We thank the Ligue contre le Cancer de C&#244;te d&#8217;Or and the Centre Georges-Fran&#231;ois Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

<ol>
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The authors have no conflicts of interest to declare.

L&#39;uso diffuso di dispositivi e tecnologie NGS ha fornito nuove opportunità nello studio dei tumori e malattie genetiche. Oltre al sequenziamento dell&#39;intero genoma o RNA sequenziamento, l&#39;analisi di una grande quantità di sequenze di gDNA selezionati in numerosi pazienti contemporaneamente offre grandi prospettive nella diagnosi. Qui, abbiamo sviluppato uno specifico progetto (disponibile su richiesta), utilizzando la tecnologia Nextera per studiare 11 geni completi in 24 pazienti contemporaneamente con un dispositivo di sequenziamento medio (Tabella dei materiali / attrezzature). Questo protocollo consente una rapida generazione di dati che consente una rapida risposta alle preoccupazioni dei pazienti a basso rischio di errore. Come illustrato in figura 6, tutte le variazioni genetiche rilevate con Sanger sequenziamento sono stati rilevati utilizzando il kit di preparazione basata trasposasi-. Questo metodo è affidabile e facile da interpretare, soprattutto per le alterazioni INDEL complessi che vengono analizzati direttamente. Tuttavia, è importantenotare che per geni localizzati nel filamento negativo, è necessario integrare (senza retromarcia) nucleotidi. Il presente lavoro è stato eseguito con un disegno per l&#39;analisi di 11 geni complete, ma il protocollo è lo stesso qualunque sia il disegno scelto. Tecnologia basata transposase-può essere utilizzato anche per la preparazione biblioteca da lungo raggio PCR prodotti 12. Infatti, l&#39;algoritmo (sviluppato dal produttore) utilizzato per la progettazione (sito web strumento di produttore, vedere la tabella dei materiali / attrezzature) è espressamente dedicato per questo protocollo. Oltre alla tecnologia trasposasi-based, altri due meccanismi di frammentazione del DNA prima della preparazione biblioteca sono disponibili anche: frammentazione meccanica e la frammentazione enzimatica. Frammentazione del DNA meccanica è riproducibile ma ha bisogno di un ultrasonicatore, e la preparazione biblioteca è più costoso e più tempo. Frammentazione del DNA enzimatica provoca spesso problemi per la cattura del DNA a causa di ubicazione dei siti di restrizione enzimi, con conseguentein una mancanza di copertura sequenza bersaglio. Tuttavia, ogni strategia di frammentazione del DNA ha vantaggi e svantaggi, ma sembra dare risultati abbastanza simili, almeno per lungo gamma di prodotti di PCR frammentazione 13. L&#39;uso di un nuovo cocktail enzimatico sembra fornire gli stessi risultati come quelli ottenuti con la frammentazione del DNA meccanico 14. Tecnologia basata trasposasi-ha bisogno di DNA di alta qualità (non applicabile per il DNA estratto da tessuti FFPE). Inoltre, l&#39;attività di trasposasi bisogno frammenti di oltre 300 pb, suggerendo che i frammenti di interesse deve essere più lungo di questa lunghezza. Questa specificità spiega la necessità di alta qualità, un-DNA frammentato. Fino ad ora, le variazioni genetiche di BRCA1 e BRCA2 sono state studiate in seno familiare e tumori ovarici. Tuttavia, il coinvolgimento dei geni BRCA, e soprattutto BRCA2, è ora sospettato di altri tipi di tumore, in particolare nel pancreas 15, della prostata16, e tumori del testicolo 17. L&#39;alterazione genetica di PALB2, un partner di geni BRCA, è anche associata a cancro del pancreas 18. Inoltre, recentemente apparso che i pazienti presentano mutazioni BRCA, e in misura minore mutazioni PALB2, ha mostrato una migliore risposta del loro cancro al pancreas agli inibitori PARP 19. Come BRCA1, BRCA2, e PALB2 sono associati con un rischio familiare di cancro, e possibilmente associati con suscettibilità a trattamenti specifici, sembra importante esplorare le BRCA1 e BRCA2 partner in screening per il rischio di cancro familiare e nello screening per la risposta al trattamento del cancro. Da questi dati, l&#39;analisi di rottura del DNA geni di riparazione correlati sembra essere importante non solo per lo screening di suscettibilità ma anche per un indicatore putativo di risposta al trattamento. Inoltre, l&#39;analisi completa del gene proposta con questo protocollo potrebbe Cover tutte le modifiche che potrebbero essere congenitamente presente (e presente nelle cellule tumorali), come le mutazioni del promotore, siti di splicing o siti di splicing regolamentari ubicati in introni. Ad oggi, alterazioni nelle sequenze di geni non codificanti non sono stati studiati a fondo, ma lo sviluppo di studi di associazione sull&#39;intero genoma potrebbero evidenziare importanti funzioni di queste sequenze. In conclusione, il design basato trasposasi sviluppato in questo lavoro è un modo interessante per esplorare anomalie genetiche nei geni di suscettibilità cancro coinvolti nella riparazione del danno al DNA. La possibilità di sequenziare 11 geni completi per 24 pazienti è simultaneamente un vantaggio importante rispetto al metodo di sequenziamento Sanger, che è una tecnica molto difficile per lo screening.

Nel 2010, quasi 1,5 milioni di persone (essenzialmente donne) hanno sviluppato il cancro al seno in tutto il mondo. Si stima che dal 5 al 10% di questi casi erano ereditarie. Quasi 20 anni fa, BRCA1 e BRCA2 sono stati identificati come coinvolti in seno ereditario e tumori ovarici 1. Da circa 15 anni fa, BRCA1 e BRCA2 regioni codificanti sono stati sequenziati per determinare la predisposizione genetica al cancro della mammella e dell&#39;ovaio. Alterazioni in BRCA1 e BRCA2 sono rilevati in 10 al 20% delle famiglie selezionate 2 suggeriscono che l&#39;analisi di queste regioni non è sufficiente per lo screening efficace. Recentemente, l&#39;analisi di sequenze non codificanti (introni, promotore, 3-&#39;UTR) di BRCA1 e BRCA2 ha sottolineato che le nuove mutazioni / varianti potrebbero essere collegati ad un più elevato rischio di cancro al seno 3-6. Proteine ​​BRCA1 e BRCA2 sono coinvolti nella ricombinazione omologa Repair (HHR), che è completato da numerosi partner 7. Mentre le alterazioni in BRCA1 o BRCA2 indurre difetti nella riparazione del DNA, gli altri partner possono anche influenzare il rischio di cancro al seno. Questa ipotesi sembra essere stato convalidato dal BRIP1 8 e 9 PALB2 avere un impatto provato sul cancro del collo dell&#39;utero e della mammella, rispettivamente. Inoltre, due altri geni di suscettibilità &quot;rischio moderato&quot; cancro al seno, ATM e CHEK2, possono anche essere studiati sistematicamente 10. A seguito di questi studi, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo per l&#39;analisi di 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, rad50, RAD51C, RAP80, e TP53) in 24 pazienti simultaneamente utilizzando un programma molto semplice e relativamente protocollo veloce basato sulla tecnologia trasposasi, con l&#39;arricchimento e il sequenziamento su un dispositivo di throughput medio. Graziea questa tecnica, abbiamo sequenziato i geni completi dall&#39;inizio del promotore al fine di 3&#39;-UTR, tranne RAP80, per cui una regione intronic di 2.500 bp non era coperto (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Questo rappresenta un totale di circa 1.000.300 bp studiato con 2.734 sonde. Di solito, BRCA1 e BRCA2 sequenze exonic vengono analizzati da Sanger sequenziamento, che ha bisogno di 1,5 mesi per meno di 20 pazienti. Con la presente protocollo (Figura 1), nello stesso tempo, 11 geni completi per più di 75 pazienti potrebbero essere analizzati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1001</td>
			<td>Sequencing/medium throughput device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera Enrichment kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-123-1208</td>
			<td>Transposase based technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 cycle cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15033624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDI 96-well plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AB0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal A</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>MSA-5001</td>
			<td>This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Provided with the sequencing device 
			Experiment Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new&#62; 
			Manufacturer website tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gdna enrichment by a transposase-based technology for ngs analysis of the whole sequence of brca1, brca2, and 9 genes involved in dna damage repair

L&#39;uso diffuso di Next Generation Sequencing ha aperto nuove strade per la ricerca sul cancro e la diagnosi. NGS porterà enormi quantità di nuovi dati sul cancro, e soprattutto la genetica del cancro. Le conoscenze attuali e future scoperte renderà necessario studiare un gran numero di geni che potrebbero essere coinvolti in una predisposizione genetica al cancro. A questo proposito, abbiamo sviluppato un progetto Nextera per studiare 11 geni completi coinvolti nella riparazione del DNA danni. Questo protocollo è stato sviluppato per studiare in modo sicuro 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, e TP53) dal promotore a 3&#39;-UTR in 24 pazienti contemporaneamente. Questo protocollo, basato sulla tecnologia trasposasi e gDNA arricchimento, dà un grande vantaggio in termini di tempo per la diagnosi genetica grazie a campione multiplexing. Questo protocollo può essere utilizzato in modo sicuro con gDNA sangue.

Risultati campione di QC La capacità di questo metodo per determinare sequenze di geni bersaglio si basa sulla qualità del gDNA (Figura 2A) e la qualità del passo tagmentation. Se il tagmentation non è sufficiente (Figura 2B, pannello superiore), il sequenziamento non sarà soddisfacente. Come accennato in precedenza, dopo la purificazione tagmentation, il gDNA opportuno tagmented in frammenti da 150 bp a 1.000 bp con la maggior parte dei frammenti di circa 300 bp (Figura 2B, pannello inferiore). Alla fine della preparazione biblioteca, qualità libreria viene controllata utilizzando un Bioanalyser. Il profilo ottenuto dovrebbe essere circa la stessa come dopo tagmentation ma con un più elevato numero di frammenti (Figura 2C). Se la qualità di libreria non è identica alla figura 1C, sequenziamento non deve essere eseguita. Una volta che la sequenza è lanciato suil dispositivo di sequenziamento, il punteggio di clustering è disponibile dopo 9 cicli e dovrebbe essere compreso tra 800.000 e 1.100.000 cluster / mm ² (Figura 3A). Se questo numero è inferiore, il sequenziamento non sarà soddisfacente, soprattutto in profondità di lettura. Se è superiore, le immagini vengono sfocate (Figura 3B), e nessuna analisi sarà fatto per l&#39;impossibilità di differenziare i cluster. Al termine della corsa, è importante controllare il punteggio di qualità. Seguendo il protocollo di cui sopra, il punteggio di qualità della corsa sarà conforme alla figura 4. La qualità di sequenziamento è rappresentato da un Q-score (Q-30). Per convalidare l&#39;esperimento, almeno il 75% circa delle sequenze (cluster) dovrebbe avere un Q-score superiore o uguale a 30. Risultati Sequencing Questo esperimento è stato progettato per studiare le anomalie genetiche costituzionali. In questo caso, l&#39;anomalia genetica è prESENT al 50% nel genoma. A causa di questo, la profondità sequenziamento non è molto importante. Qui, abbiamo preparato e sequenziato contemporaneamente 2 biblioteche di 12 pazienti per 11 geni completi. Per ottenere elevata profondità sequenziamento, il numero di pazienti multiplex deve essere diminuita. Come gDNA arricchimento è basato sulla cattura da sonde, l&#39;arricchimento non è omogenea (Figura 5). Con il nostro protocollo, abbiamo generato circa 6 Gb di legge, inducendo una copertura media di 150 letture per ogni base, con un minimo di 20 e un massimo di 330 letture. Questi profondità di lettura sono conformi con l&#39;uso di NGS nella pratica clinica 11. Nonostante l&#39;eterogeneità della profondità di lettura, probabilmente a causa gDNA arricchimento per cattura, e non maggiore di riarrangiamento dei geni, è importante notare che la Q-score era sempre superiore a 30 (figura 5), convalidando in tal modo il sequenziamento. Tuttavia, è importante per validare la tecnologia confrontando il risultatos ottenuti con quelli ottenuti con il sequenziamento Sanger. Nei 17 pazienti sequenziati sia sequenziamento Sanger e la tecnologia basata trasposasi (sequenze di BRCA1 e BRCA2 codifica), abbiamo rilevato le stesse 330 variazioni genetiche (SNP e mutazioni). Come esempio, una mutazione puntiforme nel gene BRCA1 (Figura 6 a sinistra) e una delezione di 4 basi nel gene BRCA2 (Figura 6 destra) sono stati rilevati sia Sanger e metodi basati trasposasi-. Come BRCA1 è sul filamento opposto del cromosoma 13, è importante notare che è necessario integrare (ma non invertire) la sequenza ottenuta, mentre per BRCA2 (sul filamento in avanti), la sequenza ottenuta non ha bisogno di essere integrata . Come indicato nella figura 5, la tecnologia NGS fornisce una frequenza stimata della variazione genetica, mentre il metodo Sanger non. Inoltre, in particolare per le variazioni INDEL, l&#39;interpretazione è più facile con NGLa tecnologia S. Come mostrato in figura 6 a destra, sequenze variazione Indel appaiono come una dell&#39;elettroferogramma strapazzato che ha bisogno di avanti e indietro sequenziamento di decifrare la sequenza inserita o eliminata. Con l&#39;analisi NGS, la sequenza inserita o eliminata viene determinata direttamente, riducendo così il rischio di errori di interpretazione. Infine, la tecnologia basata trasposasi ci ha permesso di analizzare un maggior numero di geni bersaglio, e abbiamo trovato molte nuove sequenze di variazione genetica che non erano coperti da Sanger sequenziamento. Questi risultati saranno pubblicati altrove. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1 Schema del flusso di lavoro della procedura. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2. controlli di qualità prima e dopo la preparazione biblioteca. Profilo A. spettrofotometrica del gDNA che può essere utilizzato in modo sicuro per tagmentation. La resa del DNA deve essere superiore a 5 ng / ml, 260/280 e 260/230 rapporti deve essere superiore a 1,8 e 2, rispettivamente. B. Frammento profili analizzatore di tagmented gDNA. Pannello superiore rappresenta sufficientemente tagmented gDNA. Pannello inferiore mostra un campione perfettamente tagmented. C. Frammento profilo analizzatore di biblioteca preparato poco prima sequenza di lancio. Dimensione del frammento è la stessa tagmented gDNA (B, pannello inferiore), ma con un importo amplificato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &gt; <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig3highres.jpg" width="600" /> Figura generazione di cluster 3 Controllo. A. Schermata del dispositivo di sequenziamento durante la corsa. Densità di cluster deve essere compresa tra 800 e 1.000 K / mm ². B. Diverse immagini corrispondono a bassa densità (pannello superiore), ad alta densità (pannello inferiore) e la densità perfetta (pannello centrale). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4 Controllo del Q-score. Alla fine della corsa, sequenziamento convalidato dovrebbe avere almeno il 75% di cluster generati con un Q-score superiore a 30.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5 Rappresentazione di dati di copertura e il loro corrispondente Q-score. La profondità di lettura è eterogenea lungo tutto il gene coperto. Tuttavia, il Q-score delle regioni interessate è sempre superiore a Q-30. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig5large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. risultati rappresentativi ottenuti con il sequenziamento Sanger e con la tecnologia basata trasposasi-. Tutte le variazioni genetiche osservate con Sanger sequenziamento sono stati detected con la tecnologia basata trasposasi-. Considerando che mutazioni puntiformi sono facili da interpretare, alterazioni INDEL sono a volte molto difficili da studiare con il metodo Sanger. Con la tecnologia basata trasposasi-associato ad un dispositivo di throughput medio, alterazioni INDEL sono semplici da scoprire. Tuttavia, è importante notare che è necessario integrare (ma non invertire) le sequenze ottenute quando il gene bersaglio si trova sul filo meno (qui il gene BRCA1). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51902/51902fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l&#39;analisi della sequenza intera<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

Nanyang Technological University

Research

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Biology

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

12.2K Views.  Centre Georges-François Leclerc. gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair. 

Video: gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l'identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza