The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.

The authors have nothing to disclose.

Erzeugen von Säugerzellprodukten für die Herstellung von biologischen Wirkstoffen und für die Zelltherapie erfordert die Kultur und Überwachung von Säugetierzellen in großem Maßstab 55-58. Außerdem rufen diese Anwendungen für die Kulturbedingungen definiert und validiert. Erhöhung einfach das Volumen der Zellen Forschungstechnologien werden alle diese Anforderungen nicht erfüllen. Manuelle Medium Änderungen Schwankungen an Nährstoffen und Anhäufung von Abfallprodukten reduzieren Zellqualität, Rentabilität und Ertrag zu verursachen. Die Verwendung von Bioreaktoren für die kommerzielle Kultur von Mikroorganismen für die bio-pharmazeutische Anwendungen gut etabliert, und ähnliche Strategien auf Säugetierzellkulturen angewendet worden. Das komplexe Zusammenspiel von Säugerzellen mit ihrer Umgebung erfordert spezifische Modifikationen Nährstoffmengen zu regulieren, um Zellexpansionspotenzial zu optimieren. Um diese Probleme anzugehen, haben wir ein straightforward Verfahren Glukosespiegel in einem bestimmten Zielbereich annähert, physiologische Werte in einer gerührten Suspension Bioreaktor mit einer einstellbaren Geschwindigkeit Perfusions-Zuführungsmechanismus zu halten. Um dies zu erreichen, Sphäroide einer Beta-Zelllinie wurden in einer gerührten Suspension Bioreaktor erzeugt. Ein Perfusion Fütterungssystem wurde eine kontinuierliche Fördermechanismus zu ersetzen Standard-Batch-Fütterungsverfahren zur Verfügung zu stellen eingesetzt. Zellwachstumsraten beobachtet wurden, und verwendet ungefähre Glukose Verwendung Raten vorherzusagen. Tatsächlichen Glukosespiegel wurden ebenfalls über die Zeit in der Kultur gemessen Vorschübe in Reaktion auf die tatsächlichen Nährstoffe verbraucht und Stoffwechselprodukte abgelagert in dem Medium von den Zellen einzustellen. Dieses Verfahren verhindert die Schwankungen der Glucosespiegel mit anderen statischen und SSB - Systemen gesehen 3 , in dem Glukosespiegel mit Mediumwechsel alle 3 Tage dramatisch schwanken. Mit Hilfe der Batch-Fütterungsstrategien sank Glukosekonzentrationen so viel wie 275 mg / dl über drei Tage, im späten Stadiums im 21-Tage-Expansion. Diese Schwankungen der Glucosespiegel begrenzt Zellausbeute. Berechnung des Mediums Ersatzrate für Demonstrations des angepassten Zuführsystem eine etablierte Wachstumsrate und Glucoseverbrauchsrate für die Zelllinie, sowie die beobachteten (gemessenen) Kulturdichten und Glukosespiegel bei jeder Fütterungszeitpunkt aufgenommen. Für verschiedene Zelltypen oder für komplexere Gewebekultursystemen können diese Annahmen nicht zutreffen. Um sicherzustellen, genauere Glukosekontrolle umfasste der Algorithmus auch ein Rückkopplungssteuersystem zur Berücksichtigung der Variabilität der einzelnen Kulturen. Einschränkungen eines Perfusionsmethode auf die Wachstumsrate basiert allein, einschließlich der Auswirkungen der Heterogenität in Glucoseverwertung für Zellen in den Sphäroiden und Veränderungen der Glucoseverbrauch basierend auf Parametern wie beispielsweise Differenzierung Stammzellen, kann durch ein Rückkopplungssteuersystem gemildert werden. Je nach Anwendung können Zellen, die Expone aufweisenntial Wachstumsraten oder komplexere Wachstumsprofile könnte den Algorithmus zur Verbesserung der Leistung realisiert werden. Die Annahmen und Werte für die Vorschubratenberechnungen verwendet werden, können die tatsächlichen Kulturbedingungen einzuhalten verändert werden. Die vorgestellten Verfahren sollen Zellen für eine therapeutische Anwendung zu erzeugen, in dem die Expansion und die Kultur von Sphäroiden für eine endliche Dauer sein würde und die Zellen selbst das Produkt sind .. kann es wünschenswert sein, für einige Forscher kontinuierlich erweitern oder Kulturzellen unter Verwendung von ein ähnliches Verfahren, aber dies würde andere Herausforderungen stellen nicht für diese Studien festgestellt. Wenn über längere Zeit kultiviert, würde weiterhin die Sphäroide in der Größe zu wachsen, und die Lebensfähigkeit einiger Zellen im Kern des Sphäroids kann aufgrund der zunehmenden Nährstoff- und Sauerstoffdiffusionsbeschränkungen leiden. Diese Kulturen können weitere Manipulationen erfordern große Sphäroide zu dissoziieren diese Begrenzung zu verhindern, wenn Langzeitkulturen erwünscht sind.Keine Abnahme der Lebensfähigkeit wurde für Sphäroide erzeugt mit diesem Protokoll beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Grenze nicht während der 21-tägigen Züchtungsperiode dieser Studie erreicht wurde. Für zelluläre Therapien könnten diese Techniken in Kombination mit zusätzlichen Regelungssystemen verwendet werden, um Zellausbeute, die Funktion und Lebensfähigkeit zu verbessern. Beispielsweise könnte die SSB-Verfahren mit Erleichtern Technologien einschließlich Mikroträgeroberflächenkulturen für adhärente Zellen kombiniert werden, um Zellwachstumsraten zu verbessern oder Verkapselung von Zellen oder Sphäroiden. Ferner könnte komplexere Regelalgorithmen straffer Kultur Steuerung zu schaffen umgesetzt werden. Einspeisen Anpassung könnte mit der Steuerung von mehreren anderen Parametern kombiniert werden, wie beispielsweise pH - Wert, Konzentration an gelöstem Sauerstoff, der Temperatur und Einspritzen von Reagenzien weitere Verbesserungen 59,60 zu machen. Auf die Ergebnisse in anderen Anwendungen zu verbessern, kann dieses Verfahren automatisiert werden 15,24 und Vorschübe m berechnet werden kann ,Erz oder weniger oft, weitere Verfeinerung Kulturbedingungen. Fertigungsverfahren von 61 bis 63 definiert sein und sorgfältig , um reproduzierbare biologische Produkte kontrolliert. Die Verwendung von kontinuierlichen Mediums Ersatz verwendet werden Schwankungen in großem Maßstab Zellproduktion beobachtet kritische Nährstoffe zu mildern, und eine einstellbare Zufuhrsystem enthalten, können noch mehr Kontrolle über die Zellumgebung zu implementieren, um die gewünschten Nährstoffniveaus aufrechtzuerhalten. Das beschriebene Verfahren kann mit anderen Säugetierzellen sowohl für zellulare und pharmazeutischen Produkten verwendet werden.

Um eine große Zahl von lebensfähigen und funktionellen humanen Zellen für eine Transplantation zu erzeugen, die Regulierung der Kulturbedingungen ist zwingend notwendig. Depletion von Nährstoffen sowie Anhäufung von Stoffwechselschlacken sind die Hauptursachen von Seneszenz und metabolischen Veränderungen, die die Qualität des Zellprodukt 1 reduzieren - 3. Dieses Verfahren veranschaulicht ein Verfahren zur Kultur von Säugerzellen in Sphäroide einen gerührten Bioreaktor mit einer eingestellten Rate Perfusion Zuführsystem Glukose zu regulieren in einem physiologischen Bereich 4 während der gesamten Dauer der Kultur kombiniert werden. Für den Zweck dieser Studien wurde die physiologischen Bereich zwischen 100 und 200 mg / dl definiert. Die gleichen Verfahren können verwendet werden, um andere Nährstoffe und Stoffwechselschlacken regulieren wie Lactat. Statische Kulturen in kleinen Mengen (1 bis 30 ml) werden typischerweise in der Laborumgebung verwendet zu erhalten und Zelllinien für Experime differenzierenntal Zwecke. Zell Passagierung wird mit vollständigem Medium Änderungen durchgeführt, wie in regelmäßigen Abständen erforderlich. Die meisten &quot;konventionellen&quot; Kulturmedium hat eine hohe Glukosekonzentration (450 mg / dl für DMEM in diesen Studien verwendet) für weniger häufigen Medienwechsel, ohne das Risiko von Nährstoffbegrenzungen zu ermöglichen. Allerdings ist diese batch-Einspeisung Verfahren erfordert noch häufige Manipulation führt Variabilität in der Zellumgebung und erhöht das Risiko einer Kontamination von 5 bis 9. Gerührte Suspension Bioreaktoren (SSB) eine bessere Durchmischung sorgen und verringerte 3,10 Handhabung - 20, aber wie statische Kulturen, erfordern eine manuelle Medium Änderungen, die potenziell schädlichen Schwankungen Nährstoff- und Abfallprodukt Niveaus beitragen. Perfusions-Fütterung von SSB Kulturen reduziert diese Probleme durch eine kontinuierliche Infusion und Entfernung von Medium, aber große Veränderungen in der Nährstoffgehalt aufgrund des Zellwachstums bleiben ein Problem. Die Verwendung einer angepassten Fütterung rate aus Berechnungen der Nährstoffnutzung auf Basis der geschätzten Zell Anforderungen können die stabilen Zellumgebung bieten erforderlich die Lebensfähigkeit der Zellen zu optimieren und Funktion 21-24. Es gibt eine große Menge an Literatur beschreibt Methoden für skalierbare SSB Kulturen von Säugetierzellen spezifisch für Kultur und Expansion von pluripotenten Zellen 25 - 32, mit anderen auf Insel konzentriert (beta) Zellen 17,33,34, oder die Produktion von biologischen Produkten 24, 35-38. Viele dieser untersuchten Zelltypen können in Sphäroid-Kulturen und spezifische Verfahren für den Zelltyp sollte die Implementierung einer kontinuierlichen Zuführungssystem vor optimiert werden verwendet wird gezüchtet werden. In dieser Demonstration wurde eine Perfusion Fütterungsmethode verwendet , um eine Beta - Zelllinie als Sphäroiden in einem gerührten Bioreaktor 39 gewachsen zu erweitern - 43. Das hier beschriebene Verfahren stellt eineinfache Implementierung Kursanpassungen der Fütterung auf Basis von Messungen off-line Glucose gezielte Kulturbedingungen zu erreichen. Einstellen der Vorschubgeschwindigkeit mit dieser Methode eine physiologische Zuckerspiegel aufrecht zu erhalten ist zu einem Anstieg Zellausbeuten gezeigt. Säugerzellen sind abhängig von einem Schlüsselnährstoff, Glukose, für die Energieproduktion, so dass die Verwendung dieser Zelllinie stellt ein Modell für viele kultivierten Säugetierzellen 44. Darüber hinaus beispielhaft für diese Linie die weitere Komplexität der Beta - Zellen, die Glukose zu chronisch hohen Niveaus von 45 empfindlich sind. Für diese Studie wurden β-TC6 Zellen erlaubt Sphäroide in der Kultur zu bilden , die durchschnittliche Größe der Langerhans&#39;schen Inseln in vivo zu approximieren. Die Perfusionsbioreaktorsystem System 17 - 19,21,46 mit einer Vorschubgeschwindigkeit eingestellt Verbrauch zu Glukose, führte zu physiologischen Bedingungen zu erhalten und höhere Zellausbeuten ohne Veränderungen der Lebensfähigkeit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:249px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number / Link</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BTC-6 Cells</td>
			<td style="width:249px;">ATCC, Manassas, VA</td>
			<td style="width:153px;">CRL-11506</td>
			<td>Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DPBS No CA, No Mg</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">14190-144</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>See below for product numbers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMEM High Glucose (500mM)</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>11965-092</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMEM Low Glucose (100mM)</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>11885-084</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyruvate)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">L-gultamine</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">25030081</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">11360070</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Heat Inactivated Porcine Serum</td>
			<td style="width:249px;">Gibco - Life Technologies</td>
			<td style="width:153px;">10082147</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:153px;">25200056</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">T-150 Tissue Culture Treated Flasks</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">430825</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)&amp;categoryname=">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) 
			&#38;categoryname=</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuAire Cell culture incubator</td>
			<td style="width:249px;">Princeton, MN</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Refrigerator</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1L Glass Bottle</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">1395-1L</td>
			<td>Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) 
			&#38;categoryname=</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">2L Glass Bottle</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">1395-2L</td>
			<td>Any vendor could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">250 ml stirred bioreactors&#160;</td>
			<td style="width:249px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:153px;">4500-250</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)&amp;categoryname=">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) 
			&#38;categoryname=</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stir Plate</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">11-496-104A</td>
			<td>Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tissue Culture Dishes 100mm Diameter</td>
			<td style="width:249px;">Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:153px;">1256598&#160;</td>
			<td>Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">FALCON 50 ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:249px;">Falcon, San Jose, CA</td>
			<td style="width:153px;">1256598</td>
			<td>Any vendor could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Delran Plastic Used for Custom Parts</td>
			<td style="width:249px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:153px;">Various</td>
			<td>Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stainless Steel Pipe for custom lids</td>
			<td style="width:249px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:153px;">Various</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding</td>
			<td style="width:249px;">Custom made&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Not aware of any vendors producing a similar product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding</td>
			<td style="width:249px;">Custom made&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Masterflex Digital Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">EW-77919-25</td>
			<td>Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ 
			Cartridge_Pump_System_115_230 
			_VAC/EW-77919-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PVDF Tubing Connectors (various)</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">see link</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium 
			_Luer_Fittings/55889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pharmed BPT Tubing L/S 16</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">WU-06508-16</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing 
			_L_S_13_25/WU-06508-16</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pharmed BPT Tubing L/S 14</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">WU-06508-14</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing 
			_L_S_13_25/WU-06508-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pharmed BPT Tubing L/S 13</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td>
			<td style="width:153px;">WU-06508-13</td>
			<td>Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing 
			_L_S_13_25/WU-06508-13</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration)</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">SLGP033RS</td>
			<td>Any vendor could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">25ml Graduated Pipette</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">13-678-11</td>
			<td>Any vendor could be used, and various sizes may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Pipetter</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">13-681-15E</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">02-671-6</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:249px;">Gibco - Life Technologies</td>
			<td style="width:153px;">15250-061</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Inverted Light Microscope</td>
			<td style="width:249px;">Leica</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">One Touch Ultra Blood Glucose Meter</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">22-029-293&#160;</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">One Touch Ultra-Strips</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">22-029-292&#160;</td>
			<td>Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nutrient regulation by continuous feeding for large-scale expansion of mammalian cells in spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Medium Zuckerwerte und Schwankungen einschränken Zellexpansion in Standard - SSB Kulturen Die Glucosespiegel schwanken in statischen Kulturen und SSB Kulturen auf der ganzen Kulturdauer 3. Diese Schwankungen intensivieren mit zunehmender Zellzahl während der 21-tägigen Züchtungsperiode und waren fast identisch in sowohl statische als auch SSB Kulturen. Diese Beobachtungen werden in unserer früheren Veröffentlichung 3 dargestellt. Die Glucosespiegel für die Dauer der Kulturperiode für beide Methoden super-physiologischen sein. Da diese chronische Exposition Zelle 54 Wachstum hemmen kann, wurde eine kontinuierliche Fütterung System entwickelt , um Zuckerschwankungen zu beseitigen und Nährstoffkontrolle während der Sphäroid Kultur zu verbessern. Kontinuierliche Fütterungssystem für Sphäroid - Kultur Kontinuierliche Zugabe von frischem Medium und alte Medium für die Dauer der Kulturperiode zu entfernenkann unter Verwendung eines einfachen Systems Medium Nachfüllung erfolgen. Das beschriebene System in Methode 2 und in Abbildung 1 verwendet gesetzt , eine Pumpe und Schläuche gezeigt kontinuierlich Medium und einen separaten Abfluss Rohr wieder aufzufüllen , um kontinuierlich Medium zu entfernen , während die Entfernung von Sphäroiden aus der Kultur zu verhindern. Der mittlere Einlass war auf der gegenüberliegenden Seite des Reaktors mit der richtigen Funktion des OT von störenden, jede Möglichkeit zu minimieren und für eine gute Durchmischung zu ermöglichen. Frisches Medium (mit hohem Glucose, 450 mg / dl) wurde bei Kühlschranktemperatur gehalten Langzeitstabilität zu gewährleisten und kontinuierlich mit einem Vollmedium Ersatzrate zu der Kultur durch ein Medium Einlass hinzugefügt alle drei Tage die Nährstoffe nachzufüllen. Dieses System begrenzt die Manipulationen und Intervention während der Kulturperiode erforderlich durch das manuelle Batch - Medium Austauschprozess mit einem kontinuierlichen Prozess 3,22,23 ersetzen. Das kalte Medium trat in den Bioreaktor in kleinen Mengen über time (0,046 ml / min), bezogen auf die Gesamtkulturvolumen (200 ml), die jeweils &quot;drop&quot; von zugegebenem Medium Zeit, um Temperatur mit der umgebenden Kulturmedium zu äquilibrieren, die bei 37 ° C war. Dies gewährleistet, daß das zugegebene kalte Medium nicht die gesamte Kulturtemperatur reduzieren im Inkubator gehalten wurde. Rühren des Kulturmediums, auch die Wärmeübertragungseffizienz erhöht und Temperaturgleichförmigkeit in diesen Kulturen verbessert. Temperaturerhaltung könnte ein Problem sein, wenn sehr hohe Vorschubraten mit kleinen Kulturvolumina verwendet wurden, aber diese unwahrscheinlichen Bedingungen waren nicht für diese Studien getestet. Das Kulturvolumen wurde auf einem konstanten Niveau in dem kontinuierlichen Fütterungssystem aufrechterhalten, indem sichergestellt wird, dass der durchschnittliche mittlere Abtragungsrate zur Zufuhrrate entsprach. Das System für diese Studien verwendet, tatsächlich entfernt Medium bei einer höheren Strömungsgeschwindigkeit als die Vorschubgeschwindigkeit, da die Entfernung Schlauchabschnitt verwendet größeren Durchmesser Schlauch für den Pumpenabschnitt. Trotz der schnelleren removal Rate wurde das Kulturvolumen durch Anpassen des Pegels des Abflußrohr im Inneren des Reaktors auf die gewünschte Kulturvolumen Pegel gehalten. Kontinuierliche Zugabe von frischem Medium zu der SSB in einem geringen Anstieg in der mittleren Ebene in den Reaktor geführt, und wenn das Medium den Pegel des OT erreicht wurde das Medium aus dem Reaktor mit einer schnelleren Rate entfernt wird. Das Medium wurde durch das poröse Glas OT entfernt, wodurch die Zelle Sphäroiden in Kultur zu verlassen, bis das Medium Ebene unterhalb der Unterseite des OT fiel. Dieses System verhindert die Komplexität von tenuous Strömung und Volumensensoren die Pumpengeschwindigkeiten zu steuern, und ist der Standard für den Einsatz mit vielen SSB basierten Kulturapparat 47,48. Der OT wurde entwickelt, um sicherzustellen, dass Sphäroide wurden nicht aus der Kultur durch die Entfernungsschaltung entfernt, und die Porengröße und Dichte im Frittenglasrohr waren groß genug ist (40% und 40 - 60 &amp; mgr; m jeweils), um sicherzustellen, daß die lineare Strömungsgeschwindigkeit uns war geringer als die Absetzgeschwindigkeit der Sphäroideed für diese Kulturstudien. Die lineare Strömung berechnet wurde , wie im Detail 3 beschrieben. Die durchschnittliche lineare Geschwindigkeit Medium durch die Poren in der OT berechnet 0,17 cm / min, und dies war viel langsamer ist als die langsamste beobachteten Sphäroid Absetzgeschwindigkeit. Die durchschnittliche Sinkgeschwindigkeit wurde in Verfahren 7 und war 2,53 ± 0,26 cm / min für die verwendeten Sphäroiden in diesen Studien beschrieben, gemessen. Die Sphäroiden wurden beobachtet in der Größe zu erhöhen, wie die Kultur fortschreitet, und diese größeren Sphäroiden besiedelt schneller aufgrund ihrer erhöhten Masse-Widerstand-Verhältnis, die die Möglichkeit der Entnahme durch das OT weiter verringert. Einige Sphäroiden wurden in den unteren Poren an den Außenkanten des OT gefangen, aber dies war in erster Linie durch mechanische Kollision, wenn das Ablassrohr in das gerührte Medium eintaucht. Dies hinderte nicht ordnungsgemäße Funktion des OT, und nicht zu einer meßbaren Verlust von Sphäroiden in den getesteten Kulturen beitragen. Das OT für diese Studien wurde nach jeder Studie gereinigt, (mit DI-Wasserspülung), und nach der Verwendung für zwei Kulturstudien ersetzt das Risiko einer verminderten Funktion zu vermeiden. Das OT nach jeder Untersuchung durchgeführt werden könnte, wenn Sphäroide beobachtet werden während einer bestimmten Studie, die die Poren verstopfen (dies wurde in der vorliegenden Arbeit beobachtet). Aufgrund der zyklischen Entfernen des Mediums unter Verwendung dieses Verfahrens, das Medium Kulturvolumen um bis zu 6% schwankte. Die Schwankungen wurden durch die Oberflächenspannung des Mediums verursacht, dass die OT ein bisschen mehr Medium nach dem durchschnittlichen mittleren Niveau fiel unter dem Boden des OT zu entfernen erlaubt. Die Beseitigung von Nährstoffen Schwankungen Verbesserte Zellwachstum in SSB Kulturen Kontinuierlich Ersetzen des Mediums in SSB Kulturen das System unter Verwendung der oben erhöht Kulturausbeuten während der Kulturperiode von 21 Tagen beschrieben, im Vergleich zu den Standard-SSB Kulturen. Die Zufuhrrate wurde mit einer Rate konstant während des gesamten Kultivierungsperiode aufrechterhalten, die die gesamte Kultur Volu ersetztmich alle drei Tage zu sein, vergleichbar mit den Batch-fed SSB Kulturen. Eliminieren der Nährstoffschwankungen in einer Erhöhung der Zellausbeuten zur Folge (Figur 3) trotz der hohen Glucosekonzentration 3. Sphäroid Größe wurde auch am Ende der Kulturperiode von 2D - mikroskopische Beurteilung (Standard - Lichtmikroskopie in der Literatur beschrieben 3) gemessen, und die Sphäroiden in CF-SSB Kulturen waren signifikant größer (p &lt;0,02, Student-t - Test) , dass in statischen oder Standard - SSB - Kulturen wie in der Literatur 3 berichtet. Diese Beobachtungen unterstützen die Zellzahl-Daten darauf hindeutet, eine höhere Wachstumsrate in CF-SSB Kulturen, während die Lebensfähigkeit auf dem gleichen hohen Niveau (96,23 ± 0,85%), unabhängig von Kulturbedingungen gehalten wurde. Die kontinuierlich zugeführt SSB (CF-SSB) Kultursystem eliminiert die Nährstoff Schwankungen in Sphäroid-Kulturen und Zellwachstumsraten verbessert, aber die Zuckerspiegel blieb super-physiologischen die noch weiter verhindert haben kann imp<html> rovement in Zellexpansion (Abbildung 2). Weiter zu verbessern, auf der CF-SSB Kultursystem wurde ein Algorithmus verwendet, um die Vorschubgeschwindigkeit während des Kulturzeitraums mit dem Ziel der Verbesserung der Kontrolle der Glucosespiegel in SSB Kulturen anzupassen. Die Berechnung der eingestellte Vorschubgeschwindigkeit Mehrere Faktoren können für die Berechnung der Vorschubgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten konsistente Glucosespiegel berücksichtigt werden. Die spezifischen Faktoren von Interesse für eine gegebene Studie und für eine bestimmte Zelllinie verändert werden. Für den Zweck dieser Demonstration, betrachteten wir Wachstumsrate und des Glucoseverbrauchs von früheren Kulturen bestimmt, sowie die tatsächlichen Glukosespiegel zum Zeitpunkt der Einstellung 3. Vorschub Anpassungen können in beliebigen Intervallen in der Zeit gemacht werden. Für diese Demonstration wurden Proben gesammelt und die Beschickungsrate wurde alle drei Tage auf der Grundlage der sequentiellen Berechnungen beschrieben wie folgt eingestellt. t &quot;&gt; Berechnung der vorausgesagte Wachstumsrate Gleichung 1 sagt die das Zellwachstum während einer bestimmten Periode der Kultur, mit der vorhergesagten Zellzahl (N 2) , die die erwartete Gesamtzahl der Zellen in Kultur zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zukunft. Dieses Verfahren verwendet eine lineare Wachstumsrate Approximation wo die aktuelle Zellzahl (N 1) der geschätzten Wachstumsrate der Zellen in Sphäroid - Kulturen zugegeben wird (R g) multipliziert mit der Kulturperiode (t 2 -t 1). <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52224/52224eq1.jpg" /> (1) Berechnete Basis Vorschub Die Baseline - Zufuhrrate (R F) wurde unter Verwendung von Gleichung 2 berechnet , indem die Glucose in der Kultur während der Kulturperiode (Zähler) verbraucht Abschätzen und durch die Glukosekonzentration im Zufütterungsmedium (C F Dividieren </sub&gt;, Nenner). Die verbrauchte Glukose wird ermittelt , indem der zuvor ermittelten Glukoseverbrauchsrate für den bestimmten Zelltyp (R 1) durch den gewichteten Durchschnitt der N 1 und N 2 aus Gleichung 1 wurde Verbrauchsrate multipliziert wird dann durch die Glucosekonzentration geteilt (C F) im Fördermedium die durchschnittliche mittlere Vorschubgeschwindigkeit zu berechnen benötigt, um die Glukose in der gleichen Kulturperiode verbraucht zu ersetzen. <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52224/52224eq2.jpg" /> (2) Einstellen Vorschub mit Beobachtete Zuckerspiegel Weitere Anpassungen wurden an der Basislinie Vorschubgeschwindigkeit aus der gemessenen Glukosespiegel (C 1) bei der gewählten Zeitpunkt 3. kann verwendet werden , um diese Glucose-eingestellte Vorschubgeschwindigkeit (GAFR) unter Verwendung von Gleichung aufzunehmen Niveau zu halten , wenn unerwartete Veränderungen im Wachstum oder Tod auftreten, in der Kultur. Diese equatio<html> n inkorporiert eine Regelungskonstante (X), und ein Wert von 0,5 wurde für diese Daten 3 verwendet. C 1 steht für die Glukosekonzentration im Kulturmedium auf der Probe Tag gemessen, und C D den Zielmedium Glucosekonzentration. Der Endwert stellt die vorhergesagte Vorschubgeschwindigkeit von der zweiten Berechnung. <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52224/52224eq3.jpg" /> (3) <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52224/52224fig1.jpg" /> Abbildung 1: kontinuierliche Zufuhr Systemdiagramm mit Auslassrohr. (A) Schematische Darstellung des Systems gezeigt. (B) Frittenfilter Glas auf Abflußrohr gegeben , damit Medium aus der Kultur ohne Verlust von Zellen entfernt werden. Wiedergabe mit Genehmigung. 3 /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2:. Glukosemessungen für SSB, CF-SSB, und das bereinigte CF-SSB Kulturen (A) Medium Zuckermessungen aus β-TC6 Sphäroid - Kulturen unter Verwendung von statischen, SSB, und CF-SSB Kulturmethoden und mit den üblichen hohen Glucosemedium zuzuführen. Die kontinuierliche Zufuhr ist in der Lage, die Zuckerschwankungen, aber die durchschnittliche Glukosespiegel im mittleren Änderung während der Kulturperiode dramatisch zu beseitigen und die weit über dem physiologischen Bereich (von der grauen Leiste angezeigt). Die eingestellte Vorschub der Lage ist, die Schwankungen sowie Aufrechterhaltung der Glucosekonzentrationen in der Nähe von physiologischen Konzentrationen für die Dauer der Kulturperiode zu eliminieren. Die Fehlerbalken für Glukosemessungen sind zu klein, auf der Skala sichtbar gezeigt werden (Standardfehler ≤ 4% für alle Messungen). Die Daten aus den Figuren ist in früheren Veröffentlichung mit Genehmigung vorgelegt. 3 Abbildung 3: Zellzahl von SSB, CF-SSB und das bereinigte CF-SSB Kulturen mit Wachstum bereinigt Vorschubgeschwindigkeiten Zellwachstum berichtet als fache Veränderung der Zellzahl während der 21-tägigen Kulturperiode Vergleich SSB mit regelmäßigen Medium Veränderungen gegenüber konstanten Vorschubgeschwindigkeit. SSB Kulturen und eingestellte Vorschubgeschwindigkeit SSB Kulturen. Die Fehlerbalken berichten über den Standardfehler des Mittelwerts, und p-Werte berichtet sind für eine un-gekoppelten zweiseitigen Student-t statistischen Test. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung. 3

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Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K Aufrufe.  University of Minnesota. Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Serie: Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Forschung

Biotechnik

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...