The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.

The authors have nothing to disclose.

58 -生物学的薬剤の製造のための、および細胞治療のために哺乳動物細胞産物の生成は、大規模での哺乳動物細胞55の文化と監視が必要です。さらに、これらのアプリケーションは、定義され、検証された培養条件を求めます。単純にこれらの要件のすべてを満たしていないであろう研究技術を用いて細胞の量を増加させます。栄養素や老廃物の蓄積の変動を引き起こすマニュアルの媒体の変更は、細胞質、生存率および収量を減らします。バイオリアクターの使用は、生物医薬用途のための微生物の商業的培養のために確立され、同様の戦略は、哺乳動物細胞培養物に適用されています。それらの環境と、哺乳動物細胞の複雑な相互作用は、細胞増殖の可能性を最適化するために、栄養素のレベルを調節するために特定の変更を必要とします。 これらの問題に対処するために、我々はstraightfoを開発しました変動金利灌流送り機構と攪拌懸濁液バイオリアクター内の生理学的レベルを近似する、特定の目標範囲内にグルコースレベルを維持するrward方法。これを達成するために、β細胞株のスフェロイドは、撹拌懸濁バイオリアクター中で生成しました。灌流供給システムは、標準的なバッチ供給手順を置き換えるために、連続送り機構を提供するために使用しました。細胞増殖速度が観察され、おおよそのグルコース利用率を予測するために使用しました。実際のグルコースレベルは、実際に消費栄養素および細胞によって培地中に堆積代謝産物に応じて送り速度を調整するために培養中で経時的に測定しました。この方法は、グルコースレベルを3日毎に培地交換して劇的に変動他の静的およびSSBシステム3で見られたグルコースレベルの変動を防止します。バッチ送り戦略を使用して、グルコース濃度が遅い段階で、3日間にわたって275 mgの/ dlのと同じくらいを落としました21日間の膨張S。グルコースレベルにおけるこれらの変動は、細胞収量を制限しました。 調整された供給システムの実証のための培地交換速度の計算は、それぞれの供給時点で確立された増殖速度と細胞株のためのグルコース消費速度、ならびに観察（測定）培養密度およびグルコースレベルを組み込みました。異なる細胞型のために、またはより複雑な組織培養システムでは、これらの仮定が成り立たなくてもよいです。より正確な血糖コントロールを確保するために、アルゴリズムは、個々の培養物の変動を考慮するためのフィードバック制御系を含んでいました。スフェロイドならびに分化幹細胞のようなパラメータに基づいて、グルコース消費における変化を通じて細胞に対するグルコース利用における不均一性の影響を含む単独の成長率に基づいて、灌流法の限界は、フィードバック制御システムによって緩和することができます。用途に応じて、細胞exponeを示すことntial成長率またはより複雑な増殖プロフィールは、アルゴリズムの性能を改善するために実施することができます。送り速度の計算に用いられた仮定及び値は、実際の培養条件に準拠するように変更することができます。 提示方法は、スフェロイドの拡大培養は、有限の持続時間のためになるた治療用途のための細胞を産生するように意図され、そしていくつかの研究者は連続的に使用して拡大または培養細胞するそれ自体が生成物である細胞が..それが望ましい場合があります同様の方法が、これは、これらの研究のために遭遇していない他の課題を提示します。長時間培養した場合、スフェロイドは、サイズが成長し続けるだろう、と回転楕円体の核内のいくつかの細胞の生存率が原因栄養と酸素の拡散制限を増やすに低下することがあります。これらの培養物は、長期培養が所望される場合、この制限を防止するために、大規模なスフェロイドを解離するためのさらなる操作を必要とし得ます。生存率の低下は、この制限は、この研究の21日間の培養期間中に到達しなかったことを示唆し、このプロトコルを使用して生成スフェロイドのために認められませんでした。 細胞療法のために、これらの技術は、細胞収量、機能および生存率を改善するためにさらなる調節システムと組み合わせて使用​​することができます。例えば、SSBの方法は、細胞増殖速度、または細胞もしくはスフェロイドのカプセル化を向上させる接着性細胞のためのマイクロキャリア表面培養物を含む促進技術と組み合わせることができます。さらに、より複雑な調整アルゴリズムは、より厳密な培養コントロールを提供するために実装することができます。供給調整は、pH、溶存酸素濃度、温度、およびさらに改善59,60を作製するための試薬の注入のような複数の他のパラメータの制御と組み合わせることができます。他のアプリケーションで結果を改善するために、この方法は15,24を自動化することができ、及び供給速度は、Mを計算することができます。鉱石以下、多くの場合、さらに精製培養条件。 63再現性の生物学的な製品を作るために定義されており、慎重に制御されなければならない-製造業は61で処理されます。連続した培地交換の使用は、大規模な細胞産生で観察された重要な栄養素の変動を軽減するために使用することができ、かつ調整可能な供給システムを組み込むことは、所望の栄養レベルを維持するために、セル環境でもより多くの制御を実現することができます。記載された方法は、細胞と医薬品の両方のための他の哺乳動物細胞を使用することができます。

移植のための生存および機能的ヒト細胞を大量に生成するために、培養条件の調節に不可欠です。 3 -代謝老廃物の蓄積に伴う栄養素の枯渇は、細胞産物1の品質を低下させる老化および代謝変化の主な原因です。この手順では、培養期間を通じて生理学的範囲4中のグルコースを調節するために調整されたレート灌流供給システムと組み合わせて攪拌バイオリアクターを用いて、スフェロイドにおける培養哺乳動物細胞への方法を示しています。これらの研究のために、生理学的範囲は、100〜200ミリグラム/デシリットルと定義しました。同方法は、乳酸のような他の栄養素および代謝廃棄物を調節するために使用することができます。 少量の静的培養（1 - 30ml）を、典型的にはexperimeための細胞系を維持し、区別するために、実験室の設定で使用されていますNTAL目的。細胞の継代は、定期的に、必要に応じて完全培地の変更を行います。ほとんどの「従来の」培地は、栄養制限のリスクなしあまり頻繁に培地交換を可能にするために、高グルコース濃度（これらの研究で使用したDMEM 450ミリグラム/デシリットル）を有しています。しかし、このバッチ供給方法はまだ、頻繁な操作を必要とするセル環境の変動を紹介し、汚染5のリスク増加- 9。攪拌した懸濁液バイオリアクター（SSB）より良好な混合を提供し、3,10取り扱い減少- 20が、静的な文化など、栄養と廃棄物レベルの潜在的に有害な変動に貢献マニュアル培地交換を必要とします。 SSB培養の灌流供給は連続注入し、培地を除去することにより、これらの問題を減少するが、細胞増殖に起因する栄養レベルの大きな変化は、問題が残っています。調整後の送りraの使用推定されたセルの要件に基づいて、栄養利用の計算から、TEは、細胞生存率を最適化するために必要な安定な細胞環境を提供し、21機能することができる- 24。 25具体的に多能性細胞の培養および拡大のための哺乳動物細胞のスケーラブルSSB培養のための方法について説明する多数の文献がある-他の人と32は 、膵島（ベータ）細胞17,33,34に焦点を当てたが、または生物学的製品24の生産、 35から38。これらの調査の細胞型の多くは、スフェロイド培養物中で成長させてもよいし、使用される細胞型に特異的な手順は、連続的な供給システムを実装する前に最適化されるべきです。 43 -この実証では、灌流供給方法は、撹拌バイオリアクター39におけるスフェロイドとして増殖させ、β細胞株を拡大するために使用されました。本明細書に記載される方法を提供します標的培養条件を達成するために、オフライングルコース測定値に基づいて速度調整を供給する簡単な実装。生理学的なグルコースレベルを維持するために、この方法では供給量を調整すること増加細胞収率を示しています。哺乳動物細胞は、エネルギー産生のために、重要な栄養素、グルコースに依存しているので、この細胞株の使用は、多くの培養哺乳動物細胞44のモデルを表します。また、この線は、グルコース45の慢性的に高いレベルに感受性であるベータ細胞のさらなる複雑性を例示します。この研究のために、β-TC6細胞を、インビボでのランゲルハンス島の平均サイズを近似するために、培養中のスフェロイドを形成させました。灌流バイオリアクターシステム17 -消費グルコース調節供給速度で19,21,46は 、生存率の変化なしに、生理学的条件およびより高い細胞収率を維持することになりました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:249px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number / Link</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BTC-6 Cells</td>
			<td style="width:249px;">ATCC, Manassas, VA</td>
			<td style="width:153px;">CRL-11506</td>
			<td>Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DPBS No CA, No Mg</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">14190-144</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>See below for product numbers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMEM High Glucose (500mM)</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>11965-092</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMEM Low Glucose (100mM)</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>11885-084</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyruvate)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">L-gultamine</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">25030081</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">11360070</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Heat Inactivated Porcine Serum</td>
			<td style="width:249px;">Gibco - Life Technologies</td>
			<td style="width:153px;">10082147</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">25200056</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">T-150 Tissue Culture Treated Flasks</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">430825</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)&amp;categoryname=">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) 
			&#38;categoryname=</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuAire Cell culture incubator</td>
			<td style="width:249px;">Princeton, MN</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Refrigerator</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1L Glass Bottle</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">1395-1L</td>
			<td>Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) 
			&#38;categoryname=</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">2L Glass Bottle</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">1395-2L</td>
			<td>Any vendor could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">250 ml stirred bioreactors&#160;</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">4500-250</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)&amp;categoryname=">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) 
			&#38;categoryname=</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stir Plate</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">11-496-104A</td>
			<td>Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tissue Culture Dishes 100mm Diameter</td>
			<td style="width:249px;">Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:153px;">1256598&#160;</td>
			<td>Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">FALCON 50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:249px;">Falcon, San Jose, CA</td>
			<td style="width:153px;">1256598</td>
			<td>Any vendor could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Delran Plastic Used for Custom Parts</td>
			<td style="width:249px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:153px;">Various</td>
			<td>Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stainless Steel Pipe for custom lids</td>
			<td style="width:249px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:153px;">Various</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding</td>
			<td style="width:249px;">Custom made&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Not aware of any vendors producing a similar product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding</td>
			<td style="width:249px;">Custom made&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Masterflex Digital Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">EW-77919-25</td>
			<td>Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ 
			Cartridge_Pump_System_115_230 
			_VAC/EW-77919-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PVDF Tubing Connectors (various)</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">see link</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium 
			_Luer_Fittings/55889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pharmed BPT Tubing L/S 16</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">WU-06508-16</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing 
			_L_S_13_25/WU-06508-16</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pharmed BPT Tubing L/S 14</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">WU-06508-14</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing 
			_L_S_13_25/WU-06508-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pharmed BPT Tubing L/S 13</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">WU-06508-13</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing 
			_L_S_13_25/WU-06508-13</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration)</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">SLGP033RS</td>
			<td>Any vendor could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">25ml Graduated Pipette</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">13-678-11</td>
			<td>Any vendor could be used, and various sizes may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pipetter</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">13-681-15E</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">02-671-6</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:249px;">Gibco - Life Technologies</td>
			<td style="width:153px;">15250-061</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Inverted Light Microscope</td>
			<td style="width:249px;">Leica</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">One Touch Ultra Blood Glucose Meter</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">22-029-293&#160;</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">One Touch Ultra-Strips</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">22-029-292&#160;</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nutrient regulation by continuous feeding for large-scale expansion of mammalian cells in spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

ミディアムグルコースレベルと変動が標準SSB培養における細胞増殖を制限します グルコース濃度は培養期間3を通して静置培養し、SSB培養で変動します。これらの変動は、21日間の培養期間中の細胞数の増加に伴って強化し、静的およびSSB培養物の両方においてほぼ同じでした。これらの観察は、我々の以前の出版物3に示されています。血糖値は、両方の方法のための培養期間の持続時間の超生理学的であることができます。この慢性暴露は、細胞増殖54を阻害することができるので、連続供給システムは、グルコース変動を排除し、スフェロイド培養中の栄養管理を改善するために開発されました。 スフェロイド培養のための連続供給システム 継続的に新鮮な培地を添加し、培養期間中の古い培地を除去単純な培地補充システムを用いて達成することができます。方法2に記載されており、 図1に示すシステムは、ポンプと連続的に培地を補充するように設定さチューブと培養物からスフェロイドの除去を防止しながら連続的に培地を除去するために別個の流出管を用います。媒体入口はOTの適切な機能を妨害する可能性を最小限にするために、および十分な混合を可能にするために、反応器の反対側にありました。 （高グルコース、450ミリグラム/デシリットルで）新鮮な培地は、長期安定性を確保するために、冷蔵庫の温度に維持し、継続的に栄養を補給するために3日ごとに完全な培地交換速度を有する媒体入口を介して培養物に添加しました。このシステムは、連続プロセス3,22,23と手動バッチ培地交換プロセスを置換することによって、培養期間中に必要な操作および介入を制限しました。冷たい媒体は、ティムの上に小さな容積のバイオリアクターを入力しましたそれぞれが37℃であった周囲の培地を用いて温度を平衡化するために添加した培地時の「ドロップ」を与える総培養容積（200mL）中に電子（0.046 ml /分）に対して、。これは、追加された冷たい媒体がインキュベーター内に維持されている全体的な培養温度を低下させなかったことを確実にしました。培地の攪拌はまた、熱伝達効率を増加させ、そしてこれらの培養物の温度の均一性を向上させます。超高送り速度が小さい培養容量で使用されたが、これらの可能性は低いの条件がこれらの研究のために試験されなかった場合は温度維持が問題になる可能性があります。培養容量は、平均媒体除去速度は供給速度に等しいことを保証することにより、連続供給方式で一定に維持しました。除去管部は、ポンプ部のための大きな直径のチューブを使用するため、これらの研究のために使用されるシステムは、実際の送り速度よりも高い流量で媒体を除去しました。速くレモにもかかわらず、ヴァル率は、培養液量は、所望の培養容量レベルに反応器の内部に流出管のレベルを調節することによって維持しました。連続SSBに新鮮な培地を添加して反応器内の中間レベルのわずかな増加をもたらし、そして媒体がOTのレベルに達したとき、培地を速い速度で反応器から除去しました。中レベルは、OTの最下部より下に下がるまで培地は、培養中の細胞スフェロイドを残して、多孔質ガラスOTを通して除去しました。このシステムは、ポンプ速度を制御するために、希薄な流れとボリュームのセンサーを使用しての複雑さを回避し、そして多くのSSBベースの培養装置47,48で使用するための規格です。線流速ことを確実にするために - OTはスフェロイドが除去回路を介して培養物から除去されなかったことを確認するために設計されており、フリットガラス管の孔の大きさと密度が十分な大きさであった（それぞれ60μmの40％および40）しました。スフェロイド私たちの沈降速度よりも少なかったですこれらの培養研究のために編。詳細3に記載のように直線流を算出しました。 OTの孔を通る平均線状媒体速度0.17 cM /は分であると計算され、これは最も遅い観測スフェロイドの沈降速度よりもはるかに遅くしました。平均沈降速度は、方法7に記載したように測定し、これらの試験で使用したスフェロイドのための2.53±0.26 cM /は分でした。スフェロイド培養の進行に伴ってサイズが増加することが観察され、これらのより大きなスフェロイドは、さらにOTを通じて除去の可能性を減少させ、その増加した質量ドラッグ比、ため高速決済されました。一部のスフェロイドは、OTの外側のエッジに下孔内に閉じ込められていたが、流出管を撹拌媒体中に浸漬するとき、これは機械的な衝突に主によるものでした。これは、OTの適切な機能を防ぐことはできませんでしたし、テストした培養物中のスフェロイドの測定可能な損失に寄与しませんでした。これらの研究のためのOTは（、各試験後に洗浄しました。DI水フラッシュを含む）、および機能低下のリスクを回避するために、2つの培養研究のために使用後に交換。スフェロイドは、特定の研究（これは提示作業では観察されなかった）時の毛穴を詰まらせることが観察される場合OTは、すべての研究の後に置き換えることができます。これ方法を用いて培地の循環除去に、培地の体積は同じくらい6％も変動します。変動は平均中レベルは、OTの最下部より下に落ちた後、OTはもう少し培地を除去するために許可された媒体の表面張力によって引き起こされました。 養分変動にSSB培養における改善された細胞の成長を排除 連続標準SSB培養物と比較して21日間の培養期間中に増加し、培養収率上述したシステムを用いてSSB培養培地を交換します。供給速度は、全培養voluを置き換える速度で、培養期間を通じて一定に維持しました。私バッチ供給型SSB培養に匹敵するために3日ごと。栄養素の変動を排除することは、高グルコース濃度3にもかかわらず、細胞収量（ 図3）の増加をもたらしました。スフェロイドサイズも2D微視的評価（文献3に記載されている標準的な光学顕微鏡）によって培養期間の終了時に測定し、CF-SSB培養におけるスフェロイドは、静的には、（学生のt検定、p &lt;0.02）有意に大きかったましたまたは標準SSB培養文献3に報告されているように。これらの観察は、生存率に関わらず、培養条件の同一のハイレベル（96.23±0.85％）に維持しながらCF-SSB培養物においてより高い増殖速度を示唆し、細胞カウントのデータをサポートします。連続的に供給SSB（CF-SSB）培養系はスフェロイド培養物中の栄養素の変動を排除し、そして細胞の増殖速度を改善したが、血糖値はさらに、IMPを防止している可能性が超生理学的なままでした<html>細胞増殖におけるrovement（ 図2）。さらにCF-SSB培養系を改良するために、アルゴリズムは、SSBの培養物中のグルコースレベルの制御を改善する目的で、培養期間中の供給速度を調整するために使用しました。 調整後送り速度の計算 いくつかの要因は、一貫したグルコースレベルを維持するために、送り速度を計算するために考慮することができます。関心のある特定の要因が、所与の研究のために、特定の細胞株のために変更することができます。このデモンストレーションの目的のために、我々は、成長速度と以前の培養物から決定し、グルコース消費、並びに調整3時の実際のグルコースレベルを検討しました。送り速度の調整は、時間内の任意の間隔で行うことができます。このデモンストレーションのために、サンプルを収集し、供給速度は、以下のように記述さ逐次計算に基づいて3日ごとに調整しました。 予測成長率のトン&quot;&gt; 計算 式1は、将来のある時点で、培養物中の細胞の予想される数を表す予測細胞数（N 2）を用いて、培養物の一定期間の間に細胞の成長を予測します。この方法は、線形成長率の近似値を使用する現在のセル数（N 1）は、培養期間（T 2 -T 1）を乗じたスフェロイド培養物中の細胞の推定成長速度（R gの）に添加されます。 <img alt="式（1）" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52224/52224eq1.jpg" /> （1） 計算されたベースラインの送り速度 ベースラインの送り速度（R F）は （C Fを培養期間（分子）の間培養で消費グルコースを推定し、流加培地のグルコース濃度で割って、式2を用いて計算しました。 </sub&gt;の、分母）。消費されたグルコースは、この消費速度は、次いで、グルコース濃度（C F）で割った式1からN 1およびN 2の加重平均することにより所定の細胞型（R 1）が予め定めグルコース消費速度を乗算することによって推定されますフィード培地で同じ培養期間中に消費されたグルコースを交換するのに必要な平均媒体送り速度を算出します。 <img alt="式（2）" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52224/52224eq2.jpg" /> （2） 観測されたグルコースレベルで送り速度を調整します さらなる調整はレベルを維持するために使用することができ、式3このグルコース調節供給速度（GAFR）を使用して選択された時点で測定されたグルコース濃度（C 1）を収容するために、ベースラインの送り速度に行われたときに増殖または死を予期しない変更文化の中で発生します。このequatio<html> nは、制御定数（X）に組み込まれ、0.5の値は、これらのデータ3のために使用しました。 C 1は、サンプルの日に培地中で測定されたグルコース濃度を表し、C Dは、対象媒体のグルコース濃度を表します。最終的な値は、第2の演算から予測送り速度を調整します。 <img alt="式3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52224/52224eq3.jpg" /> （3） <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52224/52224fig1.jpg" /> 図1：流出チューブによる連続供給システムダイアグラム。培地は、細胞の損失なしに培養物から除去することができるように、流出管上に配置された（A）実証システムの図である。（B）フリットガラスフィルター。図は、許可を得て複製。3 /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg &quot;/&gt; 図2：SSB、CF-SSB、および調整後CF-SSB文化のためのグルコース測定 （A）中のグルコース測定β-TC6スフェロイド培養物から、静的SSB、およびCF-SSB培養法を使用し、標準的な高グルコース培地で給餌。連続供給は、グルコース変動を排除することができるが、培地の培養期間中に劇的に変化し、（灰色の棒で示される）の生理学的範囲より遠くの平均グルコースレベル。調整された供給は変動をなくすだけでなく、培養期間の持続時間生理学的レベル近くにグルコース濃度を維持することができます。グルコース測定用のエラーバーは、（すべての測定のための≤4％標準エラー）に示すスケール上に表示さには小さすぎます。図面からのデータは、許可を得て、以前の刊行物に提示されている。3 図3：成長調整送り速度とSSB、CF-SSBからの細胞数、および調整CF-SSB培養細胞増殖が一定の供給速度に対する定期的な培地交換でSSBを比較した21日間の培養期間中の細胞数の倍の変化として報告しました。 SSBの文化や調整後の送り速度SSB培養。エラーバーは平均の標準誤差を報告し、報告されたp値は、非対になった2尾の学生トン統計検定のためのものです。許可を得て複製。3

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Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K ビュー.  University of Minnesota. Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

ビデオ: Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

生物工学

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

外科用回収、単離と<em&gt;インビトロ</em&gt;組織工学アプリケーションのためのヒト前十字靭帯由来細胞の拡大

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

使い捨て空気圧バイオリアクターシステムを使用して、哺乳動物細胞の培養

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...