この作品は、デットFrieForskningsråd/ Sundhed OG SygdomからNCCRフロンティア遺伝学におけるパイロット賞、若年性糖尿病研究財団助成41-2009-775とグラント12から126875で順次資金を供給された。著者らは、動画撮影をホストするためのスパニョーリラボに感謝。

このプロトコルは、マウスE10.5から派生した膵臓オルガノイドが上皮膵臓細胞を解離した成長を目指しています。 プロトコルは、動物実験のための倫理的な承認を必要とする。 E10.5マウス胚から背膵芽の1。解剖<ol><li>ハサミで腹部を開き、胎生（E）10.5で時限妊娠マウスを犠牲に、2子宮角を削除し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、またはダルベッコで満たされた10センチメートルペトリ皿に置いて修正必須培地（DMEM）は氷上に保持。細胞播種の犠牲からの全実験は、細胞の損傷を防ぐために60〜90分間で行われる。 </li><li>小さなハサミを使用して個々の胚のセグメントに子宮を分離する。冷PBSで35ミリメートルペトリ皿に1胚を移し、上からの照明で解剖顕微鏡下でそれを視覚化する。解剖ピンセットで周囲の筋肉、脱落膜と卵黄のSAを削除Cおよび胚を公開します。背中冷たいDMEM培地に胚を置きます。胚は容易に3ミリリットルのプラスチックトランスファーピペット/スポイトを使用して転送することができる。続行する前に、同様の方法で、すべての個々の胚を分離します。 </li><li> PBS中できれいな35ミリメートルペトリ皿に胚を置きます。 <ol><li>前肢を削除するために、薄い鉗子（0.05ミリメートル幅）を使用してください。優しく脊髄領域（ 図1）からの消化管を分離するために開口部に鉗子を挿入します。オプション：より便利に、胃を参照してください下に卵黄茎下の心臓や尾部に、胚の上半身を削除するには。 </li><li>胃、肝臓と腸の位置を確認します。鉗子を使用すると、胃から小腸への消化管に分離した（ 図1）氷の上に冷たいDMEM中に入れてください。背側膵臓芽は、胃への後方（ 図1）、背側に取り付けられている。 </li><li>シミのすべての個々の消化管を隔離続行する前にLAR方法。胚が遺伝子型を決定する必要がある場合には、解剖時に尾を収集し、氷上で冷たいDMEMで24ウェルプレート中の異なるウェル内のすべての個々の消化管を保つ。 </li></ol></li><li>冷PBS中できれいな35ミリメートルペトリ皿に1消化管を配置します。今解剖顕微鏡下で背側膵臓芽を視覚化して分析する明視野で下から照明を使用しています。これらの条件はボリュームの可視化を最適化します。電解的にシャープタングステン針または20gの注射針を使用して、上皮の周り可能な限り少ない間充織（ 図1）と膵臓芽を分離します。 <ol><li> 2〜3分間冷たいディスパーゼ溶液（1.25ミリグラム/ ml）を含むペトリ皿に孤立した芽を転送します。この時点から、移動が最も便利に口の制御、フレキシブルチューブに付着した難引っ張っ50μlのガラスキャピラリーで行うことができます。代わりに、より多くのRIと芽を失うSK、適切なプラスチックのヒントを10μlの自動ピペット（ピペットマン）を使用します。 </li><li>微視的な制御の下で膵臓芽の吸引と排出を行う。バックPBS中の膵臓芽を置く。さらにガラスキャピラリー（ 図1）を使用して、針と穏やかな吸引との間葉から分離された膵臓の芽を清掃してください。 </li><li>全体間充織が除去されると、冷PBS中で膵臓芽をすすぐ。個々のウェル（冷DMEM中の10μLで満たされた60ウェルミニトレー）冷DMEM中に各芽を移す。それは組織が非常に粘着性になり、これディスパーゼで間充織を削除しないことが重要です。 </li></ol></li></ol>分散した細胞の2。メッキと文化<ol><li>洗浄に10μlのPBSで満たし60ウェルミニトレーの円錐形のウェルに難引っ張らガラスキャピラリーを持つすべての胚から解剖上皮を転送します。 <ol><li>トリプシン0.05％Aを10μlに芽を移すNDそれは4分間、37℃でインキュベートしてみましょう。 10μlのDMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）でウェルに芽を転送することによりトリプシンを不活性化する。 </li><li>ピペットプラーで引っ張ら細い毛細血管を通して吸引により細胞懸濁液を解離する。これは、細胞を解離するには、上下にピペッティングしながら、この段階で泡を避けることが重要である。膵臓オルガノイド最適に5月15日細胞の小グループから始めるため、部分的な解離（ 図1）をお勧めします。 </li></ol></li><li>個々の処理による違いを最小限にするために、エッペンドルフチュー​​ブに、いくつかの胚からの細胞をプールする。 1:3の比で冷却したマトリゲル中の細胞懸濁液を希釈する。分量この混合物を96ウェルプレートに、8μL/ウェルまたは画像化のために最適化されたプレート（下記参照）。 </li><li>マトリゲル増粘させること、5分間37℃でプレートをインキュベートする。 タブを参照して、選択（オルガノイドや球の培地を70μlの井戸を埋めるレ1および2）、37℃、5％CO 2及び95％空気を含む加湿環境ではあり</li><li>すべての4 日目の媒体を交換してください。毎日成長している膵臓コロニーを監視し、画像化してプロセスを文書化します。 </li><li> 28先に報告されたように関心対象の小分子またはタンパク質は、干渉実験のために、この段階で培地に添加することができる。 </li></ol> 表1：オルガノイドミディアム。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>素材の名前</td><td>ストック濃度</td><td>最終的な培地中の濃度</td><td>株式のボリューム</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100パーセント</td><td> 1％ </td><td> 50μL </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替（サプリメント） </td><td> 100パーセント</td><td> 10パーセント</td><td> 500μL </td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td> 14.3 M </TD&gt; <td> 0.1 mMの</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>ホルボールミリステートアセテート（PMA） </td><td> 16μM </td><td> 16 nMの</td><td> 5μL </td></tr><tr><td> Y-27632（ROCK阻害剤） </td><td> 50 mMの</td><td> 10μMの</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50μg/ mlの</td><td> 25 ng / mlの</td><td> 2.5μL </td></tr><tr><td>組換えヒトR-スポンジン1 </td><td> 250μg/ mlの</td><td> 500 ng / mlの</td><td> 10μL </td></tr><tr><td> - または - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組み換えマウスR-スポンジン1 </td><td> 250μg/ mlの</td><td> 500 ng / mlの</td><td> 10μL </td></tr><tr><td>組換えヒトFGF1（aFGFを） </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 25μg/ mlの</td><td> 1.25μL </td></tr><tr><td>ヘパリン（Liquemin） </td><td> 2500 U / mlの</td><td> 2.5 U / mlの</td><td> 2μL </td></tr><tr><td>推奨遺伝子組換え型のヒトFGF10 </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 100 ng / mlの</td><td> 5μL </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25μL </td></tr><tr><td>合計</td><td></td><td></td><td> 5000μL </td></tr></tbody></table> 表2：スフィア媒体。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>素材の名前</td><td>ストック濃度</td><td>最終的な培地中の濃度</td><td>株式のボリューム</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100パーセント</td><td> 1％ </td><td> 50μL </td></tr><tr><td> B27のX50（サプリメント） </td><td> 100パーセント</td><td> 10パーセント</td><td> 100μL </td></tr><tr><td>組換えヒトFGF2（bFGFを） </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 64 ng / mlの</td><td> 3.2μL </td></tr><tr><td> Y-27632（ROCK阻害剤） </td><td> 50 mMの</td><td> 10μMの</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845.8μL </td></tr><tr><td>合計</td><td></td><td></td><td> 5000μL </td></tr></tbody></table>オルガノイド開発の進行の3。イメージング<ol><li>画像オルガノイドどちら毎日または時間経過顕微鏡による蛍光タイムラプス顕微鏡を使用。タイムラプスイメージングのため、XY（Z）自動化された倒立蛍光顕微鏡を使用しています。 </li><li> 4ウェルプレートまたは2〜5ミリリットル培地を充填したガラス底プレート中3μLの預金小滴。 10倍の長距離目的としたイメージ。注：蛍光トレーサーを発現するトランスジェニックマウスを使用することができる。例えば、映画1は、PDX1のNgn3-ER TM-IRES-nGFP +マウス4からオルガノイドの初期膨張。核GFPは、個々のオブジェクトが、同様の原理は、膜の蛍光を有する細胞を追跡するために適用することができるように、細胞を追跡することを可能にするMT / Mg系マウス29など。 </li><li>フォーカスドリフトを回避し、手動で定義されている位置で、3日以上1画像/時を取るために自動化を制御するソフトウェアを設定するために細胞を播種した後タイムラプスイメージングの3時間後に開始します。全ての位置については、蛍光マーカーの発現を報告し、微分干渉コントラスト（DIC）画像ならびにGFP信号を取得する。 </li></ol>組織学のためオルガノイドの4。回収<ol><li>氷上で96ウェルプレートを置き、氷冷PBSで置き換え、培地を除去。これは部分的にマトリゲルを解重合する。 </li><li>優しくアーキテクチャ全体を混乱させないために千μLチップを使用して、周囲のマトリゲルを除去し、個々のオルガノイドを吸引する。氷冷PBSでウェルに各オルガノイドを転送します。氷の上にプレートを保管してください。マトリゲル内直接固定することも可能である。 </li><li> 、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で15分間オルガノイドを修正しました。ショ糖でそれを冷凍保存し、ゼラチンに埋め込む。それぞれを処理前述したように凍結切片および組織学のための組織体（ヨハンソンら 、2007）4。 </li></ol> PCRおよび生化学用オルガノイドの5。回復<ol><li>氷上で96ウェルプレートを配置し、培地を除去。細胞のRNAを安定化し、保護するために、ウェル当たりのRNAlater 60を添加する。 </li><li>部分的に氷の上で解重合することにより、各ウェル内でゲルを機械的に破壊する。全体的なアーキテクチャを混乱させるか、200μlの先端を機械的にゲルを破壊することによって（マトリゲルで）全体をよく回復しないために、千μLチップを使用して個々のオルガノイドを回復のどちらか。 RNA分解酵素フリー非粘着性エッペンドルフチュー​​ブに入ってもコンテンツを転送するために千μlのチップを使用して、氷上に保持。 </li><li> 60μLのRNAlaterでウェルを洗浄し、同じエッペンドルフチュー​​ブに残りのコンテンツを追加します。 </li><li> 4℃で500〜1,000×gで5分間チューブをスピン</li><li> 20〜30μLを残して上清を取り除き一緒にペレットとチューブ内のRNAlater。生化学のために、可能な限りドライサンプルを格納。 </li><li>すぐにRNAlater中でサンプルを凍結しないでください。 4℃のCO / Nにおけるストア（RNAlaterで徹底的に組織を貫通できるようにする）。組織は、長期保存のために-20℃で保存することができ、後に組織破壊及びRNAの少量の抽出のために処理することができる。 </li></ol>

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	<li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+functional+beta-cell.">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li><li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme.">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li><li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types.">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li><li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells.">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development.">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979 (2012).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+interrogation+of+stem+cells.">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li><li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS.">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation.">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

インビトロにおける機能的β細胞の大規模生産は依然として1無効である。このような厳しい状況では、発生生物学の研究で​​は、機能的なβ細胞の分化に必要とされる正確な信号を解読するに役立つことがあります。このプロトコルは、in vitroでの胚性膵臓前駆細胞の維持、拡大と差別化が可能になります。これは、他の内分泌ホルモンを共発現しないインスリン産生β細胞の形成を含む、Pdx1の高レベルのインスリン成熟し、処理インスリン28を有するプロコンバターゼを発現している。システム内の重要な鍵となる要因は、Y-27632によって経路だけでなく、ROCK阻害FGFシグナルの活性（外因的ヘパリンによって増強追加FGFによって刺激）とNotch（内因性）である：いいえ、それらの因子の非存在下で、または非常にオルガノイドと球の限られた数が28を生成した。 FGFおよびNotための要件CHの活動を簡単に、生体内28での膵臓の開発のための重要性に基づいて理解されている。 ROCK阻害剤は、従って、解離時にマイクロフィラメントのダイナミクスの過剰活性化は細胞死の増加は、前駆転写因子Pdx1の膨張性の欠如の両方の強力な阻害をもたらすことを明らかにし、ブレビスタチンによって置換することができる。興味深いことに、オルガノイド媒体の多くの追加の構成要素は、個々に不必要であることが証明されたが、その組み合わせがないことは28分枝上皮の損失となりました。媒体の特定の必須成分に加えて、前駆体の解離の程度を制御することが重要である。確かに、前駆細胞の増殖とのPdx1のメンテナンスを大幅に超える4セルのグループで推進しています。圧縮は、Pdx1の維持と拡大に失敗するコンパクトな結果への最初の12時間と失敗の中に観察することができる。 ROCK阻害剤は、このために不可欠であるプロセス。 現時点ではオルガノイドは、FACSソーティングが、システムの効率は、潜在的に前駆細胞の制御された数を再凝集することによって改善することができた後に形成しない。この培養システムの別の重要なコンポーネントは、3次元マトリックスである。細胞はマトリゲル上またはプレートスプレッドの下部に近すぎるマトリゲルに入れてのPdx1式を失う。マトリゲルは最も可能性の高い生化学成分、特にラミニンだけでなく、機械的な手がかり28を提供しています。実際に、マトリックスの剛性は極めて重要な役割を果たしている。硬いヒドロゲルは、膵臓の前駆細胞の維持·拡大28を許容しないで、希釈したマトリゲルのいずれかではありません。マトリゲルを希釈されると1時10分、膵臓の前駆細胞を培養することはできません。 オルガノイドシステムは、生存、増殖、分化、偏光および分岐点で、膵臓前駆細胞の小さな分子および組換えタンパク質の効果を試験するために使用することができる28。また、膵臓の発達中に28の異なる細胞型の協力を試験するために使用することができる。私たちは、膵臓の前駆細胞のアクセス可能性は、他の組織体システム17,27に見られるように、ウイルスの標的として遺伝子操作を、できるようになると確信しています。これは、前述の球体とは対照的に、形態形成を可能にするだけでなく、ここ16,17,28システム17をスクリーニングするために使用することができる。我々はまた、開発した培養条件は、血清を含まないという利点を提示し、無フィーダー、それにより細胞性及び生化学的複雑さを低減間葉および血管を欠く。しかし、通路オルガノイドする能力には限界があり、従って、大量の前駆細胞を得た。これはembryonから生産膵臓前駆細胞のソースに、前駆細胞は、より豊富で、開発の後期段階にプロトコルの適応により、将来的に回避することができたでIC幹（ES）細胞または人工多能性幹（iPS）細胞が挙げられる。これは、ヒト膵臓発生の3Dモデルへの道を開く。 このシステムはまた、潜在的に治療の将来展望において膵臓細胞の産生のために使用することができる。この文脈において、移植のための機能的β細胞の産生は、潜在的に、糖尿病治療に役立つだろう。ヒトESまたはiPS細胞に対するシステムの適合は、この目的のために重要であろう。これは、オルガノイドまたは球体条件を使用すべきかどうかはまだ不明である。オルガノイド条件は、成熟β細胞のいくつかの特徴を有する細胞の産生を可能にするが、その機能を試験されていない。しかしながら、これらの細胞は、現在、多数のではなく、他の細胞の中で混合される。これは、オルガノイド、システム内の不均一性の早期出現は細胞間の制御されていないシグナリングにつながり、したがって、生産に有害であることも考えられます。 T前駆細胞を維持し、彼球システムは、原理的に前駆細胞の制御された膨張および継代に好適であるが、それらのその後の分化が制御されていない。その他、最近効率的に分化させることができるpancreatospheresを生産している。それは、他のプロトコル16,17で得られた球にフィーダー、血清を欠いて、現在のプロトコルで得られた球の性質を比較することが重要になります。治療の観点からは、マトリゲルの複雑性および生物学的起源は、再現性、健康およびスケーラビリティの問題を構成することができる。予備的な結果は、ラミニンで官能化されたソフトなヒドロゲルは、in vitroで膵臓前駆拡大を許容することが示されている。これらのゲルがまだマトリゲル28ほど効率的ではないので、さらなる最適化が必要である。 それらの天然の文脈におけるβ細胞の産生も潜在的にβを高める薬剤を試験するのに有用であり得る細胞活性又はそれらの生存または増殖を増加させるが、この目的のためには、まずそれらの分化の効率を高めるために、ここで提示された培養条件は、より良い電流よりも膵島を維持するかどうかを試験するために、β細胞の成熟度をテストすることが重要である懸濁培養。膵臓外分泌腺を生産することも膵癌と膵炎を対象とする薬を開発するのに有用である可能性があります。ここでも、産生さ外分泌細胞の成熟度を十分に調査する必要がある。

器官培養は複雑であるが、生体内の調査で非常に関連性の高い細胞株モデルの便利なが、おおよそのシミュレーション間のギャップを橋渡しする有用なモデルを提供しています。内分泌および外分泌細胞を模擬した形質転換された細胞株が存在するが、膵臓例では、膵臓の前駆細胞と完全に同等のない細胞株ではありません。大人の膵臓全体を培養することができません。単離された内分泌膵島は数時間5 インビトロで維持することができる細胞増殖および組織切片なしで、数週間維持することができる。胚性膵臓培養物は、広くその発達を研究するためだけに使用されているだけでなく、上皮間葉相互作用4,6,7を調査するために、画像に8を処理または化学的にそれらと9を妨害する。二つの器官培養法が主に使用されます。最初は都合のですフィブロネクチンコーティングしたプレート2、上の膵臓芽を培養することにある画像化目的のためにnient;二つ目のオプションは文化に最も形態形成を保持する気液界面3,4でフィルタの臓器です。非常に有用であるが、これらの方法は、ある程度の平坦化をもたらす;前駆細胞の拡大は非常に正常な発達および出発集団は、膵臓細胞および間葉細胞の全ての種類を含む複合体であると比べて制限される。 文化への能力と分散初代細胞を拡大し、系統関係を研究し、単離された細胞のタイプ10の固有の特性を明らかに価値がある。杉山ら 11膵臓前駆細胞およびフィーダー層上の文化の中で3〜5日間いくつかの機能の文字を保持する内分泌前駆細胞を維持することができます。ニューロスフェア12と13のマンモスフィアに似Pancreatospheresは、成人の島および前駆細胞/幹細胞の性質であるが管細胞から展開されてきたこれらの球体を生成することをすることは明らかではない。また、生理的発達とは対照的に、pancreatospheresは、いくつかのニューロンの14,15を含んでいた。球はまた、最近、胚性膵臓前駆細胞16,17と良好な前駆細胞の拡大とそれに続く分化と膵臓18回生から生じたが、形態形成を再現できなかったし。 小型化された臓器に自己組織化分散させ、多くの場合、定義された細胞からの3Dモデルは、最近、繁栄し、そのような腸19,20、胃21、肝臓22、前立腺23、気管などの複数の器官の発達、大人の離職率をシミュレートしている24。光学カップ25、小腸26または脳27の場合のように、いくつかの例では、形態形成の発達および分化は、ES細胞から3Dにで要約されている。 ここでは、DES彼らは差別化と自己組織化することができる3Dマトリゲル足場に解離した多能性膵臓前駆細胞を拡大する方法をcribe。

<table><tbody><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum replacement (supplement)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>Stock kept at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human R-spondin 1</td><td>R&amp;amp;D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-spondin 1</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3474-RS-050</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF1 (aFGF)</td><td>R&amp;amp;D</td><td>232-FA-025</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C - do not include to increase beta cell production</td></tr><tr><td>Heparin (Liquemin)</td><td>Drossapharm</td><td></td><td>Stock kept at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF10</td><td>R&amp;amp;D</td><td>345-FG-025</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>B27 x50 (supplement)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF2 (bFGF)</td><td>R&amp;amp;D</td><td>233-FB-025</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Stock kept at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNAlater - RNA stabilizing reagent</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Dispase&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>BSA for reconstitution</td><td>Milipore</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3&quot;&gt;81-068&lt;/a&gt;</td><td>For reconstituition of cytokines&amp;nbsp; - stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>60-well MicroWell trays</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>95-well plates F bottom</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Glas bottom plates</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Disposal glass micropipettes</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td>Cell&amp;#174; imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.&lt;br /&gt;
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.</td></tr><tr><td>Objective</td><td></td><td></td><td>Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;&lt;br /&gt;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance</td></tr></tbody></table>

in vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

3Dマトリゲルで解離し、播種E10.5の背側膵臓前駆細胞は、膵臓の発達を再現。前駆細胞は、最も容易に蛍光リポーターで追跡することができる。我々のケースでは（ 図2）NEUROG3 4を活性化することなく、タモキシフェンの非存在下では、したがって、Pdx1のプロモーター（、PDX1のNgn3-ER TM-nGFP）（動画1）によって制御された核GFPタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを使用していました。 オルガノイド培地で、細胞の小さなクラスターの初期圧縮は、最初の数時間で起こる。拡張は、最初の4日間でのクラスターの拡大（ 図2A）によって検出することができる。 5日目から、枝は20％、最大オルガノイドに形成している。単一細胞を拡張し、大規模なクラスタがPdx1の式 28を保持しながらのPdx1発現を失うことはありません。 このような状況では、前駆細胞は、スペックを受ける分岐した上皮構造の出現とtacular形態形成。このプロセスは、前駆細胞は、コミュニティ信号に対する強い必要性を示唆≥4細胞クラスターに播種された場合にのみ行われる。外分泌（アミラーゼ+）または内分泌（インスリン+またはいずれかを発現し、分化した細胞：組織学的分析は、培養7日後に、結果として得られるミニ臓器膵臓前駆細胞（ 図3B SOX9 + / HNF1B + / のPdx1 +細胞）から構成されていることが明らかになったグルカゴン+）マーカー（ 図3A、C）。内分泌細胞への分化（0.1％程度）、内因性膵臓におけるよりも低いがFGF1を培地28に添加されていない場合には1％に増加する。驚くべきことに、シードされた前駆細胞は、予想される膵臓系統に分化ないだけでなく、彼らはまた、自然発生的に正常な膵臓のアーキテクチャを採用しています。しかし、E10.5多能膵臓前駆細胞は、中央管腔に直面して、膜中Mucin1とのaPKCの分離によって証明し、彼らが分岐管状ネットワークを組織として培養中の細胞は分極、分極されていません。地域化された「先端とトランク」ドメインが出現：腺房細胞は、細胞の部分的または完全な歯冠として周辺部に位置している間HNF1B +前駆細胞および内分泌細胞は、中央領域に局在している。オルガノイドを10日間培養物中に維持することができ;この期間の後、それらは、一般に、それらの建築組織を失い、嚢胞（図示せず）になる。継代は、部分的解離後に行わが、すぐに嚢胞形成、BMP阻害ノギン28の添加により低下する現象につながることができます。 球培地で、膨張はより頻繁であり、単一の細胞の2％から見た;それにもかかわらず、球形成の効率はseedeの大きさと相関するDクラスタ28。一日2月3日で、内腔は小さなクラスターが検出され、時折地元の多層区域（ 図2B）で、主に単層中空球につながる、その後は拡大する。マトリゲル（ 図3D-H）から検索されたときに、これらの球は崩壊。これらの条件下で、得られた構造は主に、7日目に分化した外分泌および内分泌細胞の小さなパーセンテージ（ 図3D-H）を用いて、膵臓前駆細胞から構成されている。球内の前駆細胞はまた、すべての細胞（ 図3F）の中央内腔に面した膜におけるのaPKCの分離によって示されるように、先端方向の偏光になる。 Pancreatospheresの少なくとも2倍（図示せず）に継代することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。procedurの模式図電子。胃腸管は、最初に胚から切開され、その後、背側膵芽を単離する。間葉を除去し、膵臓前駆細胞を、トリプシンを用いて解離される。得られた部分的に分散した細胞を、次いで増殖因子枯渇マトリゲルに低密度で播種する。スケールバー：スケールバーは200μmで生じたオルガノイド絵を除いて1.00ミリメートルは<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51725/51725fig1highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。時間をかけて文化の進展。（A）オルガノイド培地で増殖させた膵臓の前駆細胞の小さなクラスターおよび60時間、めっき後3時間からタイムラプス顕微鏡で行った。 BO中ttomパネル、培養7日後のオルガノイド。スケールバー：200ミクロン;球のAにすべてのパネルに適用されます（B）の例は、60時間の時間経過に続き、培養7日目に捕獲した。スケールバー：200ミクロン; B内のすべてのパネルに適用されます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51725/51725fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。組織学。と分化（A -アミラーゼ、C -インスリン）マーカー- （AC）は、7日間の連続切片は、前駆細胞（HNF1B B）について染色オルガノイド。オルガノイドは、上皮（A - E-カドヘリン）で構成され、頂端（B - mucin1）極性細胞。破線は、非腺房中央領域（A）に対応するHNF1B（B）と内分泌（C）細胞が検出された（DH）前駆細胞（G - HNF1B、H - SOX9）について染色7日間の球体のセクション。および内分泌（D -インスリンおよびグルカゴン）のマーカー。上皮（E - E-カドヘリン）細胞 - 球は頂端偏光（aPKCのD、F）で構成されています。スケールバー：50μmのは、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51725/51725fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

13.7K ビュー.  Swiss Institute for Experimental Cancer Research. このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。 

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In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

発生生物学

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

医学

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

生物学

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

要約

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インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールドフリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1⁺後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

のためのシステム

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

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インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

のためのシステム

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールドフリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1⁺後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から