We thank the Ligue contre le Cancer de C&#244;te d&#8217;Or and the Centre Georges-Fran&#231;ois Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

<ol>
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J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing.">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers.">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. 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The authors have no conflicts of interest to declare.

NGS機器や技術の普及は、がんや遺伝性疾患の研究に新たな機会を提供してきました。全ゲノムシーケンシングまたはRNA配列決定に加えて、多数の患者では、選択したgDNAシーケンスを多量の分析は、同時に診断に大きな展望を提供しています。ここでは、ミディアムスループットシークエンシングデバイス（材料/機器の表）と同時に24人の患者の11の完全な遺伝子を研究するためにネクストエラ·テクノロジーを使用して（オンデマンドで利用可能な）特定の設計を開発しました。このプロトコルは、エラーのリスクが低い患者の懸念に迅速な対応を可能にするデータの迅速な生成を可能にする。 図6に示すように、サンガー配列決定で検出されたすべての遺伝的変異はまた、トランスポザーゼベースの調製キットを用いて検出した。この方法は、特に直接分析されている複雑なインデルの変化のために、信頼性が高く、解釈が容易である。それにもかかわらず、それは重要であるマイナス鎖に位置する遺伝子のためにそれを注意することは、それが（反転なしで）ヌクレオチドを​​補完することが必要である。本研究は、11の完全な遺伝子の分析のためのデザインを用いて行ったが、プロトコルがデザインが選ばれた何でも同じですし。トランスポザーゼベースの技術は、ロングレンジPCR産物12からライブラリ調製のために使用することができる。実際、（メーカーによって開発された）アルゴリズムを設計に用いる特にこのプロトコルのために専用されている（メーカーのウェブサイトツール、材料/機器の表を参照）。技術ベースを、トランスポザーゼに加えて、ライブラリの準備の前にDNA断片化の二つの他のメカニズムも用意されています。機械的な断片化および酵素断片化。メカニカルDNA断片化は再現性があるが、超音波処理装置を必要とし、ライブラリの準備は、より安価でより時間がかかります。酵素によるDNA断片化は、多くの場合、結果として、制限酵素部位の位置に起因するDNAの捕捉のために問題を誘発する標的配列カバレッジの欠如。それにもかかわらず、DNAの断片化のための各戦略は、利点と欠点を有するが、少なくともロングレンジPCR産物の断片化13のために、非常に類似の結果を与えるようである。新しい酵素カクテルの使用は、機械的なDNAの断片化14で得られたものと同じ結果をもたらすように見えた。トランスポザーゼベースの技術は、高品質のDNA（FFPE組織から抽出したDNAには適用されません）が必要です。また、トランスポゼースの活性は、関心のある断片は、この長さより長くなければならないことを示唆し、300以上の塩基対の断片を必要とします。この特異性は、高品質、非断片化DNAの必要性を説明しています。 今までは、BRCA1およびBRCA2の遺伝子変異は、家族性乳癌および卵巣癌において研究されている。しかし、BRCA遺伝子の関与、特にBRCA2は 、今、特に膵臓15に、他の癌において、前立腺を疑われる16、および精巣癌17。 PALB2、BRCA遺伝子のパートナーの遺伝子改変はまた、膵臓癌18と関連している。また、最近の患者がBRCA突然変異を保有するように思われ、そしてより少ない程度にPALB2突然変異、PARP阻害剤19への膵臓癌の良好な応答を示した。 BRCA1、BRCA2、およびPALB2が癌の家族性リスクに関連しており、おそらく、特定の治療に対する感受性と関連しているとして、それは家族性癌のリスクのために、がん治療の応答のためのスクリーニングでスクリーニングにおけるBRCA1およびBRCA2のパートナーを模索することが重要表示されます。 これらのデータから、DNA切断修復関連遺伝子の解析は、感受性のスクリーニングのためだけでなく、治療応答の推定上のインジケータのためにも重要であると思われる。また、完全な遺伝子分析は、COVができ、このプロトコルが提案例えばプロモーターにおける突然変異、スプライシング部位またはイントロン内に位置する調節スプライシング部位として先天的に存在する（および癌細胞に存在する）可能性がえー全ての変更、。現在までに、遺伝子の非コード配列の改変は、深さに研究されていないが、ゲノムワイド関連研究の開発は、これらの配列の重要な機能を強調できた。 結論として、本論文で開発されたトランスポザーゼベースのデザインは、DNA損傷修復に関与するがん感受性遺伝子における遺伝的異常を探索する興味深い方法である。 24人の患者のための11の完全な遺伝子配列を決定する可能性を同時にスクリーニングのための非常に困難な技術であるサンガー配列決定法に比べて重要な利点である。

2010年にはほぼ150万人（基本的に女性は）世界的に乳癌を開発しました。なお、これらの症例の5〜10％が遺伝性であったと推定される。ほぼ20年前、BRCA1およびBRCA2は 、遺伝性乳癌および卵巣癌1に関わると同定された。約15年前から、BRCA1およびBRCA2コード領域は、乳癌および卵巣癌の遺伝的素因を決定するために配列決定されている。 BRCA1およびBRCA2の変化は、これらの領域の分析は、効果的なスクリーニングのために十分ではないことを示唆して選択された家族2 10〜20％で検出される。最近では、BRCA1およびBRCA2の非コード配列（プロモーター、イントロン、3 - &#39;UTR）の分析は、新たな変異/バリエーションが乳癌3-6のリスクが高いにリンクすることができることを強調した。 BRCA1およびBRCA2タンパク質は、相同組換え修復に関与している（多数のパートナー企業7によって完成さHHR）。 BRCA1またはBRCA2の変化は、DNA修復における欠陥を誘発するが、他のパートナーはまた、乳癌のリスクに影響を及ぼし得る。この仮説はBRIP1 8以来確認されているように見えるとPALB2 9は、それぞれ、子宮頸および乳癌に対する実績のある影響を与えます。さらに、2つの他の「中程度リスク」乳癌感受性遺伝子、ATMおよびCHEK2は 、また、日常的に10研究することができる。 これらの研究に続いて、私たちは非常に簡単で、比較的を用いて同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAP80、およびTP53）を分析するためのプロトコルを開発することを決定中スループットデバイス上の濃縮およびシーケンシングとトランスポザーゼ技術に基づく高速プロトコル。感謝この技術は、2,500塩基対のイントロン領域をカバーされなかったRAP80、（：176,381,588-176,390,180 Chr5）を除いて、3&#39;-UTRの端に対するプロモーターの開始から完全な遺伝子を配列決定した。これは2,734プローブを用いて研究し、約1000300塩基対の合計を表します。通常、BRCA1およびBRCA2エキソン配列は、20未満の患者について1.5カ月を必要とするサンガー配列決定によって分析される。現在のプロトコル（ 図1）を使用すると、同じ時間で、75以上の患者のための11の完全な遺伝子を解析することができた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1001</td>
			<td>Sequencing/medium throughput device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera Enrichment kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-123-1208</td>
			<td>Transposase based technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 cycle cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15033624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDI 96-well plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AB0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal A</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>MSA-5001</td>
			<td>This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Provided with the sequencing device 
			Experiment Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new&#62; 
			Manufacturer website tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gdna enrichment by a transposase-based technology for ngs analysis of the whole sequence of brca1, brca2, and 9 genes involved in dna damage repair

次世代シーケンシングの普及は、癌研究および診断のための新たな道を切り拓いてきた。 NGSは巨大な癌に対する新たなデータの量、特にがんの遺伝学をもたらすでしょう。現在の知識と未来の発見は、それが必要な癌の遺​​伝的素因に関与することができる遺伝子の膨大な数を研究するようになります。この点では、DNA損傷の修復に関与する11の完全な遺伝子を研究するためにエラ·デザインを開発した。このプロトコルは、安全に、同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAD80、およびTP53）プロモーターからの3&#39;-UTRに研究するために開発されました。トランスポザーゼ技術とgDNAの濃縮に基づくこ​​のプロトコルは、多重化をサンプリングする遺伝子診断のおかげで時間の面で大きな利点を提供します。このプロトコルは、安全に、血液のgDNAと共に使用することができる。

サンプルQC結果標的遺伝子の配列を決定するためのこの方法の能力は、gDNAの品質（ 図2A）とtagmentation工程の品質に基づいている。 tagmentationが（ 図2B、上部パネル）が十分でない場合には、シークエンシングは満足できなくなります。上述したように、tagmentation精製後に、gDNAを、300塩基対の周りの断片の大部分（ 図2B、下のパネル）で1000 bpの150 bpのからのフラグメントにtagmentedする必要があります。 ライブラリー調製の最後に、ライブラリ品質がバイオアナライザーを用いてチェックされる。得られたプロファイルはtagmentation後でフラグメントの高い数字（ 図2C）とほぼ同じであるべきである。図書館品質は図1Cと同一でない場合、配列決定を実行するべきではありません。 配列決定は、上で起動されるとシーケンス装置は、クラスタリングスコアが9サイクル後利用可能で、800,000 1,100,000クラスター/MM²（ 図3A）の間であるべきである。この数値が低い場合は、配列決定は、特に読み取りの深さで、満足のいくものではありません。それが高い場合、画像は（ 図3B）ぼやけされ、全く分析がクラスタを区別することにより不可能に行われません。 実験の終了時に、それが品質スコアを確認することが重要です。上記に詳述したプロトコルに従うことによって、実行の品質スコアは、 図4に対応させていただきます。シーケンシングの品質は、Q-スコア（Q-30）で表される。実験を検証するには、配列（クラスター）の少なくとも約75％がQ-スコア優れた、または30に等しい必要があります。 配列決定の結果この実験は、憲法上の遺伝子異常を研究するために設計されました。この場合、遺伝的異常は、広報されゲノム中の50％ESENT。このため、配列決定の深さはあまり重要ではない。ここで、私たちは準備し、11の完全な遺伝子のための12人の患者を同時に2のライブラリーを配列決定した。高い配列決定深度を得るために、多重化された患者の数を減少しなければならない。 gDNAの濃縮は、プローブによって捕獲に基づいているため、濃縮が（ 図5）均質ではない。私たちのプロトコルでは、私たちは約6 Gbは150の平均被覆率を誘導する、読み込む20の最小値と330の読み取りは最大で、各塩基の読み取りが発生した。これらのリード深度は、臨床実践11におけるNGSの用途に応じている。リード·キャプチャによるgDNAの濃縮におそらく深さ、ではなく、遺伝子の主要な再構成の異質性にもかかわらず、それは、Qスコアは、このようにシーケンシングを検証し、常に30（ 図5）よりも優れていたことに注意することが重要です。 それにもかかわらず、結果を比較することにより、技術を検証することが重要であるサンガー配列決定を用いて得られたもので得られたS。サンガー配列決定（BRCA1およびBRCA2のシーケンスをコードする）およびトランスポザーゼベースの技術の両方によって配列17例では、同じ330遺伝的変異（SNP突然変異）を検出した。例として、BRCA1遺伝子に点突然変異（左図6）およびBRCA2遺伝子内の4塩基（右図6）の削除は、サンガーおよびトランスポザーゼベースの方法の両方で検出された。 BRCA1は、染色体13の逆鎖上にあるように、それは（フォワード鎖上）BRCA2のために、得られた配列を補完する必要がないのに対して、配列が得られる補体（しかし反転しない）ことが必要であることに留意することが重要である。 図5に示されるようにサンガー法にはないのに対し、NGS技術は、遺伝的変異の推定周波数を与える。また、特にインデル変動を、解釈がNGと容易であるSテクノロジー。 図6に示すように、右、インデル変動配列はフォワードが必要と挿入または削除シーケンスを解読するシーケンシングを逆スクランブル電気泳動図として表示されます。 NGS分析により、挿入または削除された配列は、直接的にこのように誤った解釈の危険性を低減する、決定される。最後に、トランスポザーゼベースの技術は、標的遺伝子をより多く分析することができた、と私たちはサンガー配列決定によってカバーされていなかった多くの新しい遺伝子変異配列が見つかった。これらの結果は、他の場所で公開されます。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig1highres.jpg" width="600" /> 図1の手順の概略ワークフロー。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ライブラリ作成の前後で、図2の品質を制御します。安全にtagmentationに使用することができgDNAのA.分光光度プロファイル。 DNA収量は260/280と260/230比率はそれぞれ、1.8及び2よりも優れている必要があり、5 ngの/μLよりも高くなければなりません。tagmented gDNAのB.フラグメント分析プロファイル。上のパネルは不十分tagmentedたgDNAを表しています。下のパネルは完全にtagmentedサンプルを示しています。準備されたライブラリのC.フラグメント分析プロファイルをちょうどシーケンシング起動する前に。フラグメントサイズはtagmentedのgDNA（B、下のパネル）と同じであるが、増幅された量となります。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &gt; <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig3highres.jpg" width="600" /> クラスタ生成を確認する。図。運転中のシーケンス装置のA.スクリーンショット。クラスタ密度は800〜1,000 K /MM²の間であるべきである。B.異なる画像は、低密度（上パネル）、高密度（下のパネル）と完璧な密度（中央パネル）に対応しています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。</a> <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig4highres.jpg" width="600" /> 図4は、Q-スコアをチェックします。実行の最後に、検証済み配列決定は、30よりも優れたQ-スコアが生成されるクラスタの少なくとも75％を持っている必要があります。JPG &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig5highres.jpg" width="600" /> 図5の表現カバレッジデータとそれに対応するQ-スコア。読み取り深度はすべてカバーされた遺伝子に沿って不均一である。それにもかかわらず、対象地域のQスコアは、常にQ-30よりも優れている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig6highres.jpg" width="600" /> サンガー配列決定をし、トランスポザーゼベースの技術を用いて得られた図6代表的な結果。サンガー配列決定を用いて観察すべての遺伝的変異をdだったトランスポザーゼベースの技術でetected。点突然変異は、解釈が容易であるのに対して、インデルの変化は、時にはサンガー法と一緒に勉強するのは非常に困難です。中スループット装置に関連するトランスポザーゼベースの技術では、インデルの変化を発見するのは簡単です。それにもかかわらず、それが（反転ではなく）を補完することが必要であることに注意することが重要である標的遺伝子のマイナス鎖（ここでは、BRCA1遺伝子 ）上に配置されたとき得られた配列。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント<em&gt; BRCA1</em&gt;<em&gt; BRCA2</em&gt;、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

12.2K ビュー.  Centre Georges-François Leclerc. gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair. 

ビデオ: gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.