この作品は、米軍グラント（W81XWH-08-1-0701）とカール財団病院からフェローシップによって資金を供給されました。

手順はIACUCプロトコル番号13302との完全な互換性であり、動物資源の部門によって承認されています。 1.機器の準備<ol><li>無菌性を確保するために、外科手術の前に使用されるすべての非使い捨て器具をオートクレーブ。 </li><li>使用の間、ガラスビーズ滅菌器とのセッションで複数回使用される器具を滅菌します。 </li></ol> 2.ハイドロゲルの調製<ol><li>解凍し、ヒドロゲル構築物の作成に少なくとも24時間前にプレート幹細胞。 </li><li>以前の刊行物8,18に完全に詳細に記載されているステレオリソグラフィー装置を用いて、外科的処置（または類似の器具）を一日前にパッチを準備します。 </li><li>ハイドロゲルを作成するには、第1の所望のパッチのコンピュータ支援設計（CAD）モデルを生成し、立体造形形式（STL）に設計をエクスポートします。 </li><li> dissolvinによってプレゲル溶液を作成します滅菌1×PBS中のGポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（PEGDMA）は20％のw / v溶液を得ました。同時に、光開始剤、1- [4-（2-ヒドロキシエトキシ） - フェニル] -2-ヒドロキシ-2-メチル-1-プロパン-1-オンDMSO中に溶解させます。 0.5％w / vの最終でPEGDMA溶液に光開始剤を追加します。直接架橋の前に、細胞の所望の密度の100ミリリットルを追加します。注：2.0×10 5 -2.0×10 6細胞/ mlの間の細胞密度が推奨されます。 </li><li> SLAプラットフォームの中央に皿にプレ - ゲル溶液をピペットで、以前にアップロードしたSTLフォーマットされたデザインで、SLAのソフトウェアを実行します。 </li><li>細胞を調節するために可能にするために装置からパッチを取り外し、ダルベッコ改変イーグル培地中でヒドロゲルO / Nインキュベート（DMEM）、5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した、100 U / mlペニシリン、および100mg / mlストレプトマイシンパッチ内の環境に。 </li></ol> 3.動物の準備とオーラルintubatiオン<ol><li>ケージの仲間とのグルーミング習慣との相互作用から決定されるような動物は、健康であることを確認する手順の前に、各マウスを評価します。注：女性8-10週齢のC57BL / 6Jマウスは、この手順のために使用された、しかし、任意のマウスの年齢やタイプを使用することができます。 </li><li>麻酔室に動物を置き、1リットル/分O 2をサポートして5％のイソフルランに公開します。つま先ピンチ反射によって麻酔のレベルを監視します。 </li><li>動物を適切に麻酔された後、計量し、挿管台の上に置きます。 </li><li>動物の胸腔に向けて光源を直接および喉頭面を撤回し、声帯を公開するために鉗子を使用しています。慎重に声帯の間の20のG血管カテーテルをガイドし、スムーズに気管に挿入します。カテーテルは小動物人工呼吸器に接続されると、胸腔の機械的な動きによって適切な挿入を検出します。 </li><li>目に換気設定を調整メーカーのガイドラインに基づいて、動物の電子体重。 </li><li>挿管後、低体温症を防ぐために加熱パッド上に仰臥位で動物を配置します。加熱パッドは40℃を超えないことを確認してください。必要に応じて、火傷の可能性を最小限にするために、動物や加熱パッドとの間の障壁を配置します。 </li><li>脱毛クリームを使用することにより、手術部位から髪を削除します。適切な滅菌を確実にするためにベタジンと75％エタノールの3交互スクラブしてサイトを滅菌します。ただ、手術部位を露出させるためにドレープを置き、手順の間に乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を配置します。 </li></ol> 4.手術手順<ol><li>開胸したがって、胸骨の長さを実行する胸骨の左側に皮膚切開約1cmを行い、動物の左側に実行されます。 </li><li>二段階で、基礎となる胸郭から筋層を分離するために鉗子を使用してください。 delineを観察動物の大胸筋を表すレーティングライン。 、少しこの筋肉を持ち上げ、基礎となる外腹斜筋から分離し、内側に後退。そして、同様に、基礎となる胸郭から外腹斜筋を解放し、第2、第3、第4肋骨の暗くされていないビューを提供する、横方向に後退させます。 </li><li>第三及び第四肋骨の間開胸術を行います。静か第4肋骨を持ち上げ第3および第4肋骨の間胸腔を開くために焼灼器を使用しています。さらにキャビティを開き、心臓を露出させるためにリトラクターを配置します。 </li><li>心の薄い心膜を破裂させるために鉗子を使用してください。 </li><li> 8-0モノフィラメントナイロン縫合糸で左冠動脈を結紮。直接左心房の下部先端の下、約4mm心尖から縫合糸を配置します。心室筋のブランチングとスツ語の後に左心房の大きさの増加により、適切な縫合糸の配置を決定します再結ばれています。 </li></ol> 5.パッチの配置とグルー<ol><li>使用するまで37℃でパッチを維持し、5％CO 2の条件。 </li><li>ゆっくりフラットエンドへらを使用してパッチを持ち上げ、ゆっくりと梗塞部位で、心臓の表面の上に置きます。 注：左心室の脱落防止のために、パッチが軽くへら又はピンセットの先端のいずれかを使用して接触を維持することによって所定の位置に保持することができます。 </li><li>トロンビンへのフィブリノゲンの1の比率：4を混合して接着剤を準備します。それは準備の開始後、通常1分以内に、厚く始めるまで繰り返しピペッティングにより溶液を混合。 </li><li>溶液粘度が所望のレベルに達すると、すぐにパッチ表面に約10 mlで移します。注：フィブリン糊の凝固時間は迅速であり、接着剤の効率的な転送のための機会の小窓を提供します。 </li></ol> 6.縫合<ol><l私は&gt; 6-0モノフィラメントナイロン縫合糸を使用して、すべての閉鎖縫合糸を実行します。 </li><li>三から四個々の結節縫合でリブ層を閉じます。 </li><li>肋間層の完全閉鎖する前に、閉鎖が完了した後、胸腔を排気し、適切な胸腔内圧を再確立するために切開部にPE-10カニューレを挿入します。 </li><li>三から四個々の結節縫合で胸筋を閉じます。 </li><li>連続縫合で皮膚層を封止します。 </li><li>完全閉鎖後、カニューレの端に1.0ミリリットルの注射器を接続して、胸腔を排出するためにそれを使用。 </li><li>縫合部位を補強するために切開部位に組織接着剤を適用します。 </li></ol> 7.手術後の処置<ol><li>マウスにブプレノルフィン（0.05〜1.0ミリグラム/ kg）および皮下直前復活に冠動脈結紮および少なくとも20分以下のカルプロフェン（2.2ミリグラム/ kg）を注射を与えます。両薬剤を手術後6-8時間の管理、その後痛みや苦痛を制御するために最大3日間、1日2回与えます。 </li><li>継続的に手術後の最初の4時間を意識し、すべての時間になるまで動物を監視します。鎮痛剤の第二の用量を投与するために、第2の検診を手術（2-4時間後）の夜を実行します。 </li><li>動物が安定した表示されるまで、手順に従って、二日後に毎日動物を監視します。 </li></ol>心機能と組織学の8解析<ol><li>マウスのechocardiographs MI後の損傷の程度を決定するための手順を次の4週間を実行します。 </li><li>吸入麻酔の誘導のための麻酔チャンバー内の4〜5％イソフルラン、およびメンテナンス麻酔用フェイスマスクを介した後、2％イソフルランでマウスを麻酔。 </li><li>脱毛クリームで撮像領域をクリアし、拍動する心臓の2D Mモード心エコー検査スキャンを得るために、小動物の超音波を使用して、機能パラメータのASSOを記録それにciated。 </li><li>その後、24時間、10％ホルマリン溶液中で動物と場所からの心臓を集め、二酸化炭素チャンバーにマウスを安楽死させます。 24時間後、70％エタノールに心を転送し、組織処理まで4℃で維持。 </li><li>心を処理し、パラフィンブロックでそれらを埋め込みます。 </li><li>頂点で始まり、心房で終わる、心臓の心室領域を介して、5mmのセクションをカット。 </li><li>染色は、標準的なプロトコルを使用して、マッソン三色、ヘマトキシリン​​およびエオシン染色の両方でスライスを切断しました。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

マウスMIモデルにこの方法では、我々は他のマウスのMI技術と関連している非心筋領域へのダメージを最小限に抑えるシステムを開発しました。これらの領域は、気管切開による損傷、筋層の切断、および胸腔を露出させるために、リブの破損を含みます。我々は、これらの変更は、外科手術中など、肋骨や筋肉の層を含む、主要な構造の多くの無傷を保つように注意する全体的な手術結果のおかげで改善することを考えています。 これは、最大の一日の唯一の8-10完全手術手順の結果、その時間がかかる性質であることで、この手法にはいくつかの制限があることに留意すべきです。これを克服するために、第二の人工呼吸器は、手順は、同時に2匹の動物に対して実行されるのを可能にする、使用することができます。加えて、肋間血管のような主要な血管、および開胸術を行う際に、内部胸動脈は、避けるべきです。これらの血管の近くにいる場合は、焼灼が原因破裂動脈にブリードアウトを防止するために使用されるべきです。 フィブリン糊は、すぐに血栓形成を助けるために、その能力、ならびにその潜在的な提供するために、ホストのMSC 14-17,19に実験室および臨床現場の両方のおかげで知られています。私たちの目的のために、フィブリン糊は、水ベースのヒドロゲルは、心臓の表面に付着した構築物の生体適合性のアプローチを務めました。フィブリンベースの接着剤の使用は、時間の長い量の組織との接触の可能性で、最大8週間、損傷部位でのヒドロゲル構造体を維持するのに成功しました。この接着システムの使用は、心筋などの構築物自体に害を与える追加の縫合を必要とせずにデリケートな構造物を配置するための制御を可能にしました。我々は、接着剤自体がカプセル化されたセルAに対して非毒性であることを見出しましたND負下にある組織には影響を与えません。ヒドロゲルおよびフィブリンベースの接着剤システムは、長期間の細胞または治療の接触を望む他の組織工学の様々な目的に適用することができます。また、SLAの製造方法を用いて、デザインおよび構造は細胞送達18より複雑なシステムを作成するために、パッチ内に組み込むことができます。 フィブリンベースの接着剤の使用に対する一つの後退は、複数の研究者が、パッチの配置と接着剤の添加の間に、外科用の部屋に存在しなければならないという事実です。これは、最初の研究者の仕事は第二の研究者は、溶液を混合し、適切な粘度に達した後にパッチに適用しながら、パッチは、所定の位置に残り、胸腔内に失われないことを確認することです。接着剤供給のタイミングを最適化するために、それは、第二の研究者は、パッチを配置する前に接着剤のゲル化をテストし回ことが示唆されています接着剤の適切なゲル化は、パッチの接着のために重要であるため。 最初は、心筋梗塞の誘導であるとのプロトコル内の重要なステップと、エラーが発生しやすい地域の数があります。これは、左冠状動脈の閉塞を確実にするために、例えば、左心室壁のブランチング及び左心房の拡大などの徴候を確認することが不可欠です。これは、単に交差縫合糸列の端部を締め付けて縫目を添加する前に行うことができます。それは左冠状動脈を縫合によって囲まれていないと判定された場合、文字列を取り出すことができる、再適用しました。第二の重要な尺度は、気管内に残り、中間手術引き出されないことを確実にするために、手順全体を通して挿管チューブを監視し続けることです。最後に、手術を通して、すべての試みは、任意の連絡先がつぶれた肺につながる可能性を秘めているように、肺に接触しないようになされるべきです。、手術中に、肺の崩壊が発生し、単純にするための試みで、最大3秒間挿管の流出管をブロックした場合、肺の問題を抱えた領域を再膨張させます。

心筋梗塞（MI）は、主要な冠動脈の閉塞によって引き起こされる心臓の領域への血液の中断として定義されます。 MIに起因する損傷が原因または、より具体的には、左心室は、適切に打つ心臓の能力を低下させる非機能的瘢痕組織に生存可能心臓組織のリモデリングです。これは、一回拍出量としても知られているすべてのハートビート、および駆出率6と呼ばれる各心拍で心臓から送り出される血液の割合で身体に送達することができる血液の量の減少をもたらします。これらは、他の減少の機能とともに、十分な機能を維持するために、心臓の残りの部分に負担を増加させます。多くの場合、これは、株は、それが第二の心臓発作、個人7の約10％に見られる現象を引き起こすほど重症になることができます増加しました。 医療行為は、治療のために進化してきたがMIの直後には、何の技術は遅く、停止、ま​​たは組織リモデリングの負の副作用を逆転するように開発されていません。幹細胞療法は、それらの有望な潜在的にもかかわらず、しかし、そのような治療のための可能な道として出現した幹細胞は、臨床設定において成功することが証明されていません。その欠点の一つの理論は、有益な細胞が良好な結果5を生成するのに十分な長さ梗塞部位に残って確保することができないことです。これは単に、梗塞の部位に注射された細胞のない24％以上が生存していないと損傷部位1日後に配達2にとどまったことが示されています。細胞保持のこの問題に対処するための可能な見通しは、細胞または損傷部位に送達することができる治療薬のいずれかをカプセル化する生体適合性ヒドロゲル系を開発することです。このプロトコルにおける選択のヒドロゲルは、ポリ（エチレングリコール）は、細胞のカプセル化では、直前の使用広報によるメタクリレートでありますoceduresしかし、カプセル化することができる任意のヒドロゲルが8を使用してもよいです。直接損傷部位へのパッチの送達は、細胞が、下にある心筋に有益な因子を提供することができる時間の長さを増加させ、長期間にわたる細胞 - 組織接触を確実にします。 パッチアプローチのボトルネックは、心臓の表面にパッチを接着するのが困難です。多くのグループが、最も普及しているが、心臓の表面9,10に構造物を結びつけるための簡単な縫合糸である、種々の技術によってこれを克服しています。これは、構築物はより硬い材料で作られたケースの数は成功しますが、高い水濃度とパッチ構築物の繊細な性質のために、ヒドロゲル系にしようとしたときに失敗しました。これを克服するために、我々は、血栓形成の化学的性質を模倣するフィブリン糊外部接着剤系を利用しています。フィブリン糊は、INC、多数の医療手術で使用されています創傷シーラント11〜13として、製品の生体適合性を強調し、硬膜涙、気管支瘻、及び角膜移植をluding。さらに、フィブリンは、左心室破裂および冠動脈バイパス手術の外科的治療を含む心臓の目的の種々のために使用されている、しかし、心臓パッチの接着糊としてのその使用は、一般的に14〜17を使用していません。心臓の相互作用にパッチを確実にするために実行可能な接着システムを提供すること、外部心臓パッチの外側に直接配置することができる生体適合性の接着剤でトロンビンおよびフィブリノーゲン結果の単純な製剤。

<table><tbody><tr><td>Harvard Model 687 Mouse Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531961</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ6 surgical microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cautery Kit</td><td>Gemini</td><td>GEM 5917</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Agricola Retractor - 3.5 cm Spread</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>8-0 monofilament suture</td><td>Ethicon</td><td>8730P</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk suture</td><td>Ethicon</td><td>639G</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7009</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrogel construct and fibrin-based glue approach to deliver therapeutics in a murine myocardial infarction model.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo1. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased. 
Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream5. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

外科的処置の間に、左冠動脈の結紮は、閉塞した動脈の下流のブランチングマークすることによって同定することができます。結び目を作る前の試験のように、縫合糸は、それが適切な場所にあるかどうかを確認するために簡単に締め付けることができます。さらに、適切にビートに左心房の能力のほぼ瞬時減少動脈結果の閉塞ので、左心房は、システム内の血液の逆流に応じて拡大します。 Mモード心エコー検査の測定は、梗塞後は、筋肉の再構築を示す、左の壁運動の停止を示し、早くも2日としました。データから作られた定性的な計算は、梗塞心での駆出率とストローク量の減少を示します。心臓を組織学的目的のために収集されたときに実験の終了時に、左心室の明確な拡張は、左心室の薄型化に伴って、見ることができます壁、および機能の心筋細胞（ 図1）の代わりに、瘢痕組織の沈着を示し、コラーゲンの沈着。 また、（ 図2）は 、組織学的分析にヒドロゲルの存在は、フィブリンゲルの投与のおかげで構成で見られます。我々の目的のために、接着剤系は、正確な配置の制御を可能にし、周囲の器官に後続の流出を最小限にするのに十分に粘性でなければならないが、十分な展性心臓機能に干渉しません。予備試験は、我々のニーズに合った適切な組み合わせを決定するために、粘度、ゲル化時間、および様々なフィブリノゲン/トロンビン比の剛性を計算するために行われた。 インビボ分析はpatch-を維持するためにフィブリン糊の能力を試験するために行きました。の組織接着まだ完全心機能を可能にしながら（データは示さず）。これは、Lによって証明されるように、フィブリン糊は、心筋を傷つけるしなかったことに留意すべきです部位における組織リモデリング又は心室間伐のACK（ 図2）。心筋細胞は、心臓パッチとそれに付随する接着剤の両方の添加にもかかわらず、無傷のままです。さらに、生存能力試験は、細胞カプセル化ハイドロゲルパッチの外部表面にフィブリン接着剤の投与は、（ 図3）は 、パッチ内の細胞の生存に影響を及ぼさなかったことをことを確認しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig1.jpg" /> 図1：心エコー検査により測定される心機能の低下を左冠動脈結紮の結果（a）は、健康で、（b）は、梗塞心のMモード心エコー検査。梗塞心は、生存組織が瘢痕組織に置き換えられた壁運動の明確な欠如を示します。これは、左室駆出率（EF）で測定可能な減少と相関し、心臓発作ボリューム（SV）、および心拍出量（CO）。健康（c）および梗塞（d）の心臓の組織学的分析は、左心室および梗塞心筋の左心室壁の菲薄化、組織リモデリングおよび瘢痕組織沈着の両方の徴候の拡張を示しています。組織学的画像は、左（より大きな室）と右（小さい室）心室を捕獲する断面のスライスです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig2.jpg" /> 図2。胸腔を手順（a）の間に露出している心臓にフィブリン煙を確実に接着パッチの適用は、パッチは、心臓の表面上に配置されます。配置されたら、フィブリンベースの接着剤は、心臓の上部に添加し、乾燥させます。パッチは、明らかに1週間後手順（B）で採取した心臓組織の組織学的切片上で見ることができます。組織学的画像における心臓表面からパッチの解離が収集および切削プロセスの成果物です。結果は、接着までの8週間で一致しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig3.jpg" /> 図3：フィブリンベースの接着剤は、カプセル化された組織を損傷しない細胞の生存率は、1週間前の刊行物8に詳細に記載されたプロトコルを使用して、フィブリンベースの接着剤の投与後にMTT分析により測定しました。パッチ内の細胞の生存率は、構造物の表面に接着剤を添加することによって影響されませんでした。

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A Hydrogel Construct and Fibrin-based Glue Approach to Deliver Therapeutics in a Murine Myocardial Infarction Model.

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

ヒドロゲルは、構築し、マウス心筋梗塞モデルにおける治療薬を送達するためのフィブリンベースの接着剤のアプローチ。

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K ビュー.  University of Illinois at Urbana-Champaign. This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

生物工学

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

心臓組織工学のためのフィブリンゲルにおける心筋細胞のカプセル化

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

エンジニアリングフィブリンベースの組織の筋線維芽細胞と制約の適用からの構築と細胞とコラーゲン（再）組織を誘導するためにひずみ

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial cell delivery. Rodent model of myocardial infarction (MI) consisting of Left Anterior Descending Artery (LAD) ligation has commonly been performed via a thoracotomy; a second open-heart surgery via a sternotomy has traditionally been performed for epicardial application of the treatment. Since the description of LAD ligation model, post-surgery mortality rate has dropped from 35-13%, however the second surgery has remained critical. In order to improve post-surgery recovery and reduce pain and infection, minimally invasive surgical procedures are presented.&#160;Two thoracotomies were performed, the initial one for LAD ligation and the second one for treatment epicardial administration. Biografts consisting of cells associated with solid or gel type matrices were applied onto the infarcted area.&#160;LAD ligation resulted in loss of heart function as confirmed by echocardiography performed after 2 and 6 weeks. Goldner trichrome staining performed on heart sections confirmed transmural scar formation. First and second surgeries resulted in less that 10%&#160;post-operative mortality.&#160;

Implantation of a biograft to treat myocardial infarction induced by LAD ligation in a rodent model has conventionally required two open-heart surgeries. In order to reduce mortality and provide optimal conditions for fixation of solid and gelatinous biomatrices associated with cells, minimally invasive procedures have been developed.

ラットにおける心不全のための細胞ベースの治療：心筋梗塞および細胞およびバイオマトリックスの心外膜移植のためにダブル開胸

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

発生生物学

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

豚の心臓にローカルカテーテルを注入するための注射や薬物を装填した超分子ヒドロゲル

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD -ライゲーション：心筋梗塞のマウスモデル

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

生物学

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

肺特異的血管形成を研究するためにマウスの肺にフィブリンゲルの移植

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

医学

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and regenerative medicine. This protocol describes the stepwise fabrication of 3D myocardial tissues with advanced mimicry of native cardiac structure by combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds with fibrin hydrogels and human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac cells. The process involves embedding a mixture of cardiomyocytes (hiPSC-CMs) and cardiac fibroblasts (hiPSC-CFs) within a fibrin matrix to create mini-tissues, with structural support provided by MEW-generated scaffolds. These fibrillar scaffolds are fabricated at the micro- to nanoscale, allowing for precise control over fiber architecture, which plays a key role in organizing cell distribution and alignment. Meanwhile, the fibrin matrix promotes cell viability and mimics the extracellular environment. Characterization of the generated tissues reveals well-organized sarcomeres within hiPSC-CMs, along with stable contractile activity. The tissues demonstrate consistent spontaneous beating as early as two days post-seeding, with sustained functionality over time. The combination of hiPSC-CFs with hiPSC-CMs enhances the structural integrity of the tissues while supporting long-term cell viability. This approach offers a reproducible, adaptable, and scalable method for creating biomimetic cardiac tissue models, providing a versatile platform for preclinical drug testing, mechanistic studies of cardiac disease, and potential regenerative therapies.

A reproducible method is presented to generate 3D myocardial tissues combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds and fibrin hydrogels with hiPSC-derived cardiomyocytes and fibroblasts. This technique offers precise control over scaffold architecture and can be applied in preclinical drug testing and cardiac disease modeling.