我々は、図面の製造における彼らの努力のためにこの原稿を準備し、フレドリックSkarstedtとライアン·クリスティと彼女の援助のためエイミートマソンを認める。

治験審査委員会の承認を得て、電子実験室のデータベースの検索は、胃腸内のサイトメガロウイルス（CMV）感染例組織病理によって診断（GI）生検（ヘマトキシリン​​を表す（FFPE）ブロックと組み込みホルマリン固定、パラフィンを特定するために実施されたエオシン（H＆E）および/または免疫組織化学（IHC））。 FFPE GI生検組織からの1。組織処理<ol><li>サイトメガロウイルス（CMV）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）のためにFFPE GI生検組織ブロックを集める。これらのブロックは、室温で保存されている。 </li><li>ブロックの固有の識別番号を事前にラベル1.7ミリリットルのマイクロチューブ。 </li><li>ミクロトームのハンドホイールをロックします。 </li><li>カセットクランプに組織ブロックを装着します。 </li><li>新しい未使用のブレードを使用して、ミクロトームナイフ角度にブロックの位置を合わせます。 </li><li>厚さ10μmの部分をカットするミクロトームを調整します。 </li><li>目のロックを解除Eのハンドルとブレードに向かってブロックを進める。 </li><li>各カットは、組織のスクロールにロールバックできるように、厚さ10μmの間隔でブロックの5つのセクションをカット。各スクロールが必要な生検組織の適切な表現が含まれていることを確認してください。 </li><li>ミクロトームのハンドホイールをロックします。 </li><li>ピンセットで、組織のすべての5巻物は、交差汚染の可能性を減少させるためにパラフィンでスクロールを操作するように注意しながら、予め標識遠心管に入れます。チューブのキャップをスナップし、ラックの上に戻って配置します。 </li><li>ミクロトームから組織ブロックを削除します。 </li><li>ブレードを取り外し、廃棄します。 </li><li>以前の組織と接触した可能性のある表面や楽器を除染。 </li><li>ナイフホルダーに新しい未使用のブレードを配置します。 </li><li>繰り返しは、処理対象の各追加ブロックごとに1.4から1.14を繰り返します。組織スクロールを含有するマイクロフュージチューブはティムまで室温で保存することができるDNA抽出の電子。 </li></ol> FFPE GI生検組織のスクロールから2。のDNA抽出注：このプロトコルはFFPE組織DNA抽出キット（：製品安全データシート（MSDS）を参照してください。注意）の添付文書から採用されている。 <ol><li>各サンプル微量遠心管に：1ミリリットルのキシレン（MSDSを参照してください。注意）を追加します。 10秒間激しく蓋と渦を閉じます。 </li><li> 、具体的に以下のように変更して、メーカーの製品添付文書で概説DNA抽出を続行します。 </li><li>最初に各微量遠心管に内部統制（IC）の6を添加する。 <ol><li> Cは1時間°1時間56℃でATL /プロテイナーゼK溶解インキュベートした後、30分間99℃でインキュベートするのではなく、90。 </li><li>最終的なDNA溶出工程の間に、慎重にDNA精製カラムの蓋を開けて、むしろbuffeなく、膜の中心に50μlの蒸留DNアーゼ/​​ RNaseフリー水を適用rは食べました。 注：適切なストレージおよび試薬の製造のための添付文書を参照してください。 DNAはすべて5のFFPE巻物から抽出する必要があります。室温（15〜25℃）ですべての遠心操作を実行します。 </li></ol></li></ol> CMVのため3。定量PCR <ol><li>ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手順<ol><li> CMVアッセイの実行のために、ExcelのPCRワークシートを生成します。このExcelのワークシートには、Mgをマスターミックスを構成するために必要な各試薬の総量を計算します。これは、サンプルごとに必要な各試薬の量（下記参照）倍のサンプルおよびコントロールの数プラス1を（ピペッティングによる損失を補償するために）掛ける。 <ol><li>量の各PCR反応において、以下の試薬が示さ含む。 試薬0;サンプルあたりの量 CMVの液晶マスターミックスバイアル12.5μL mgのソリューション黄色バイアル2.5μL 総量15.0μL </li></ol></li><li>すべてのアッセイで例えば、水又は無標的対照（NTC）、陰性コントロール、低ポジティブコントロール、高い正の制御、およびQS3またはQS4いずれか、およびすべての患者サンプルを実行します。毛細血管の順に設定する必要があります。 </li><li> 4℃で保存されているリアルタイムPCR機器のための冷却ブロックの特定を得る冷却ブロックに適切な毛細管を配置します。毛細管の表面に触れないでください。毛細血管を取り扱う際は、必ず手袋を使用しています。 </li><li>増幅生産で汚染されていないクリーンフード内のすべてのポリメラーゼ連鎖反応を設定TS。 <ol><li>すべての患者試料に加え、5コントロールをテストするためにPCRキットからマスターバイアルの正しい数を削除します。マスターバイアル、Mgの溶液、および冷却ブロック内のPCRグレードの水を解凍しましょう​​。各マスターバイアルは12のテストのための十分な試薬が含まれています。 </li><li>優しくマスターバイアルをボルテックスし、迅速な最大速度で遠心分離器で、そ​​れらをスピン。 </li><li> 1バイアルに各マスターバイアルの内容を組み合​​わせて、ゆっくり再びボルテックスする。 </li><li>マスターミックスとMgソリューションは、単一の滅菌マイクロチューブをPCRワークシートに表示されている量で結合します。 </li><li>定量標準（QS）のためである5位の毛細血管を除いて、各キャピラリーチューブにやさしく、アリコートMgをマスターミックス15μLを混合します。 </li></ol></li><li>クリーンフードから加工フードにMgを毛細管とマスターミックスを含む冷却ブロックを移動します。 </li><li>マスターの残り30μlに内部統制の2μL（IC）を追加Mgを混ぜる。 5位のキャピラリー（QS用位置）にやさしく、アリコート15μlを混ぜる。 </li><li>ピペット適切なキャピラリーチューブ内への水、コントロールDNA、またはサンプルDNAを10μl。キャッピングツールを使用して、キャピラリーチューブにキャップ。 </li><li>リアルタイムPCR機器にブロック/サンプルを冷却取る。 </li></ol></li><li>番組のリアルタイムPCR計測器（ 表1を参照のこと） </li><li>増幅および検出はリアルタイムPCR装置で行っ<ol><li>コンピュータにログオン</li><li>ダブル器具のアイコンをクリックして、ソフトウェアにログイン。 </li><li>リアルタイムPCR測定器の電源をオン</li><li>フロントスクリーンから「CMV / EBV」をクリックします。 </li><li>マクロウィザードの指示に従います。 </li><li>ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、セルフテストを実行するためにボックスをオンにします。セルフテストは、測定器が使用されている1日に1回実行する必要があります。 </li><li>実行に名前を付けます。 </li><li>上側のLEFにあるサンプル数を調整コントロールと患者の合計にページのTコーナーが実行に含まれ、各患者サンプルの識別番号を入力してください。 </li><li> 「ABSクワント」タブをクリックします。 </li><li> 「サンプルの種類」の下で、標準のための適切なサンプルタイプを割り当てる。 </li><li>定量標準（QS）が予想される濃度を入力します。 </li><li>クーラーブロックから毛細管を削除し、（ブロックサンプル＃1を冷却するなど 、カルーセル上の位置＃1に配置する必要があります）カ ​​ルーセルの対応する位置にそれらを配置します。 </li><li>測定器の遠心分離器を押し、スタートにカルーセルを配置します。 </li><li>遠心分離機を開き、カルーセルを取り外します。 </li><li>リアルタイムPCR機器にカルーセルを配置します。ふたを閉めます。 </li><li>を押して「スタートファイル名を指定して実行」。 </li><li>のリアルタイムPCR装置は、サンプルのために、それぞれの位置をチェックします。このチェックが完了するまで、機器からESPEを離れて歩いたりしてはならない毛細血管の一つがカルーセルにない場合cially。測定器は、この点に注意して、実行を継続するかどうか尋ねるでしょう。離れる前にyesと答える。 </li><li>実行が完了すると、生成されたレポートを閉じます。 </li><li> 「絶対定量」をクリックします。 </li><li>色補正の横にある矢印をクリックしてください。 </li><li>ドロップダウンボックスから「色の選択報酬」をクリックしてください。 </li><li>実行するために適用するために、最新のカラー補正ファイルを選択してください。 </li><li>ボックスがポップアップ表示されたら[OK]をクリックします。 </li><li>標準曲線の矢印をクリックします。 </li><li>ドロップダウンメニューから「外部利用」を選択します。 </li><li>最新の外部標準曲線ファイルを選択し、[OK]をクリックします。 </li><li>濃度が割り当てられている場合の曲線は、存在していない平坦な線であることを確認するために絶対定量メニューの各曲線を見てください。 705/Back 530のための絶対定量が自動的に分析されている。 </li></ol></li><li> QUalityコントロール<ol><li>より頻繁な方、試薬の新しいロット番号が受信されるたびに、新しい標準曲線、または半年ごとに生成します。 </li><li> Mgをマスターミックスに各標準液10μlを加える。以前に抽出されたDNAのようなキットに含まれている基準を検討してください。 </li><li> Mgは正確な定量性を確保するために、標準曲線を生成する際に使用したマスターミックスに各標準のための内部統制の1を添加する。テンプレートなしのコントロール（NTC）のためにMgをマスターミックスにICを追加しないでください。 </li><li> 16のデータポイントで、合計NTCおよび定量標準QS 4、3、2、1、標準曲線を作成し、実行のためのQS4の1:10希釈の3回の反復を用意します。 </li><li>繰り返さ標準のためのドロップダウンメニュー内の &quot;の複製」を選択します。 </li><li>チャンネル530/backのnoneを選択し、実行を分析する際、色補正をオンにし、 </li><li> 「（ファイル名を指定して実行で）標準曲線」に、EX名前を付けて保存」を選択ternal「曲線に名前を付けます。保存時に「標準曲線として適用 &quot;コメントを入力します。 </li><li>結果をグラフ化する。その結果、直線性係数は0.81を≥しなければなりません。 </li><li>毎日実行するために、走行中のコントロールとしてQS3またはQS4のコピーが含まれています。現在の外部標準曲線は、分析フェーズ中に実行にインポートすることができる。 </li><li>実行されるコントロール：いいえDNAコントロール、陰性コントロール、低、高陽性対照。予想されるウイルス量を測定し、各ベンダーとロット番号のために調整される。 </li><li>各サンプルにICを追加し、DNA抽出の際に制御します。 </li><li>コントロールのいずれかが範囲外に落ちた場合、容認できない結果を記録し、トラブルシューティングのためのアッセイを参照してください。 </li></ol></li><li>コントロールの周波数<ol><li>すべての実行中に、次のとおり、NTC、負、正の低、高い正、そして標準コントロール。 </li></ol></li></ol>注：コントロールの許容限度。ピークが観察されるべきではないテンプレートなし（NTC）および陰性対照のためのD。ピークは530チャンネルで存在すべきであると予想されるウイルス量は決定され、低域と高陽性対照のため、各ベンダやロット番号のために調整されている。

<ol>
	<li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).</li><li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+(CMV)+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers.">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li><li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers.">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li><li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection.">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li><li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded,+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies.">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li><li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li><li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world.">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li><li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection.">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li><li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections.">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li><li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection:+prognostic+implications+for+pregnancy.">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li><li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease.">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

多くの実験室的方法は、最近実証されたように、血清学、ウイルス培養、分子ウイルス血アッセイ、生検材料の組織学、および、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検の分子アッセイを含む、サイトメガロウイルスの診断（CMV）感染にご利用いただけます組織5,6。血清学的検査は、診断の主力一度のみ確実に露出を識別し、急性CMV感染7とよく相関しない。ウイルス培養、両方の従来の初期抗原シェルバイアルを、後者の8例で最高の2〜3日で、長時間のアッセイ時間によって妨げられる。分子ウイルス血アッセイは、ほとんどが治療効果9-11を監視するための定量的な可能性を有するという利点を有する、開発されている。胃腸（GI）管の局所的関与の臨床懸念がある場合には、残念ながら、ウイルス血アッセイは、全身の関与を反映し、特異的に局在感染を識別しない。そのため、HistologyはGI管のCMV感染を識別するためのゴールドスタンダードとなっている。 これは、重症感染症を開発するための彼らの大きなリスクを考えると、化学療法に、このようなHIV /エイズとのそれらのような免疫抑制患者における積極的な消化管のCMV感染症を識別することが重要である、または器官/細胞移植幹。これは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）はGI生検5のCMVを検出するための高感度かつ特異的な方法であると報告された。同様の結果は他の研究6でサポートされています。 作業中はすべてのステップが重要であるが、特別な考慮に値するいくつかの重要な重要なステップがあります。ミクロトーム上の組織処理の間に、ブレードが検体間の交差汚染の可能性を低減するために、各試料の間で切り替えることが肝要である。同様に、ミクロトーム上の領域の除染は、組織が、適切なクリーナーRECを使用して接触した可能性がありますミクロトームメーカーによって奨にも、このリスクを軽減します。 プロトコル中に追加の重要なステップは、抽出工程及び増幅の両方のための制御として機能するDNA抽出、中の試料内部の制御IC（ステップ2.3）の添加である。 ICの検出は、チャネル705で発生するのに対し、CMVウイルスの検出は、チャネル530で発生するため、ICの増幅および検出は、CMVの増幅を妨げることはありません。各検査室では、ICの許容範囲を確立する必要があります。抽出後、DNAの品質を評価する必要はない。換言すれば、DNA濃度を分光光度測定を日常的DNA単離に続いて実行されるものではない。 DNA抽出の前に添加する場合、ICは、抽出プロセスのためのコントロールとして作用する。あるいは、IC1μlのMgのバイアル、各マスターミックスに添加してもよい。 Mgをマスターミックスに添加した場合、ICが唯一の増幅Cとして動作するontrol。 これは、すべてのqPCR反応のセットアップ中に（ピペット·チップを含む）、クリーンフードが設定試薬を使用することをことも不可欠です。このフードは、その中で操作任意の増幅産物、 すなわちポストリアルタイムまたは従来のPCRを持つべきではない。これらの増幅産物は、エアロゾル化になり、偽陽性の結果をもたらし、その後、準備されたqPCR反応を汚染する可能性があります。多くの研究室でも非核酸試薬およびサンプルを加算する第2のフードや機器をピペット用まで指定フードや機器などに行くと、核酸を制御します。個々の研究室は、個々のスペースの制約与えられた最適なものを決定する必要があります。 予期しない結果のトラブルシューティング手順の間必要になることがあります。サンプルのIC（ つまりフラットライン）の増幅の証拠がない場合は、最初に元のDNA extractiから定量PCR反応を繰り返すことをお勧めしますピペッティングエラーを確保するためには、サンプルの反応準備中に発生しなかった。 ICは、繰り返し反応に平坦な線のままであり、残りの十分な生検組織がある場合、第二DNA抽出は、抽出プロセス中にICを追加することが留意されて、行ってもよい。この再抽出標本は、フラットラインのICを示していた場合は、元の試料中に存在する反応抑制剤が存在する可能性があります。定量PCR反応制御が適切に実行しなかったので、この場合、試験結果は、CMVの検出のために不確定であろう。 水は、ターゲット·コントロール（NTC）が目標の増幅を示していない場合は、最初の実行の陽性率を分析することをお勧めします。ランが通常よりも高い陽性率を有している場合には、任意の試薬操作は、任意の潜在的な環境汚染を識別するために実行される領域のスワイプテストを実行することが推奨されるであろう。環境汚染が排除されている場合は、使用いつもポジティブコントロールと一緒に新しくオープンした水管理。新しく開かれた水対照増幅産物を示さない場合には、前回の水制御が標的配列で汚染された可能性がある。この新しい水の制御が再び汚染されている場合は、それが標的配列と汚染される試薬又はフードのいずれかまたはすべての可能性を高める。この場合には、処理中に使用されるすべてのフードを除染してから（正及び水）のコントロールの新しいセットを実行している中で、すべての新しい試薬を使用するのがベストでしょう。問題が解決しない場合は、処理区域とフードのワークフローだけでなく、製品メーカーと連絡の再評価が行われる必要があります。 品質基準（QS）は増幅中に適切なコピー数を示さない、実行に含まれている場合は、最初にすべてのQS（4、3、2、1、及びQS4の1:10希釈）を実行することをお勧めします。これらの基準は、適切な範囲内にある場合は、繰り返しサンプルは、既に適切なコントロールで指定された。 QSが適切な範囲内に入らない場合は、プロトコル（3.4）の品質管理のセクションで説明したように新たな標準曲線を生成する。問題が解決しない場合は、現在の、または新しいロット番号の新しくオープンしたのQSで新しい標準曲線を生成する試みられることがあります。これらの手順が失敗した場合、製造業者と連絡をすることは保証されます。 ゴールドスタンダードとして、従来の方法（H＆EとIHC）を用いた計算に基づいてGI生検においてCMVを検出するための定量PCRの感度および特異性はすぐに診断利点を示さないが​​、ゴールドスタンダードとして、より分析的に敏感な定量PCR法を使用すると、大幅にこれらを改善する計算5。さらに、18あいまいな生検の14（78％）が、この研究でqPCRにより、CMVの陽性反応。それは、これらの点は定量PCRは、H＆いずれよりもはるかに敏感であるという概念をサポートして感じられる一人でE、または消化管生検材料におけるCMVの検出に、IHCと組み合わせて使用​​する。さらに、曖昧なIHC染色パターンを有する場合には、追加のレベルを得ることは現在の標準的な方法と比較して、任意の添加有益である可能性は低い。 一緒になって、定量PCRは、FFPE消化管生検組織におけるCMV感染を検出するために、高感度で特異的である。特に有用なあいまいなCMV IHC染色パターンやCMVのための臨床的に非常に疑わしいと消化管生検での定量PCRのパフォーマンスです。従来の組織学と比較して、GI生検材料の定量PCR試験は、このように、以前の、より効果的な患者管理に導く、短時間で正確な診断を容易にすることができる。

臨床検体中のサイトメガロウイルス（CMV）感染の解釈は非常に重要である。 CMVはヘルペスウイルスのbetaherpesvirinaeサブファミリーのメンバーである。他のヘルペスウイルスと同様に、CMVはアクティブなウイルス複製1の欠如を特徴と持続性または潜伏感染を確立する能力を持っています。ウイルスの再活性化は、疾患の症状2-4を伴うことがあるビリオン放出を特徴と活発なウイルス複製につながる、ストレスや他の免疫抑制の時間帯に発生する可能性があります。胃腸（GI）のCMV疾患の症状が頻繁に腹痛および/ ​​または血便1が含まれています。 組織学によるCMV胃腸炎の診断は、CMVウイルスの介在物を同定するためにヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）を利用する。臨床的疑いが高く、まだ明らかな介在物が観察されない場合において、免疫組織化学（IHC）は、しばしば補助試験法として使用される。しかし、IHCまた、解釈が難しい（ 図2）5作る珍しい非古典登場する携帯染色パターン（あいまい）によって妨げられることができる。なお、GI生検においてCMVを検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）GI生検組織および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）から抽出したDNAを使用することが求​​められていた。この技術は、GI生検においてCMVの検出に貴重であることが示されており、曖昧なIHC染色ケース5,6において特に有用であるれている。また、定量PCRはまた、6利用可能になった追加のCMV臨床試験データとよく相関することが示されている。 CMVの検出に定量PCRの使用は、CMVのための臨床的疑いが高い場合での早期診断と治療につながる可能性がありますが、H＆EおよびCMV IHCは陰性である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

これは、重症感染症を開発するための彼らの大きなリスクを考えると、胃腸（GI）免疫抑制患者の管内でのサイトメガロウイルス（CMV）感染を識別することが重要です。 CMV感染の検出のための多くの実験室方法は、血清学、ウイルス培養、および分子の方法を含む、開発されている。多くの場合、これらの方法は、CMVによる全身の関与を反映し、特に局所的な組織の関与を特定していない。したがって、GI管におけるCMV感染の検出は、しばしば、生検組織の伝統的な組織学によって行われる。免疫組織化学（IHC）に連動して、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色は、これらの生検を調べた柱が残っている。 H＆EおよびIHCは時々の解釈を困難にし、非定型（あいまい）染色パターンになる。これは、CMVの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）が正常に非常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織生検を行うことができることが示された高い感度および特異性。このプロトコルの目的は、臨床検査の設定でのFFPE生検組織におけるCMVの検出のための定量PCRテストを実行する方法を示すことです。この方法は、GI生検におけるCMVのための曖昧な染色例の患者のために非常に有益である可能性が高い。

228組織ブロックの合計91サイトメガロウイルス（CMV）陽性組織学および陽性免疫組織化学（IHC）に基づいてケース、あいまいCMV IHC 18、および79ネガティブコントロールで構成された定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により試験した。 図2に示すように、CMV陽性症例は、典型的なCMVウイルス封入体（A）および/ ​​または陽性IHC染色（B）を実証しているであろう。ネガティブコントロールがない不審な組織学またはIHC染色5を示さなかったであろう一方、疑わしいケースは、稀な、非古典的な登場染色パターン（C）を証明したであろう。 組織病 ​​理によるCMVのための肯定的な91検の、88は定量PCR（ 表2）で陽性であった。伝統的な組織学に基づいた真陽性の定義では、典型的なCMVウイルス介在物および/ ​​または一般的なCMV IHC、すなわち 、これらのデータは、96.7％の感度をもたらした。 <pCMV IHCによるウイルス介在物と負のためすなわちネガティブ79ネガティブコントロール生検（35正常な結腸、25大腸炎、および19十二指腸炎）クラス= &quot;jove_content&quot;&gt;、、78が陰性と1の特異性で、その結果、定量PCRによる陽性反応98.7％。 あいまいなCMV IHC染色で18の14（78％）の生検をqPCR 5によって、CMVの陽性反応。これらの18曖昧な例の中で、11は追加の生検は、組織病理により、CMV陽性であった同じ日を取っていた。これらの14定量PCR陽性サンプルの中で、10は生検は、組織病理学上、CMV陽性であった同じ日を取っていた。テスト18あいまいな生検の、11は、生検が取られた時間の7日目または以内に提出他の標本上のCMVテストに関する追加臨床情報を持っていた。これらの11例の中では、8（73％）が定量PCRにより、CMVの陽性反応。これらの11の生検の、5（45％）が追加の正のCMV検体で定量PCRにより陽性反応を示した。 3（27％）POSITをテスト陽性CMV標本とqPCRによりIVE; 3（27％）、追加の負のCMV検体で定量PCRによって陰性であった。 上述したこれらの研究に加えて、追加のヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）のレベルを求めるかどうかを決定することは興味深いことであったしても、ウイルス介在物が最初にH＆Eで見られず、CMV IHCが曖昧であるれている場合には有益であろう。したがって、あいまいなCMV IHC 18ブロック毎にH＆Eレベルの5倍を行った。 2人の病理学者を注意深くこれらのケースを検討し、追加スライド（データは示していない）のいずれかで識別可能なウイルス介在物を同定することができなかった。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="805"><tbody><tr><td colspan="7">発音リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応パラメータ</td></tr><tr><td colspan="7">セットアップ読み： </td></tr><tr><td>デフォルトのチャネル</td><td>温度を求める</td><td>マックスは、POSシーク</TD&gt; <td>楽器の種類</td><td>キャピラリーサイズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 530 </td><td> 30°C </td><td> 12 </td><td> 6チャンネル</td><td> 20μL </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7">プログラム名：酵素の活性化</td></tr><tr><td colspan="7">サイクル数：1 </td></tr><tr><td colspan="7">解析モード：なし</td></tr><tr><td>ターゲット°C </td><td> HHを保持：MM：SS </td><td>ランプ·レート</td><td>秒ターゲット</td><td>刻み幅</td><td>ステップ遅延</td><td>収集モード</td></tr><tr><td> 95 </td><td>午後十二時十分00秒</td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td>なし</td></tr><tr><td colspan="7">プログラム名：タッチダウンステップ</td></tr><tr><td colspan="7">サイクル数：10 </td></tr><tr><td colspan="7">解析モード：なし</td></tr><tr><td>ターゲット°C </td><td> HHを保持：MM：SS </td><td>ラムPレート</td><td>秒ターゲット</td><td>刻み幅</td><td>ステップ遅延</td><td>収集モード</td></tr><tr><td> 95 </td><td>夜12時00分05秒</td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td>なし</td></tr><tr><td> 65 </td><td>午後12時○○分20秒</td><td> 20 </td><td> 55 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td>なし</td></tr><tr><td> 72 </td><td>午前0時00分15秒</td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td>なし</td></tr><tr><td colspan="7">プログラム名：DNAの増幅</td></tr><tr><td colspan="7">サイクル数：40 </td></tr><tr><td colspan="7">解析モード：定量</td></tr><tr><td>ターゲット°C </td><td> HHを保持：MM：SS </td><td>ランプ·レート</td><td>秒ターゲット</td><td>刻み幅</td><td>ステップ遅延</td><td>収集モード</td></tr><tr><td> 95 </td><td>夜12時00分05秒</td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td>なし</td></tr><tr><td> 55 </td><td>午後12時○○分20秒</td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td>シングル</td></tr><tr><td> 72 </td><td>午前0時00分15秒</td><td> 10 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td>なし</td></tr><tr><td colspan="7">プログラム名：冷却</td></tr><tr><td colspan="7">サイクル数：1 </td></tr><tr><td colspan="7">解析モード：なし</td></tr><tr><td>ターゲット°C </td><td> HHを保持：MM：SS </td><td>ランプ·レート</td><td>秒ターゲット</td><td>刻み幅</td><td>ステップ遅延</td><td>収集モード</td></tr><tr><td> 40 </td><td>夜12時00分30秒</td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td>なし</td></tr></tbody></table> 表1に示すパラメータはcytomegaloviを検出するためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のセットアップ中に目標温度、サイクル数、サイクルの長さに関するガイドラインとして使用されるべきである<html>ホルマリン固定、パラフィン包埋胃腸生検におけるRUS。これらのパラメータは、測定器のモデルやメーカーによって最適化が必要な場合があります。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528"><tbody><tr><td>組織学陽性例</td><td> PCR陽性ケース</td><td>感度</td><td>組織学陰性症例</td><td> PCRの陰性症例</td><td> Specitivity </td></tr><tr><td> 91 </td><td> 88 </td><td> 96.7％ </td><td> 79 </td><td> 78 </td><td> 98.7％ </td></tr></tbody></table> ホルマリン固定、パラフィン包埋、胃腸生検におけるサイトメガロウイルスの検出にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）の表2感度（96.7％）および特異度（98.7％）。この表ら 5マッコイから変更されている。 es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg &quot;幅=&quot; 400 &quot;/&gt; 図1。カセットクランプAに正しく装着されて組織ブロックの典型的なミクロトーム）生検組織の10ミクロンの厚さの部分を遮断するなど、それは、スクロールBにロールを許可されている）、マイクロチューブCに転送されます）。生検組織のすべての5つのスクロールはDNA抽出のために単一の微量遠心管に入れる。 <img alt="図2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51570/51570fig2highres.jpg" width="400" /> 図2の矢印（原倍率400X）で示すように豊富な、典型的なCMV封入体を示す結腸生検。A）ヘマ ​​トキシリンおよびエオシン染色切片。B）CMVが期待IHC染色パターンを示すに対するモノクローナル抗体で染色した結腸生検（原倍率400倍）。 <st栄&gt; C）の矢印（元倍率400X）で示され、単一の、小さな弱く染色された細胞との不確かなIHC染色を示す結腸生検、。この図は、マッコイら 5からの許可を得て転載しています。

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qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K ビュー.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

生物学

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

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