Diese Arbeit wurde nacheinander von einem NFS Frontiers in Genetics Pilot Auszeichnung, Juvenile Diabetes Research Foundation Grants 41-2009-775 und Grant 12-126875 von Det Frie forskningsråd / Sundhed og Sygdom finanziert. Die Autoren danken der Spagnoli Labor für die Ausrichtung der Videoaufnahmen.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu wachsen Bauchspeicheldrüsen Organoide aus murinen E10.5 abgeleitet dissoziiert epithelialen Zellen der Bauchspeicheldrüse. Das Protokoll erfordert ethische Genehmigung für Tierversuche. 1. Präparation der dorsalen Pankreas-Knospe von E10.5 Maus Embryonen <ol><li> Sacrifice timed-schwangeren Mäusen an embryonalen Tag (E) 10.5, öffnen Sie den Bauch mit einer Schere entfernen Sie die beiden Uterushörner und legen Sie sie in einem 10-cm-Petrischale mit kaltem Phosphat-Pufferlösung (PBS) gefüllt oder Dulbecco modifiziertem essentiellen Medium (DMEM) auf Eis gehalten. Die Gesamt Experiment aus dem Opfer zu Zellaussaat ist in 60-90 Minuten durchgeführt, um Zellschäden zu verhindern. </li><li> Trennen Sie die Gebärmutter in einzelne Segmente Embryo mit einer kleinen Schere. Übertragen eines Embryos auf eine 35 mm Petrischale mit kaltem PBS und visualisieren sie unter einem Binokular mit Beleuchtung von oben. Mit einer Pinzette entfernen Dissektion der umliegenden Muskeln, decidua und Dotter sac und setzen den Embryo. Setzen Sie den Embryo wieder in kaltem DMEM Medium. Embryonen kann leicht mit Hilfe eines 3-ml-Plastiktransferpipette / Dropper übertragen werden. Isolieren jedes einzelnen Embryos in ähnlicher Weise vor dem Fortfahren. </li><li> Legen Sie einen Embryo in eine saubere 35-mm-Petrischale in PBS. <ol><li> Verwenden dünnen Pinzette (0,05 mm Breite), um die Vordergliedmaße zu entfernen. Sanft die Zange im Öffnungseinsatz um den Verdauungstrakt aus dem Rückenmark Region (Fig. 1) zu lösen. Optional: Um bequemer sehen den Magen, entfernen Sie den Oberkörper des Embryos, bis hin zu Herz-und Heckbereich unterhalb des Dotter Stiel. </li><li> Suchen Sie den Magen, Leber und Darm. Mit den Zangen, isolieren die Magen-Darmtrakt aus dem Magen in den Darm und legen Sie sie in kaltem DMEM auf Eis (Abbildung 1). Die dorsale Pankreas Knospe dorsal angebracht, hinter dem Magen (Abbildung 1). </li><li> Isolieren Sie jeden einzelnen Magen-Darm-Trakt in einer ähnlar Weise, bevor Sie fortfahren. Wenn die Embryonen müssen genotypisierende, sammeln den Schwanz zum Zeitpunkt der Präparation und halten jeden einzelnen Magen-Darm-Trakt in einem anderen auch in einer 24-Well-Platte mit kaltem DMEM auf Eis. </li></ol></li><li> Legen Sie ein Magen-Darm-Trakt in einem sauberen 35 mm Petrischale in kaltem PBS. Jetzt benutze Beleuchtung von unten in Hellfeld unter der Dissektionsmikroskop visualisieren und sezieren die dorsalen Pankreas Knospe. Diese Bedingungen werden die Visualisierung von Volumen zu optimieren. Mit elektrolytisch geschärften Wolfram Nadeln oder 20 G Spritzennadeln, isolieren das Pankreas Knospe mit so wenig wie möglich um Mesenchym des Epithels (Abbildung 1). <ol><li> Übertragen der isolierten Knospe in eine Petrischale mit einem kalten Dispase-Lösung (1,25 mg / ml) für 2-3 min. Von diesem Punkt kann die Übertragung am einfachsten mit flamm gezogen 50 ul Glaskapillaren mit einem Mund-gesteuerten flexiblen Schlauch befestigt erfolgen. Alternativ, aber mit mehr risk verlieren die Knospe, verwenden Sie eine 10 ul automatischen Pipette (Pipetman) mit entsprechenden Kunststoffspitzen. </li><li> Führen Pankreas Knospe Aspiration und Ausstoß unter mikroskopischer Kontrolle. Setzen Sie den Pankreas Knospe zurück in PBS. Weitere aus dem Mesenchym mit den Nadeln und leichtes Ansaugen mit der Glaskapillare (Abbildung 1) reinigen die isolierte Pankreasknospe. </li><li> Wenn das gesamte Mesenchym entfernt ist, spülen Sie die Pankreas Knospe in kaltem PBS; Übertragen Sie jede Knospe zu kalt DMEM in einzelnen Vertiefungen (60-well Mini-Trays mit 10 ul kalten DMEM gefüllt). Es ist wichtig, das Mesenchym in Dispase zu entfernen, die das Gewebe sehr klebrig macht. </li></ol></li></ol> 2. Überzug und Kultur der dispergierten Zellen <ol><li> Übertragen Sie die seziert Epithelien aus allen Embryonen mit einem flamm gezogen Glaskapillare in konische Vertiefungen der 60-Well-Mini-Trays mit 10 ul PBS gefüllt zum Spülen. <ol><li> Übertragen Sie die Knospe in 10 ul Trypsin 0,05% einnd lassen Sie es bei 37 ° C inkubieren 4 min. Inaktivierung des Trypsins durch Übertragen der Keim in einem gut mit 10 &amp;mgr; l DMEM + 10% fötales Kälberserum (FCS). </li><li> Distanzieren Sie die Zellsuspension durch Aspiration durch eine dünne Kapillare mit einer Pipette Puller gezogen. Es ist wichtig, um Blasen zu vermeiden, in dieser Phase, während und Abpipettieren, um die Zellen zu distanzieren. Bauchspeicheldrüse Organoide optimal vor kleinen Gruppen von 5-15 Zellen beginnen und deshalb teilweise Dissoziation empfohlen (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Pool der Zellen aus mehreren Embryonen in ein Eppendorf-Röhrchen, um die Unterschiede aufgrund der individuellen Verarbeitung zu minimieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension in gekühlten Matrigel bei einem Verhältnis von 1:3. Aliquote dieser Mischung in eine 96-Well-Platte, 8 &amp;mgr; l / Vertiefung in einer Platte oder für die Abbildung optimiert (siehe unten). </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 Minuten, so dass die Matrigel zu verdicken. Füllen Sie die Vertiefungen mit 70 ul Medium der Wahl (Organoid oder Kugel, siehe Tab.les 1 und 2) und lassen in einer befeuchteten Umgebung mit 5% CO 2 und 95% Luft bei 37 ° C. </li><li> Jeden 4. Tag Ersetzen Sie das Medium. Überwachen Sie die wachsenden Kolonien Bauchspeicheldrüsen täglich und dokumentieren den Prozess durch Bildgebung. </li><li> Kleine Moleküle oder Proteine ​​von Interesse können dem Medium zu diesem Zeitpunkt für Interferenzexperimente hinzugefügt werden, wie vorher 28 gemeldet. </li></ol> Tabelle 1: Organoide Medium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Name des Materials </td><td> Auf Konzentration </td><td> Konzentration in endgültige Medium </td><td> Volumen der Stamm </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> KnockOut Serum Ersatz (Ergänzung) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> 14,3 M </td&gt; <td> 0,1 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) </td><td> 16 uM </td><td> 16 nM </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK-Inhibitor) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 &amp;mgr; g / ml </td><td> 25 ng / ml </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> Rekombinantem humanem R-1 Spondin </td><td> 250 &amp;mgr; g / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> - Oder - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Mouse R-1 Spondin </td><td> 250 &amp;mgr; g / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Rekombinantem humanem FGF1 (aFGF) </td><td> 100 &amp;mgr; g / ml </td><td> 25 &amp;mgr; g / ml </td><td> 1,25 ul </td></tr><tr><td> Heparin (Liquemin) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2,5 U / ml </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Recomnante Menschen FGF10 </td><td> 100 &amp;mgr; g / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Sphere Medium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Name des Materials </td><td> Auf Konzentration </td><td> Konzentration in endgültige Medium </td><td> Volumen der Stamm </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> B27 x50 (Ergänzung) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Recombinant Human FGF2 (bFGF) </td><td> 100 &amp;mgr; g / ml </td><td> 64 ng / ml </td><td> 3.2 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK-Inhibitor) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845,8 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> 3. Imaging der Progression der Organoide Entwicklung <ol><li> Bild Organoide mit einem fluoreszierenden Zeitraffer-Mikroskop entweder täglich oder Zeitraffer-Mikroskopie. Für Zeitreihen-Aufnahmen, verwenden Sie ein XY (Z) automatisierte invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Kaution kleine Tröpfchen von 3 ul in 4-Well-Platten oder Glasbodenplatten mit 2-5 ml Medium gefüllt ist. Bild mit einem 10-fach Fernziel. Hinweis: Transgene Mäuse, die fluoreszierenden Indikatoren verwendet werden. Film 1 zeigt zum Beispiel die anfängliche Expansion Organoide von Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + 4 Mäuse. Die Kern GFP ermöglicht dem Benutzer, Zellen zu verfolgen als einzelne Objekte aber ähnliche Prinzipien angewendet werden, um Zellen mit Membran Fluoreszenz verfolgt werden,als mT / mg Mäuse 29. </li><li> Starten Zeitraffer-Bildgebung 3 Stunden nach dem Aussäen der Zellen, um den Fokus Verwehungen zu vermeiden und setzen die Software die Steuerung Automatisierung, um ein Bild / h für 3 oder mehr Tage bei manuell definierten Positionen zu nehmen. Für jede Position, erwerben eine Differentialinterferenzkontrast (DIC), als auch die GFP-Signal, Reporting Fluoreszenzmarker Ausdruck. </li></ol> 4. Wiederherstellung von Organoide für Histologie <ol><li> Legen Sie die 96-Well-Platte auf Eis und entfernen Sie das Medium, mit eiskaltem PBS ersetzt. Diese teilweise depolymerisiert Matrigel. </li><li> Vorsichtig absaugen jedes einzelne OBs, das Entfernen der umgebenden Matrigel mit einem 1000 ul Spitze, um die Gesamtarchitektur nicht zu stören. Übertragen Sie jede Organoid zu einem gut mit eiskaltem PBS. Halten Sie die Platte auf Eis. Direktbefestigung in Matrigel ist ebenfalls möglich. </li><li> Befestigen Sie die Organoid für 15 min in 4% Paraformaldehyd (PFA), Kryokonservierung in Saccharose und binde sie in Gelatine. An jederorganoiden für Kryoschneiden und Histologie wie zuvor beschrieben (Johansson et al., 2007) 4. </li></ol> 5. Organoide Erholung der für die PCR und Biochemie <ol><li> Legen Sie die 96-Well-Platte auf Eis und entfernen Sie das Medium. In 60 ul pro RNAlater auch zur Stabilisierung und zum Schutz zellulärer RNA. </li><li> Stört Sie das Gel in jedem gut mechanisch durch teilweise Depolymerisation es auf Eis. Entweder erholen einzelnen Organoide mit einem 1000 ul Spitze, um die Gesamtarchitektur nicht stören oder Wiederherstellung der kompletten gut (mit Matrigel) durch Unterbrechung der Gel mechanisch mit einer 200 ul Spitze. Verwenden Sie ein 1.000 ul Spitze, die auch Inhalt in ein RNase-frei nicht klebrig Eppendorf-Röhrchen übertragen auf Eis gehalten. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 60 ul RNAlater und das restliche Inhalt zum gleichen Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Dreh die Röhrchen für 5 min bei 500-1.000 x g bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, so dass nur 20-30 ulRNAlater in das Rohr zusammen mit dem Pellet. Für Biochemie, speichern Sie die Proben so trocken wie möglich. </li><li> Proben in RNAlater sofort nicht einfrieren; bei 4 ° CO / N (damit RNAlater, um das Gewebe gründlich zu durchdringen). Das Gewebe kann bei -20 ° C zur Langzeitspeicher gespeichert werden und können später zur Gewebezerstörung und Extraktion von kleinen Mengen von RNA verarbeitet werden. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Großtechnische Produktion von Funktions Beta-Zellen in vitro ist immer noch ineffektiv ein. In diesem schwierigen Kontext kann der Entwicklungsbiologie Studien helfen, die Entschlüsselung der Signale, die exakte für die Differenzierung von funktionellen Beta-Zellen benötigt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Erhaltung, Expansion und Differenzierung der Pankreas-Vorläuferzellen in embryonalen vitro. Dazu gehören die Bildung von Insulin-produzierenden Beta-Zellen, die nicht mit-exprimieren anderen endokrinen Hormone, haben hohe Pdx1, drücken die pro-Konvertasen, die Insulin reifen und die Insulin 28 verarbeitet. Wichtige Schlüsselfaktoren innerhalb des Systems sind die Aktivität von FGF (exogen aufgenommen von FGF durch Heparin potenziert stimuliert) und Notch (endogene) Signalwege, sowie ROCK-Inhibition durch Y-27632: In Abwesenheit dieser Faktoren keine oder nur sehr begrenzte Anzahl von Organoide und Kugeln erzeugt wurden 28. Die Voraussetzung für FGF und nichtch Aktivität ist leicht anhand ihrer Bedeutung für die Pankreasentwicklung in vivo 28 verstanden. ROCK-Inhibitor kann durch blebbistatin ersetzt werden und zeigt so, dass die Hyperaktivierung des microfilament Dynamik bei der Dissoziation führt sowohl zu erhöhten Zelltod, einer starken Hemmung des Transkriptionsfaktor-Vorläufer Pdx1 und ein Mangel an Expansion. Interessanterweise wurden viele zusätzliche Komponenten des organoiden Medium nachgewiesen individuell unnötig sein, aber ihre Kombination Abwesenheit führte zum Verlust von Epithelzellen Verzweigung 28. Neben einigen wesentlichen Komponenten des Mediums, ist es wichtig, den Grad der Dissoziation von Vorläuferzellen zu steuern. Tatsächlich sind Vorläufer Proliferation und Pdx1 Wartung deutlich in Gruppen von mehr als 4 Zellen befördert. Eine Verdichtung kann innerhalb der ersten 12 Stunden und die Nicht kompakte, führt dazu Pdx1 halten und ausbauen zu beachten. Die ROCK-Hemmer ist für dieseProzess. Im Moment Organoide bilden keine nach FACS-Sortierung, aber die Effizienz des Systems potentiell von reaggregating eine kontrollierte Anzahl von Vorläuferzellen verbessert werden. Ein weiterer wichtiger Bestandteil des Kultursystems ist die 3D-Matrix. Die Zellen setzen auf Matrigel oder im Matrigel zu nahe an der Unterseite der Platte verteilt und verlieren Pdx1 Ausdruck. Matrigel wahrscheinlich bietet biochemischen Komponenten, insbesondere Laminin sowie mechanische Signale 28. Tatsächlich spielt die Steifigkeit der Matrix eine wichtige Rolle. Stiff Hydrogele sind nicht permissive für Pankreas-Vorläuferzellen Wartung und Erweiterung 28 und verdünnt Matrigel auch nicht. Wenn Matrigel wird 1:10 Bauchspeicheldrüse Vorläufer kann nicht kultiviert werden. Die organoiden System kann verwendet werden, um die Auswirkungen von kleinen Molekülen und rekombinante Proteine ​​auf Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen in Bezug auf das Überleben, die Proliferation, Differenzierung, Polarisationstest und Verzweigungs28. Es kann auch verwendet werden, um das Zusammenwirken verschiedener Zelltypen während der Pankreasentwicklung 28 zu testen. Wir sind zuversichtlich, dass die Zugänglichkeit von Pankreas-Vorläuferzellen werden auch genetische Manipulationen, wie virale Targeting, wie in anderen Systemen Organoid 17,27 gesehen zu ermöglichen. Dies könnte zum Screenen 17 mit einem System, das die Morphogenese im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen sowie hier 16,17,28 Kugeln können verwendet werden. Die Kulturbedingungen entwickelten wir auch präsentieren den Vorteil, dass Serum-freien, Feeder-frei und frei von Mesenchym und Blutgefäße, wodurch die zelluläre und biochemische Komplexität reduziert wird. Jedoch gibt es eine Beschränkung der Fähigkeit, die Passage Organoiden und somit große Mengen an Vorläuferzellen zu erhalten. Dies könnte in der Zukunft durch Anpassungen des Protokolls zum späteren Stadien der Entwicklung, bei der Vorläuferzellen sind häufiger umgangen werden können, zu den Quellen der Pankreas-Vorläuferzellen aus Embryo erzeugtic Stammzellen (ES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Dies ebnet den Weg für ein 3D-Modell der menschlichen Bauchspeicheldrüse Entwicklung. Dieses System kann auch potentiell für die Herstellung von Pankreaszellen in der Zukunftsperspektive der Therapie verwendet werden. In diesem Zusammenhang würde die Herstellung von Funktions Beta-Zellen für die Transplantation potentiell in der Diabetestherapie zu helfen. Die Anpassung des Systems an menschlichen ES-oder IPS-Zellen wäre für diesen Zweck. Es ist noch unklar, ob die Organoid oder Kugel Bedingungen verwendet werden soll. Die organoiden Bedingungen ermöglichen die Herstellung von Zellen, die mehrere Merkmale der reifen Beta-Zellen haben, aber ihre Funktion bleibt zu prüfen. Jedoch sind diese Zellen noch nicht zahlreich und werden unter anderen Zellen gemischt. Es ist auch wahrscheinlich, dass das frühe Auftreten von Heterogenität in der organoiden System führt zu unkontrollierten Signalisierung zwischen Zellen und ist daher nachteilig auf die Produktion. Ter Kugel-System, das Vorläuferhält grundsätzlich bevorzugt kontrollierten Expansion und Passage von Vorläufern, aber ihre nachfolgende Differenzierung bleibt gesteuert werden. Andere haben vor kurzem hergestellt pancreatospheres, die effizient unterschieden werden können. Es ist wichtig, die Art der in dem aktuellen Protokoll ohne Feeder und Serum zu Kugeln mit den anderen Protokollen 16,17 erhaltenen Kugeln zu vergleichen. Aus therapeutischer Sicht kann die Komplexität und biologische Ursprung der Matrigel ein Problem der Reproduzierbarkeit, Gesundheit und Skalierbarkeit bilden. Erste Ergebnisse haben gezeigt, dass mit weichen Hydrogele Laminin funktionalisiert sind permissiv für Pankreas-Vorläufer Expansion in vitro. Weitere Optimierung erforderlich ist, da diese Gele sind noch nicht so effizient wie Matrigel 28. Die Produktion von Beta-Zellen in ihrem natürlichen Kontext könnte auch potentiell nützlich, um Medikamente, die Beta-Test zu steigernZellaktivität oder erhöhen ihr Überleben oder Proliferation, aber für diesen Zweck ist es wichtig, zuerst den Reifegrad der Beta-Zellen zu testen, um die Effizienz zu erhöhen und ihre Differenzierung zu testen, ob die Kulturbedingungen hier vorge besser halten als die aktuelle Inseln Suspensionskulturen. Die Herstellung der exokrinen Pankreas könnte auch nützlich, um Drogen, um Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreatitis Ziel zu entwickeln. Auch hier der Grad der Reife der exokrinen Zellen produziert muss gründlich untersucht werden.

Orgelkultur bietet ein nützliches Modell, das die Lücken zwischen der komplexen, aber sehr relevant in-vivo-Untersuchungen und die bequeme, aber ungefähre Simulation von Zelllinie Modelle überbrückt. Im Falle der Bauchspeicheldrüse, gibt es keine Zelllinie perfekt entspricht Pankreas-Vorläufer, obwohl es sind transformierte Zellinien Simulation endokrine und exokrine Zellen. Die erwachsenen ganze Bauchspeicheldrüse kann nicht kultiviert werden; endokrinologischen Inseln können für einige Wochen beibehalten werden, ohne die Zellproliferation und Gewebeschnitten können in vitro für einige Stunden 5 gehalten werden. Embryonale Bauchspeicheldrüse Kultur ist weit verbreitet, nicht nur ihre Entwicklung zu studieren, sondern auch epitheliale-mesenchymale Interaktionen 4,6,7 untersuchen, Bild verarbeitet 8 oder 9, um mit ihnen chemisch stören. Zwei Orgelkultur Methoden werden hauptsächlich verwendet: Die erste besteht in der Kultivierung von Bauchspeicheldrüsenknospen auf Fibronektin-beschichtete Platten 2, das ist komfortabler zur Bildgebung; Die zweite Möglichkeit ist die Kultur die Organe über Filter an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die 3,4 am besten bewahrt Morphogenese. Obwohl sehr nützlich führen diese Verfahren zu einem gewissen Grad der Abflachung; der Ausbau der Vorläufer sehr begrenzt im Vergleich zu der normalen Entwicklung und der Ausgangspopulation Komplex, alle Typen von pankreatischen Zellen und mesenchymalen Zellen. Die Fähigkeit, Kultur und erweitern verteilten Primärzellen ist wertvoll für Linie Beziehungen zu studieren und entdecken Sie die intrinsischen Eigenschaften von isolierten Zelltypen 10. Sugiyama et al 11. Könnte Pankreas-Vorläufern und endokrine Vorläuferzellen, die einige funktionale Zeichen für 3-5 Tage in Kultur auf Feeder-Schichten beibehalten zu halten. Pancreatospheres, ähnlich Neurosphären mammospheres 12 und 13 sind aus adulten Inseln und duktalen Zellen erweitert worden, obwohl die Art der Vorläufer / Stammzellen, die diese Kugeln zu erzeugen, ist nicht klar. Darüber hinaus im Gegensatz physiologische Entwicklung enthielten die pancreatospheres einige Neuronen 14,15. Kugeln wurden vor kurzem auch aus embryonalen Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse 16,17 und regenerierende Bauchspeicheldrüsen 18 mit guten Vorläufer Expansion und nachfolgende Differenzierung produziert aber nicht Morphogenese rekapitulieren. 3D-Modelle aus dispergierten, oft definierte Zellen, die durch Selbstorganisation miniaturisierten Organen mit blühten und simulieren die Entwicklung oder Erwachsener Umsatz von mehreren Organen, wie dem Darm 19,20, dem Magen 21, Leber 22, die Prostata 23 und die Trachea 24. In einigen Fällen wurden Entwicklungs Morphogenese und Differenzierung von ES-Zellen 3D rekapituliert wurde, wie im Fall der Augenbecher 25, 26 Darm, Gehirn 27. Hier haben wir describe eine Methode, um multi dissoziierten Pankreas-Vorläuferzellen in einer 3D-Matrigel Gerüst, wo sie differenzieren können und selbst zu organisieren, zu erweitern.

<table><tbody><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum replacement (supplement)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>Stock kept at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human R-spondin 1</td><td>R&amp;amp;D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-spondin 1</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3474-RS-050</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF1 (aFGF)</td><td>R&amp;amp;D</td><td>232-FA-025</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C - do not include to increase beta cell production</td></tr><tr><td>Heparin (Liquemin)</td><td>Drossapharm</td><td></td><td>Stock kept at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF10</td><td>R&amp;amp;D</td><td>345-FG-025</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>B27 x50 (supplement)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF2 (bFGF)</td><td>R&amp;amp;D</td><td>233-FB-025</td><td>Stock kept at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Stock kept at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNAlater - RNA stabilizing reagent</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Dispase&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>BSA for reconstitution</td><td>Milipore</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3&quot;&gt;81-068&lt;/a&gt;</td><td>For reconstituition of cytokines&amp;nbsp; - stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Stock kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>60-well MicroWell trays</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>95-well plates F bottom</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Glas bottom plates</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Disposal glass micropipettes</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td>Cell&amp;#174; imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.&lt;br /&gt;
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.</td></tr><tr><td>Objective</td><td></td><td></td><td>Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;&lt;br /&gt;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance</td></tr></tbody></table>

in vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

E10.5 dorsalen Pankreasvorläuferzellen dissoziiert und in 3D Matrigel ausgesät rekapitulieren Bauchspeicheldrüse Entwicklung. Vorläufer lassen sich am einfachsten mit fluoreszierenden Reporter verfolgt werden. In unserem Fall haben wir eine transgene Maus, die ein Kernprotein mit GFP Pdx1 Promotor (Pdx1-Ngn3-ER-nGFP TM) (Film 1) in Abwesenheit von Tamoxifen und so gesteuert ohne Aktivierung NEUROG3 4 (Fig. 2) drückt. Mit dem organoiden Medium tritt eine anfängliche Kompaktierung kleine Cluster von Zellen in den ersten Stunden. Expansion kann dann durch die Erweiterung der Cluster in den ersten 4 Tagen (2A) festgestellt werden. Von Tag 5, bilden Filialen in den größten 20% Organoide. Einzelzellen nicht erweitern und verlieren Pdx1 Ausdruck, während die großen Cluster behalten Pdx1 Ausdruck 28. Unter diesen Bedingungen Vorläuferzellen durchlaufen eine spectacular Morphogenese mit der Entstehung von verzweigten epithelialen Strukturen. Dieser Prozess erfolgt nur, wenn die Vorfahren sind in ≥ 4-Zellen-Cluster ausgesät, was auf eine starke Voraussetzung für Community-Signale. Die histologische Analyse zeigt, dass nach Tag 7 der Kultur, die daraus resultierenden Mini-Organe werden von Pankreas-Vorläuferzellen (SOX9 + / HNF1B + / +-Zellen Pdx1: 3B) zusammengesetzt und differenzierten Zellen entweder exokrinen (Amylase +) oder endokrine (Insulin + oder ausdrücken Glucagon +) Markierungen (3A, C). Die Differenzierung in endokrinen Zellen ist geringer als in der endogenen Pankreas (etwa 0,1%), ist jedoch auf 1% erhöht, wenn FGF1 wird nicht zu dem Kulturmedium 28 aufgenommen. Bemerkenswert ist, nicht nur die Vorläuferzellen ausgesät differenzieren sich in der erwarteten Pankreas-Linien, aber sie sind auch spontan die normale Pankreas-Architektur verabschieden. Obwohl E10.5 multipotente Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse nicht polarisiert ist, die Zellen in Kultur zu polarisieren, wie durch die Trennung der Mucin1 und aPKC in der Membran zugewandten zentralen Lumens gezeigt und sie in einem verzweigten Rohrnetz anzuordnen. Regionalisierte &quot;Spitze und Stamm&quot; Domänen entstehen: HNF1B +-Vorläuferzellen und endokrinen Zellen sind in der zentralen Region lokalisiert, während Azinuszellen an der Peripherie als eine teilweise oder vollständige Krone Zellen. Die Organoide in Kultur für 10 Tage aufrecht erhalten werden; nach dieser Zeit, sie in der Regel verlieren ihre architektonische Organisation und werden zystische (nicht gezeigt). Passagieren können nach teilweiser Dissoziation getan werden, aber führt zu einer Zystenbildung, ein Phänomen, das durch die Zugabe des Inhibitors BMP Noggin 28 schnell verringert wird. Mit der Kugel Medium, ist die Expansion häufiger und wird von 2% der Einzelzellen gesehen; Dennoch ist die Effizienz der Kugelbildung korreliert mit der Größe des seeded Cluster 28. An Tag 2/3, ist ein Lumen in den kleinen Clustern erkannt und danach erweitert, was zu weitgehend einschichtigen Hohlkugeln mit gelegentlichen lokalen vielschichtigen Bereichen (Abbildung 2B). Diese Kugeln zusammenbrechen, wenn sie von Matrigel (3D-H) abgerufen werden. Unter diesen Bedingungen werden die resultierenden Strukturen, die hauptsächlich aus Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen besteht, mit einem kleinen Prozentsatz der differenzierten exokrinen und endokrinen Zellen am Tag 7 (Fig. 3D-H). Vorläuferzellen in den Sphären auch apikal polarisiert werden, wie durch die Trennung der aPKC an der Membran zugewandten zentralen Lumens aller Zellen (Abbildung 3F) gezeigt. Pancreatospheres mindestens zweimal (nicht gezeigten) passagiert werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der InverE. Die Magen-Darm-Trakt wird zunächst aus dem Embryo seziert und anschließend die dorsale Pankreas Knospe isoliert. Mesenchym wird entfernt und die Pankreas-Vorläuferzellen werden mit Trypsin dissoziiert. Die resultierende teilweise dispergierten Zellen werden dann bei geringer Dichte in einem Wachstumsfaktor-abgereicherte Matrigel ausgesät. Maßstabsbalken:. 1,00 mm, außer für die resultierende Organoid Bild, wo der Maßstab beträgt 200 um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51725/51725fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Fortschritt der Kultur über die Zeit. (A) Eine kleine Gruppe von Pankreas-Vorläufer mit dem organoiden Medium gezüchtet und anschließend mit Zeitraffer-Mikroskopie von 3 Stunden nach dem Ausstreichen, für 60 Stunden. In der bottom Platten organoiden nach 7 Tagen Kultur. Maßstabsbalken: 200 um; gilt für alle Platten in A (B) Beispiel einer Kugel, die in einem 60-Stunden-Zeitraffer-und am Tag 7 der Kultur eingefangen. Maßstabsbalken: 200 um; gilt für alle Platten in B. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51725/51725fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Histologie. (AC) Serienschnitte von einer 7-tägigen Organoid für Vorläufer (B - HNF1B) gefärbt und Differenzierung (A - Amylase, C - Insulin) Marker. Die Organoid wird von Epithelzellen aus (A - E-Cadherin) und apikal polarisierten (B - mucin1)-Zellen. Die gestrichelte Linie entspricht dem nicht-acinar mittleren Bereich (A), wobeiHNF1B (B) und endokrine (C)-Zellen erkannt (DH) Abschnitte von 7-Tage-Kugeln für Vorläufer gefärbt. (G - HNF1B, H - SOX9) und endokrine (D - Insulin und Glukagon)-Markern. Epithelzellen (E - E-Cadherin)-Zellen - die Kugeln aus apikal polarisierten (aPKC D, F) zusammengesetzt ist. Maßstab:. Um 50 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51725/51725fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

13.7K Aufrufe.  Swiss Institute for Experimental Cancer Research.  Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische. 

Serie: In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Medizin

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biologie

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

Zusammenfassung

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