各プレート上の生きているおよび死んだL4幼虫の数を数える。滅菌ワームピックを使用して、ワームを穏やかに推進し、それらが死んでいるか生きているかを判断します。
最初は、ワームを死んだものとしてスコア付けするか、30分ごとに生きています。ワームが急速に死に始めたら、15分間隔でそれらを採点する。アッセイの完了には5~6時間かかります。
その後、実験を2回繰り返します。アガロースパッドを準備するには、2つのガラススライドに沿ってラボテープを縦に貼ります。これはアガロースパッドの厚さを決定します。
2 つのテーピングスライドの間にきれいなガラススライドを置きます。アガロースを脱イオン水に溶かし、2重量体積%にし、溶液を電子レンジで加熱します。ピペットを使用して、100マイクロリットルの溶融アガロースをきれいなスライドの中央に置きます。
すぐに溶融アガロースの上に別のきれいなガラススライドを置き、パッドを作るために穏やかに押し下げます。アガロースを固め、その後、トップスライドを削除します。アガロースパッドは使用する準備ができています。
THYプレートを摂氏37度に予め温めます。生存アッセイで以前に行われたように、レンサ球菌株でプレートをシードします。コントロールとしてE-大腸菌OP-50と種子3 NGMプレートと一晩摂氏37度でインキュベート。
翌日、プレートを室温まで冷やします。M9Wバッファーを使用して、NGMまたはNGM RNAiの給餌プレートから15mlの円錐形チューブにL4幼虫を洗浄します。チューブを450回gで回転し、遠心分離機で1分間回転させます。
上清をデカントし、各チューブにM9Wの10 mlを加えます。遠心工程をさらに3回繰り返します。M9Wの250マイクロリットルでワームを再中断し、ワームサスペンションの3つの5マイクロリットルの滴をきれいなペトリ皿の蓋に置きます。
解剖顕微鏡の下で、マイクロリットル当たりのワーム数を推定する。ピペットを使用して、各THYレンサ球菌種とNGM大腸菌種のプレートに約100 L4幼虫を加えます。細菌の株ごとに3つのプレートを使用してください。
25°Cで2〜3時間プレートをインキュベートします。その後、インキュベーターからプレートを取り出します。M9Wでそれらを洗浄し、15ml円錐管でワームを収集します。
遠心工程で以前に行われたようにワームを3回洗います。吸引によってM9Wのほとんどを取除く。そして、麻酔のためのワームペレットに2ミリモルナトリウムアジ化ナトリウムまたは四量体塩酸塩を含むM9Wの500マイクロリットルを加える。
室温で15分間、ワームペレットでチューブをインキュベートします。次いで、15マイクロリットルのウォーム懸濁液を調製したアゴローズパッドに落とす。蛍光顕微鏡で、フィッツィーフィルターとダッピーフィルターを利用したskn-1の局所化を可視化します。
画像ワームは10倍と20倍の倍率で表示されます。3つのレベルの局所化に基づいてワームを採点し、核局所化が観察されない低局所化、中局所化、SKN 1 BCGFPをワームの前部または後部に、そしてskn-1 BCGFPの核局所化がすべての腸細胞で観察される高い局地化を有する。この実験では、ミティスグループのメンバーは、S.ミュータン、S.サリバリウス、非病原性大腸菌OP-50とは対照的に、急速にワームを殺しました。
カタラーゼをTHYアガーに補うと、ワームの殺滅は廃止された。ワームの死は、野生型および賛辞株と比較してデルタspxB突然変異株では観察されなかった。これらのデータは、ミティスグループによって産生された過酸化水素がワームの殺滅を仲介することを示唆している。
skn-1ノックダウンワームの生存率の有意な減少は、治療されたワームのベクター制御と比較して観察された。同様の殺死表現型は、skn-1変異株およびN2野生型ワームで観察された。これは、skn-1がミティスグループのワームの生存に影響を与えることを示しています。
skn-1 BCGFPの局地化は、野生型N-補間株にさらされたワームで観察され、SコルドナエのデルタspxB突然変異株に応答しなかった。P38マップキナーゼ経路の成分を倒した後、skn-1 BCGFPおよびノックダウン処理されたワームの局所化を減少させ、治療されたワームのベクター制御に対して、観察された。レンサ球菌cを用いた。
エレガンス系は、過酸化水素が小胞性ストレスに及ぼす影響、ミトコンドリア損傷、ミトポホギ、およびトフォギーをさらに検討することができる。さらに、過酸化水素が細胞のコアプロセスを破壊することによって免疫応答を引き出すビリエンス因子として作用するメカニズムを同定することができる。
