Questo lavoro è stato finanziato dal US Army Grant (W81XWH-08-1-0701) e una borsa di studio da Carle Foundation Hospital.

La procedura è in piena compatibilità con numero di protocollo IACUC 13302 ed è stato approvato dalla divisione delle risorse animali. 1. Strumento Preparazione <ol><li> Autoclavare tutti gli strumenti non monouso utilizzati prima della procedura chirurgica per garantire la sterilità. </li><li> Sterilizzare gli strumenti utilizzati più volte in una sessione con una sterilizzatrice perle di vetro tra usi. </li></ol> 2. Hydrogel Preparazione <ol><li> Scongelare e le cellule staminali piatto almeno 24 ore prima della creazione del costrutto idrogel. </li><li> Preparate patch un giorno prima l&#39;intervento chirurgico utilizzando un apparato stereolitografia (o uno strumento simile) che è stato descritto in dettaglio in precedenti pubblicazioni 8,18. </li><li> Per creare l&#39;idrogel, prima di generare una progettazione assistita da computer (CAD) modello del patch desiderato ed esportare il design in formato stereolitografia (STL). </li><li> Creare una soluzione pre-gel per dissolving di poli (etilenglicole) dimetacrilato (PEGDMA) in PBS sterile 1x per ottenere 20% w / v soluzione. Contemporaneamente, sciogliere il fotoiniziatore 1- [4- (2-idrossi etossi) fenil] -2-idrossi-2-metil-1-propan-1-one in DMSO. Aggiungere il fotoiniziatore alla soluzione PEGDMA ad una finale w / v di 0,5%. Direttamente prima reticolazione, aggiungere 100 ml di densità di celle desiderato. Nota: Una densità delle cellule tra 2,0 x 10 5 -2.0 x 10 6 cellule / ml è raccomandato. </li><li> Pipettare la soluzione pre-gel in un piatto al centro della piattaforma SLA ed eseguire il software SLA con la STL formattato disegno già caricato. </li><li> Rimuovere le patch dall&#39;apparato incubare idrogel O / N a modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 5% bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina per consentire cellule per regolare per l&#39;ambiente all&#39;interno della patch. </li></ol> 3. Preparazione degli animali e intubati oralesu <ol><li> Valutare ogni mouse prima della procedura per garantire che l&#39;animale è in buona salute, come determinato dalle loro abitudini di toelettatura e le interazioni con i loro compagni di gabbia. Nota: femmina 8-10 settimane di età C57BL / 6J sono stati usati per questa procedura, però, può essere utilizzato qualsiasi età mouse o tipo. </li><li> Inserire animali in una camera anestetico ed esporre al 5% isofluorano con un supporto 1 L / min O 2. Monitorare il livello di anestesia da pizzico piedi reflex. </li><li> Una volta che l&#39;animale sia adeguatamente anestetizzato, pesare e metterli sul supporto intubazione. </li><li> Dirigere una sorgente di luce verso cavità toracica dell&#39;animale e utilizzare pinze per ritrarre la superficie della laringe ed esporre le corde vocali. Guidare con attenzione un G angiocath 20 tra le corde vocali, e senza intoppi inserire nella trachea. Controllo corretto inserimento da un movimento meccanico della cavità toracica una volta che il catetere è collegato al piccolo ventilatore animali. </li><li> Regolare le impostazioni di ventilazione a the peso dell&#39;animale base alle linee guida del produttore. </li><li> Una volta intubato, mettere l&#39;animale in posizione supina su una piastra elettrica per evitare l&#39;ipotermia. Assicurarsi che il pad di riscaldamento non superi i 40 ° C. Se necessario, posizionare una barriera tra l&#39;animale e il pad di riscaldamento per ridurre al minimo il rischio di ustioni. </li><li> Rimuovere capelli dal sito chirurgico attraverso l&#39;uso di una crema depilatoria. Sterilizzare il sito da 3 scrub alternati di betadine e il 75% di etanolo per garantire una corretta sterilizzazione. Posizionare un drappo per esporre solo il sito chirurgico e posizionare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura. </li></ol> 4. Procedura chirurgica <ol><li> La toracotomia viene eseguita sul lato sinistro dell&#39;animale, quindi, fare una incisione cutanea circa 1 cm a sinistra dello sterno, che corre lungo sterno. </li><li> Utilizzare pinze per separare lo strato muscolare della gabbia toracica sottostante in due fasi. Osservare una DelineLinea DELL&#39;INDICE DI che rappresenta gran pettorale muscoli dell&#39;animale. Sollevare questo muscolo un po &#39;, separarlo dal sottostante muscolo obliquo esterno e ritrarre mediale. Poi, liberare il muscolo obliquo esterno dalla gabbia toracica sottostante nello stesso modo, e retrarre lateralmente, fornendo una vista accessibile del secondo, terzo, e quarto costole. </li><li> Eseguire la toracotomia tra la terza e la quarta costola. Sollevare delicatamente la quarta costola e utilizzare un cauterizer per aprire la cavità toracica tra la terza e quarta costola. Posizionare divaricatori per aprire ulteriormente la cavità ed esporre il cuore. </li><li> Utilizzare pinze per rompere il sottile pericardio del cuore. </li><li> Legare l&#39;arteria coronaria sinistra con una sutura in nylon 8-0 monofilamento. Posizionare la sutura circa 4 mm dalla punta del cuore, direttamente sotto la punta inferiore dell&#39;atrio sinistro. Determinare il corretto posizionamento di sutura da un pallore del miocardio ventricolare ed un aumento delle dimensioni dell&#39;atrio sinistro dopo la Suture è stato legato. </li></ol> 5. Patch Placement e colla <ol><li> Mantenere patch a 37 ° C e 5% CO 2 condizioni fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sollevare delicatamente la patch con una spatola ended piana e posizionare delicatamente sulla superficie del cuore, nel sito di infarto. Nota: per evitare di scivolare fuori dal ventricolo sinistro, la patch può essere tenuto in posizione da mantenere leggermente contatto utilizzando la spatola o la punta di un paio di pinze. </li><li> Preparare la colla mescolando un rapporto 4: 1 di fibrinogeno in trombina. Miscelare la soluzione pipettando ripetutamente finché comincia ad addensarsi, di solito entro 1 minuto dopo l&#39;inizio della preparazione. </li><li> Una volta che la viscosità della soluzione raggiunge il livello desiderato, trasferire rapidamente circa 10 ml alla superficie patch. Nota: Il tempo di coagulazione della colla di fibrina è rapido, fornendo una piccola finestra di opportunità per un efficiente trasferimento della colla. </li></ol> 6. sutura <ol><li&gt; eseguire tutti i punti di sutura di chiusura con una sutura in nylon 6-0 monofilamento. </li><li> Chiudere lo strato costola con 3-4 singoli punti staccati. </li><li> Prima chiusura completa dello strato intercostali, inserire una cannula PE-10 nell&#39;incisione per evacuare la cavità toracica dopo la chiusura è completa e ristabilire la corretta pressione intrapleurica. </li><li> Chiudere i muscoli pettorali con 3-4 singoli punti staccati. </li><li> Sigillare lo strato di pelle con una sutura continua. </li><li> Dopo completa chiusura, collegare una siringa 1,0 ml al termine della cannula e utilizzarlo per evacuare la cavità toracica. </li><li> Applicare un tessuto adesivo al sito di incisione per rinforzare il sito di sutura. </li></ol> Trattamento 7. post-chirurgico <ol><li> Dare topi un&#39;iniezione di buprenorfina (0,05-1,0 mg / kg) e carprofen (2,2 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo la legatura coronarica e almeno 20 minuti prima del risveglio. Somministrare entrambi i farmaci 6-8 ore dopo l&#39;intervento chirurgico, E poi dare due volte al giorno per un massimo di tre giorni per controllare il dolore e angoscia. </li><li> Monitorare costantemente gli animali fino consapevole e ogni ora, per la prima dopo l&#39;intervento di 4 ore. Eseguire un secondo controllo la sera della chirurgia (2-4 ore più tardi) per somministrare una seconda dose di analgesico. </li><li> Monitorare gli animali ogni giorno dopo il secondo giorno dopo la procedura, fino a quando gli animali appaiono stabili. </li></ol> 8. Analisi di funzionamento del cuore e Istologia <ol><li> Eseguire ecocardiografi sui topi 4 settimane dopo la procedura per determinare l&#39;entità del danno a seguito del MI. </li><li> Anestetizzare topi con 4-5% isoflurano in una camera di anestesia per l&#39;induzione di anestesia per inalazione, e poi 2% isoflurano via maschera per l&#39;anestesia di mantenimento. </li><li> Eliminare l&#39;area di esposizione con una crema depilatoria e utilizzare un piccolo animale ultrasuoni per ottenere un 2D M-mode dell&#39;ecocardiografia scansione del cuore pulsante e registrare i parametri funzionali associato con esso. </li><li> Euthanize i topi in una camera di anidride carbonica, quindi raccogliere i cuori dagli animali e posto in una soluzione di formalina al 10% per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire i cuori al 70% di etanolo e conservare a 4 ° C fino al trattamento dei tessuti. </li><li> Elaborare i cuori e li incorpora in blocchi di paraffina. </li><li> Tagliare 5 millimetri sezioni attraverso la regione ventricolare del cuore, partendo all&#39;apice e terminando l&#39;atrio. </li><li> Stain fette con entrambi tricromica di Masson e ematossilina e eosina utilizzando protocolli standard sezionato. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Con questo approccio al modello MI murino, abbiamo sviluppato un sistema che riduce al minimo il danno alle zone non miocardio che sono associati con altre tecniche MI murine. Queste aree includono danni causati da tracheostomia, il taglio dello strato muscolare, e la rottura delle nervature per esporre la cavità toracica. Crediamo che questi cambiamenti migliorare le generali chirurgici risultato grazie alla cura di mantenere il più delle grandi strutture, comprese le costole e strati muscolari, intatto durante la procedura chirurgica. Va notato che ci sono alcune limitazioni a questa tecnica, con il più grande è la sua natura richiede tempo, con conseguente solo 8-10 procedure chirurgiche complete in un giorno. Per ovviare a questo, un secondo ventilatore può essere utilizzato, consentendo la procedura da eseguire su due animali contemporaneamente. Inoltre, grandi vasi, come i vasi intercostali einterno arteria toracica, dovrebbe essere evitato quando si esegue la toracotomia. Se vicino a uno di questi vasi, una cauterizer deve essere usato per prevenire le emorragie a causa di una rottura di un&#39;arteria. Colla di fibrina è noto sia nel laboratorio e impostazioni cliniche, grazie alla sua capacità di aiutare rapidamente in formazione del coagulo, così come la sua capacità di fornire e MSC ospitanti 14-17,19. Per i nostri scopi, colla di fibrina servito come un approccio biocompatibile ad aderire un idrogel a base di acqua costrutto alla superficie del cuore. L&#39;uso di una colla a base di fibrina è dimostrata efficace nel mantenere il costrutto idrogel al sito danneggiato per 8 settimane, con la possibilità di contatto del tessuto di un tempo più lungo. L&#39;utilizzo di questo sistema di aderenza permesso di controllo per il posizionamento del delicato costrutto senza la necessità di suture supplementari che danneggiano il miocardio nonché il costrutto stesso. Abbiamo trovato che la colla stessa è non tossico per le cellule incapsulate unnd non influenza negativamente il tessuto sottostante. L&#39;idrogel e sistema di colla a base di fibrina possono essere applicati a una varietà di altri scopi ingegneria dei tessuti che desiderano cellule o contatto terapeutico per un periodo di tempo prolungato. Inoltre, con l&#39;uso del metodo SLA fabbricazione, disegni e strutture possono essere incorporati nel cerotto per creare un sistema più complesso per la consegna cella 18. Una battuta d&#39;arresto per l&#39;uso della colla a base di fibrina, è il fatto che più di un ricercatore deve essere presente in sala chirurgica durante il posizionamento di patch e colla aggiunta. È compito del primo ricercatore per assicurarsi che il cerotto rimane in posizione e non si perde nella cavità toracica, mentre il secondo ricercatore mescola la soluzione e la applica alla patch dopo il raggiungimento viscosità adeguata. Per ottimizzare i tempi di consegna colla, si suggerisce che la seconda ricercatore verifica anche e tempi di gelificazione della colla prima del posizionamento patch,poiché la corretta gelificazione della colla è fondamentale per l&#39;adesione di patch. Ci sono un certo numero di passaggi critici e di errore zone soggette nell&#39;ambito del protocollo, con il primo è l&#39;induzione di infarto miocardico. È indispensabile per verificare eventuali segni, come la scottatura della parete ventricolare sinistra e l&#39;allargamento dell&#39;atrio sinistro, per garantire l&#39;occlusione dell&#39;arteria coronaria sinistra. Questo può essere fatto prima della aggiunta del punto attraversando semplicemente e stringendo la fine delle corde sutura. Se si determina che l&#39;arteria coronaria sinistra non è racchiuso da sutura, la stringa può essere tolto e riapplicato. Una seconda misura fondamentale è quello di continuare a monitorare il tubo di intubazione durante tutta la procedura, per garantire che rimanga all&#39;interno della trachea e non viene tirato fuori metà chirurgia. Infine, per tutta la chirurgia, tutti i tentativi dovrebbero essere fatti per evitare il contatto con i polmoni, come qualsiasi contatto ha il potenziale per portare ad un polmone collassato.Se, durante l&#39;intervento, si verifica collasso polmonare, semplicemente bloccare il tubo di efflusso della intubator fino a 3 sec nel tentativo di rigonfiare tormentate regioni polmoni.

Un infarto del miocardio (MI) è definito come l&#39;interruzione di sangue ad una regione del cuore causata dalla occlusione di un&#39;arteria coronaria. Il danno derivante da un MI è dovuto al rimodellamento del tessuto cardiaco vitale in tessuto cicatriziale non funzionale, che diminuisce la capacità del cuore o, più specificamente, il ventricolo sinistro, per battere correttamente. Ciò si traduce in una diminuzione del volume di sangue che può essere consegnato al corpo ad ogni battito cardiaco, chiamata volume ictus, e la percentuale di sangue che viene pompato dal cuore ad ogni battito cardiaco, noto come frazione di eiezione 6. Questi, insieme ad altre funzioni diminuita, aumenta la tensione sul resto del cuore per mantenere la funzione adeguata. Spesso, questo aumento ceppo può diventare così grave che provoca un secondo attacco cardiaco, un fenomeno visto in circa il 10% degli individui 7. Mentre le pratiche mediche si sono evoluti per trattaresubito dopo un infarto miocardico, nessuna tecnica è stata sviluppata per fermare, rallentare o invertire gli effetti collaterali negativi di rimodellamento tissutale. Terapie con cellule staminali sono emersi come una possibile via per un tale trattamento, tuttavia, nonostante il loro potenziale promettente, le cellule staminali non hanno dimostrato con successo in ambito clinico. Una teoria le loro carenze è l&#39;incapacità di garantire le cellule benefiche rimangono nella sede dell&#39;infarto abbastanza lungo per generare risultati favorevoli 5. È stato dimostrato che non più del 24% di cellule che sono semplicemente iniettato nel sito di infarto sopravvissuto, rimanendo al primo danneggiata sito: 1 giorno post-parto 2. Una possibile prospettiva per affrontare la questione della conservazione delle cellule è quello di sviluppare sistemi di idrogel biocompatibile che incapsulano sia cellule o terapeutica, che possono essere consegnati al sito danneggiato. L&#39;idrogel di scelta in questo protocollo è un poli (glicole etilenico) dimetacrilato grazie al suo impiego precedente incapsulamento della pila procedures, tuttavia, qualsiasi idrogel grado di incapsulamento può essere utilizzato 8. La consegna della patch direttamente al sito di lesione assicura il contatto cellula-tessuto per un periodo prolungato di tempo, aumentando la lunghezza di tempo le cellule possono fornire fattori positivi al miocardio sottostante. Un collo di bottiglia per l&#39;approccio patch è la difficoltà di aderire il cerotto alla superficie del cuore. Molti gruppi hanno superato questo attraverso una varietà di tecniche, i più diffusi essendo una semplice sutura per legare il costrutto alla superficie cardiaca 9,10. Questo si è dimostrato efficace in un numero di casi in cui il costrutto è fatto di un materiale più rigido, ma non riesce quando tentato su un sistema idrogel, a causa della concentrazione di acqua ad alta e delicata natura del costrutto patch. Per ovviare a questo, abbiamo utilizzato una colla di fibrina sistema adesivo esterno che imita la chimica di formazione del coagulo. Colla di fibrina è stata utilizzata in numerosi studi medici, incLuding lacrime Dura, fistole bronchiali, e trapianto di cornea, mettendo in evidenza la biocompatibilità del prodotto come sigillante ferita 11-13. Inoltre, la fibrina è stato utilizzato per una varietà di scopi cardiache, compreso il trattamento chirurgico delle fratture del ventricolo sinistro e coronarici chirurgia di bypass, tuttavia, il suo uso come una colla adesione per una patch cardiaca non è comunemente usato 14-17. Una semplice formulazione di trombina e fibrinogeno risultati in una colla biocompatibile che può essere posizionato direttamente sulla parte esterna di un cerotto cardiaco esterno, fornendo un sistema di aderenza sostenibili in modo cerotto all&#39;interazione cuore.

<table><tbody><tr><td>Harvard Model 687 Mouse Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531961</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ6 surgical microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cautery Kit</td><td>Gemini</td><td>GEM 5917</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Agricola Retractor - 3.5 cm Spread</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>8-0 monofilament suture</td><td>Ethicon</td><td>8730P</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk suture</td><td>Ethicon</td><td>639G</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7009</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrogel construct and fibrin-based glue approach to deliver therapeutics in a murine myocardial infarction model.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo1. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased. 
Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream5. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

Durante la procedura chirurgica, legatura dell&#39;arteria coronarica sinistra può essere identificato da un marcato blanching valle dell&#39;arteria occlusa. Come test prima di sposarsi, la sutura può essere stretto per breve tempo per verificare se è in un luogo adeguato. Inoltre, poiché occlusione delle arterie risultati in diminuzione quasi istantanea nella capacità dell&#39;atrio sinistro per battere correttamente, l&#39;atrio sinistro si allargherà in risposta ad un riflusso di sangue nel sistema. M-mode misurazioni ecocardiografia prese fin da due giorni post-infarto mostrano una cessazione di movimento parete sinistra, indicativa della ricostruzione muscolare. Calcoli qualitativi realizzati con i dati mostrano una diminuzione della frazione di eiezione e gittata sistolica nei cuori infartuati. Al termine della sperimentazione, quando i cuori sono raccolti per scopi istologiche, una chiara dilatazione del ventricolo sinistro può essere visto, insieme con un assottigliamento del ventricolo sinistroparete, e la deposizione di collagene che denota deposizione di tessuto cicatriziale in luogo dei cardiomiociti funzionamento (Figura 1). Visto anche all&#39;analisi istologica è la presenza del idrogel costruire grazie alla somministrazione del gel di fibrina (Figura 2). Per i nostri scopi, il sistema adesivo deve essere sufficiente per consentire un controllo preciso posizionamento e minimizzare conseguente deflusso in organi circostanti viscoso, ma non abbastanza malleabile interferire con la funzione del cuore. Test preliminari sono stati eseguiti per calcolare la viscosità, tempo di gelificazione, e la rigidità di vari rapporti fibrinogeno / trombina, per determinare la combinazione corretta che si adatta alle nostre esigenze. In vivo analisi è stata effettuata per testare la capacità della colla di fibrina mantenere Adesivo- di tessuti adesione pur consentendo per la funzione cuore pieno (dati non riportati). Va notato che la colla di fibrina non danneggia il miocardio, come dimostra il lack di rimodellamento tissutale o ventricolare assottigliamento al sito (Figura 2). I cardiomiociti rimangono intatte nonostante l&#39;aggiunta di un cerotto sia cardiaco e la sua colla accompagnamento. Inoltre, test di capacità ha confermato che la somministrazione di colla di fibrina sulla superficie esterna di un cerotto idrogel cellulare incapsulare non influenzava la sopravvivenza cellulare nel patch (figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig1.jpg" /> Figura 1:. Sinistra coronariche Risultati legatura dell&#39;arteria in una diminuzione della funzione cardiaca misurata mediante ecocardiografia M-mode l&#39;ecocardiografia di (a) sana e infartuati (b) i cuori. Cuori infartuati mostrano una chiara mancanza di movimento della parete dove il tessuto vitale è stato sostituito con tessuto cicatriziale. Questo è correlato con una diminuzione misurabile della frazione di eiezione ventricolare sinistra (EF), ictus cardiacaVolume (SV), e gittata cardiaca (CO). Analisi istologica dei sani (c) e (d) infartuati cuori mostra dilatazione del ventricolo sinistro e assottigliamento della parete del ventricolo sinistro del miocardio infartuato, entrambi i segni di rimodellamento tissutale e deposito di tessuto cicatriziale. Immagini istologiche sono fette sezione trasversale catturando il diritto (camera più piccola) ventricoli sinistro (camera più grande) e. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig2.jpg" /> Figura 2:. Applicazione di fibrina fumaria Assicura Patch Adesione al Cuore La patch è posto sulla superficie del cuore, mentre la cavità toracica è esposto durante il procedimento (a). Una volta posizionato, una colla a base di fibrina viene aggiunto sulla parte superiore del cuore e lasciato asciugare. La patch può essere visto chiaramente su sezioni istologiche di tessuto cardiaco che sono stati raccolti in 1 settimana dopo la procedura (b).La dissociazione della patch dalla superficie cardiaca in immagini istologiche è un artefatto del processo di raccolta e sezionamento. I risultati sono coerenti fino a 8 settimane di adesione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig3.jpg" /> Figura 3: a base di colla di fibrina non danneggia incapsulati tessuti vitalità cellulare è stata misurata mediante analisi MTT 1 settimana dopo la somministrazione di una colla a base di fibrina che utilizzano protocolli descritti in dettaglio in precedenti pubblicazioni 8.. La vitalità delle cellule all&#39;interno del patch non è stata influenzata dall&#39;aggiunta di colla sulla superficie del costrutto.

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A Hydrogel Construct and Fibrin-based Glue Approach to Deliver Therapeutics in a Murine Myocardial Infarction Model.

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

Un idrogel Costruire e fibrina-based Glue approccio per fornire Therapeutics in una murino Myocardial Infarction Model.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of ...

a-hydrogel-construct-fibrin-based-glue-approach-to-deliver

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign. This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l&#39;ingegneria tissutale miocardica

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Ricerca

Bioingegneria

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l&#39;ingegneria tissutale cardiaca

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Ingegneria fibrina a base di tessuto costrutti da miofibroblasti e applicazione di vincoli e la tensione per indurre Organizzazione cellulare e collagene (Re)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial cell delivery. Rodent model of myocardial infarction (MI) consisting of Left Anterior Descending Artery (LAD) ligation has commonly been performed via a thoracotomy; a second open-heart surgery via a sternotomy has traditionally been performed for epicardial application of the treatment. Since the description of LAD ligation model, post-surgery mortality rate has dropped from 35-13%, however the second surgery has remained critical. In order to improve post-surgery recovery and reduce pain and infection, minimally invasive surgical procedures are presented.&#160;Two thoracotomies were performed, the initial one for LAD ligation and the second one for treatment epicardial administration. Biografts consisting of cells associated with solid or gel type matrices were applied onto the infarcted area.&#160;LAD ligation resulted in loss of heart function as confirmed by echocardiography performed after 2 and 6 weeks. Goldner trichrome staining performed on heart sections confirmed transmural scar formation. First and second surgeries resulted in less that 10%&#160;post-operative mortality.&#160;

Implantation of a biograft to treat myocardial infarction induced by LAD ligation in a rodent model has conventionally required two open-heart surgeries. In order to reduce mortality and provide optimal conditions for fixation of solid and gelatinous biomatrices associated with cells, minimally invasive procedures have been developed.

Terapia cellulare per insufficienza cardiaca nel ratto: Doppia Toracotomia per infarto miocardico e epicardico impianto di cellule e Biomatrix

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

Lavorazione di tessuto cardiaco umano verso la matrice extracellulare autoassemblanti idrogel per In Vitro e In Vivo applicazioni

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Biologia dello sviluppo

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Un supramolecolare idrogel iniettabile and Drug-caricato per catetere iniezione locale nel cuore di maiale

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD-Legatura: un modello murino di infarto miocardico

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Biologia

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Medicina

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Trapianto di una patch biostampa 3D in un modello Murine di infarto miocardico

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and regenerative medicine. This protocol describes the stepwise fabrication of 3D myocardial tissues with advanced mimicry of native cardiac structure by combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds with fibrin hydrogels and human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac cells. The process involves embedding a mixture of cardiomyocytes (hiPSC-CMs) and cardiac fibroblasts (hiPSC-CFs) within a fibrin matrix to create mini-tissues, with structural support provided by MEW-generated scaffolds. These fibrillar scaffolds are fabricated at the micro- to nanoscale, allowing for precise control over fiber architecture, which plays a key role in organizing cell distribution and alignment. Meanwhile, the fibrin matrix promotes cell viability and mimics the extracellular environment. Characterization of the generated tissues reveals well-organized sarcomeres within hiPSC-CMs, along with stable contractile activity. The tissues demonstrate consistent spontaneous beating as early as two days post-seeding, with sustained functionality over time. The combination of hiPSC-CFs with hiPSC-CMs enhances the structural integrity of the tissues while supporting long-term cell viability. This approach offers a reproducible, adaptable, and scalable method for creating biomimetic cardiac tissue models, providing a versatile platform for preclinical drug testing, mechanistic studies of cardiac disease, and potential regenerative therapies.

A reproducible method is presented to generate 3D myocardial tissues combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds and fibrin hydrogels with hiPSC-derived cardiomyocytes and fibroblasts. This technique offers precise control over scaffold architecture and can be applied in preclinical drug testing and cardiac disease modeling.

Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Un idrogel Costruire e fibrina-based Glue approccio per fornire Therapeutics in una murino Myocardial Infarction Model.

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l'ingegneria tissutale miocardica

Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l'ingegneria tissutale cardiaca