我々はImaris、Imaris XTとMatlabの使用のためにカリフォルニアの生体イメージング技術開発センター（BIDC）大学サンフランシスコ校に感謝します。我々は、原稿の編集への貢献のためにLK Floren、L. Daitch、技術支援のために、ヘンリーVでKharaziaに感謝します。 1R21DA029966-01と薬局のSEBは、UCSFの学校にMLSMRコレクションをスクリーニングするためのNIHのファストトラック賞（：この作品は、SEB、国立衛生研究所（NIH）にUCSFを通じてアルコール＆薬物乱用のカリフォルニア医学研究の国家からの資金によって支えられディーンのOfficeと臨床薬学）とCLHKに医学部（臨床薬理·実験治療）。

1。シングルセル表現型変化の三次元形態計測分析<ol><li>ヒト胚腎臓（HEK293）細胞をトランスフェクションした赤血球凝集素（HA）コルチコトロピンとしてGタンパク質共役受容体（GPCR）は、以前4 5因子受容体2（CRF-R2）の説明解放タグ付き。 </li><li>細胞は、AS（CRF-R2の内因性リガンド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、CRF（1μM、30分）、または選択CRF-R2の拮抗薬、抗ソーバジン30で前処理で刺激し、（無治療、NT）、未処理のままにした-30、1μM、アゴニスト処理前30分）。 </li><li>次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗HAで処理した。 CRF-R2はアレクサ594 nmの抱合抗マウス抗体（IgG 1）抗体を用いて可視化した。 DAPIを核分裂段階を可視化するために使用されていました。 </li><li>実験者の主観性を制限するために、実験条件は、画像が取得され、分析された後まで知られていなかった。 </li><li>我々は、画像を取得しましたプラン·アポクロマート63x/1.4油DIC目的とヴェルディ-V5レーザーとミラ900-Fのレーザーシステムで構成コヒーレント統合された二光子レーザーシステムに接続されたZeiss LSM 510 META共焦点顕微鏡を用いて固定したHEK293細胞からだ。 </li><li>データ収集プロセスの間に、細胞は両外側の細胞外受容体に核膜からのデータを含めるようにマルチスペクトルセクショニング、488 nm、および790 nmの（〜350 nmの2PH例）およびzパーティショニング（0.5μm刻み）によって区画された四肢。 </li><li>蛍光データは初の3D顕微鏡データセットの可視化とセグメンテーションを可能Imarisを使用して処理され、立方ボクセルから成る3Dモデルは形態学的分析のために作成されました。 その後、Imaris XTモジュールは、GPCRの拡張の座標点を決定するために、MATLABのコンピュータプログラム言語とのインタフェースImarisに利用されました。 アカウントセルラーばらつきを考慮するために、我々は蛍光画像鐸を取得し、分析22細胞からEN：アゴニスト治療（n = 7）の前に無治療（NT）（n = 7）で、アゴニスト（CRF）の治療（n = 8）および拮抗薬による前治療（AS-30）（ 図2） 。 <ol><li>関心領域（ROI）は、アクティブ分裂の段階ではなく、他の細胞に接近していない一つのセルを含める必要があります。このように、分析は1つの核とレセプターの拡張子を持つ細胞が他の細胞の近接によって乱されていないが含まれます。 </li><li>細胞の3D構造は、第1 Imaris（v.7.1.1）を使ってマルチスペクトル蛍光データから再構築されました。 </li><li> Imarisによって設計されたアルゴリズムに続いて、第一面のレンダリングは核膜を表すために利用された。 ROI内の複数の核がある場合Imarisあるかどうかを判別します。 </li><li>次にスポット作成のアルゴリズムは、CRF-R2の拡張子を検索するために利用された。それがバックグラウンドノイズとの不規則な強度を補償するため、スポットの検出を利用したアモルファス状の細胞の複雑なネットワーク。 </li><li> CRF-R2の蛍光検出の各ユニットの含有を最大化するために、スポット &#39;直径はガウシアンフィルタを用いて測定された強度の形で明確な情報を推定する画像内の最小単位である0.2μm以下に設定した。スポットフィルタリングがスポット自動作成プロセスに組み込まれました。ソフトウェアは、しかし、ユーザにパラメータを定義するには、フィルタを使用するための柔軟性を与える。 </li><li>データの切り捨てを回避するために、データ·セットは、32ビットの小数に、8ビット（符号なし）固定点から変換された。 </li><li>ボクセル強度データは、MATLABとのインタフェースImaris XTのモジュールを使用して座標データを発見するために交換し、各スポットの正確な空間的位置は、基準点（ 図3）のように核膜を用いた距離変換を実行することによって決定された。 </li></ol></li><li>得られたデータは、sのためのグラフィカル形式で定量化し、提示することができるtatistical分析。群間の比較は、二元配置ANOVAとBonferroniの事後テストを用いて行った。データは平均±SDとして提示されます。違いは、* p &lt;0.05で有意であると見なされている。計算は、GraphPad Prism 5.02（ 図4）を用いて行った。 </li></ol> 2。代表的な結果我々のアプローチの力を発揮するために、我々は細胞の変化を定量化しているGタンパク質共役受容体（GPCR）と副腎皮質刺激ホルモン放出因子、トランスフェクトしたHEK293細胞での内因性リガンドとレセプターのCRF-2（CRF-R2）の相互作用から生じる。 我々は、CRF-R2受容体は細胞（ 図2Aおよびムービー1）の膜の有限地域から原形質膜とプロジェクトに配置されていることを示している。従来の2次元解析を用いて、それは我々が受容体の接着poを分析する場合にのみ、外CRF-R2受容体のこの部分集合を検出することが可能であるガラス上のintはカバーしています。その結果、私たちは、Z-スタック型マルチスペクトルデータ（ 図5）から派生した他の情報が失われます。 形質膜からスポットまでの距離の減少によって示されるように、細胞はCRFで処理されると、細胞外受容体は大幅に削減されます。彼らはまた、主に有限の場所から離散した位置（ 図2Bと映画2）の数に再配布されます。 レセプター膜分布にCRFの効果は、CRF-R2の特異的アンタゴニスト、antisavagine 30（AS-30）を用いた前処理により防止と私たちは、CRF-R2の拡張子は（ 図2Cおよびムービー3）変更しないことを見つけることです。 スポットの遠位分布は、5μmのスペクトル色分けされた間隔でプロット核膜からボクセルの距離を視覚化するために利用される。無治療と拮抗pretreatmんENT（AS-30、1μM、30分）アゴニスト治療の前には（CRF、1μM、30分）、GPCRの収縮に有意（ns）の違いを示していない。アゴニストで細胞を処理（CRF、1μM、30分）が徐々に無治療と比較したCRF-R2の含有ボクセル、0から5ミクロン（ns）で、6月15日程度（の数を減らし**はp &lt; 0.01）、&gt; 15μm以下（*** P &lt;0.005）、またはAS-30治療、0から10ミクロン（ナノ秒）、11から15ミクロン（** p &lt;0.01）とに比べて&gt; 15ミクロン（*** P &lt;0.005）（ 図4）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> 図1。現在利用可能な技術と蛍光画像を分析する彼らの限界の図は<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt;図2アゴニストおよびアンタゴニスト処理前と処理後のHA-CRF-R2を使用して、HEK293トランスフェクトされた細胞の3次元マルチスペクトル蛍光画像。マージされたイメージを示す抗HAを使用して、HA-CRF-R2は、プローブおよびAlexa 488標識抗マウス抗体（IgG 1）二次抗体を用いて可視化し、DAPIで核を可視化するために使用されていました。画像は、共焦点レーザー走査（CLS）に顕微鏡を用いて取得した。スケールバーは5μm。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> 図3：HA-CRF-R2を使用して、HEK293、トランスフェクトされた細胞の3次元モデルがImarisソフトウェアを使用して、CLSの画像から再構築。小胞に変換GPCRの拡張を記述する核とスポット作成の表面レンダリング。蛍光データは初の3D顕微鏡データセットの可視化とセグメンテーションを可能Imarisを用いて処理した。その後、Imaris XTは、MATLABとのインタフェースImarisに利用されました。ボクセル強度に交換しましたスポット座標。スポットスペクトル色分け（青0から5ミクロン、緑、6-10ミクロン、11から15μmの黄色と赤&gt; 15μm）の距離形核膜を表しています。スケールは5μm。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> 図4スポットの遠位分布のグラフィック表現が5μm間隔でコード化されたスペクトル色にプロットは核膜からボクセルの距離を視覚化するために利用される。アゴニスト処理前の拮抗（AS-30、1μM、30分）（CRF、1μM、30分）と無治療と前処理は、GPCRの収縮に有意（ns）の違いを示していない。治療なし0から5ミクロン（ns）で、6月15日程度（**はpと比較した場合、アゴニストで細胞を処理（CRF、1μM、30分）は、徐々に数CRF-R2を含むボクセルの距離が短縮され&lt;0.01）、&gt; 15μm以下（*** P &lt;0.005）、またはAS-30 0から10μmの治療（ns）で、11月15日<html>ミクロン（** p &lt;0.01）および&gt; 15ミクロン（*** P &lt;0.005）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> 図5：HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の二次元形態計測分析の限界。核の中心を示す細胞の中央平面部（ガラスカバースリップ上の3-4μmで）はDAPIおよびHA-CRF-R2を用いて可視化抗-HAを使用してプローブとAlexa 488nmの結合抗マウス抗体（IgG 1）二次を用いて可視化受容体の付着点が劇的に異なっていながら、抗体とCLSで取得したが、（A）は無治療（NT）と（B）のアゴニスト（CRF、1μM、30分）の間に違いを見せていない。 映画は1。自由受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価するために、HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の&quot;サーパス&quot;モードでは、無治療で3Dモデルを回転させる。 5〜20μmであるからスケールバー。/ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;ムービーを見るにはここをクリックしてください。 映画は2。自由受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価するために、HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞、アゴニスト処理、CRF（CRF、1μM、30分）の&quot;サーパス&quot;モードで3Dモデルを回転させる。 5〜20μmであるからスケールバー。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">ムービーを見るにはここをクリックしてください。</a> ムービーのHA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の&quot;サーパス&quot;モードで3。自由に回転する3D、アゴニスト処理前の拮抗薬を用いた前処理（AS-30、1μM、30分）（CRF、1μM、30分）受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価する。 5〜20μmであるからスケールバー。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">ムービーを見るにはここをクリックしてください。</a>

<ol>
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特別な利害関係は宣言されません。

我々は、CRFの治療は、その形態やCRF-R2の位置に大きな変化を誘導することを示した。 CRF-R2の変化は選択的アンタゴニスト処理により抑制された。我々は、受容体の変更が検出されなかった、標準的な2Dマルチスペクトル技術を用いて測定することができないことを示した。複雑な3D映像を勉強する能力が形態学的分析のための生物学的パラメーターの複雑さを取り入れることが重要です。我々は、一貫性のない蛍光ネットワークコンポーネントとの事前に定義された形状はなく細胞の3次元測定を行うことができました。ユーザーによる変更が可能な自動化された方法の私達のスイートは、細胞動態に関する情報を抽出するために、その環境内の個々のアモルファス状の細胞内の分子動態を定量化することを可能にします。このツールは、阻害剤の存在下で細胞経路と細胞形態の変化に関する薬理化合物の効果についての予測を行い、細胞の生存に関する情報を提供するために助けることができます。 当社の3D定量法の利点は、それが広範な生物学メカニズムの専門知識が、コンピュータコードに精通していない、と研究者は、コンピュータのアプリケーションと顕微鏡技術をインタフェースすることができるということです。我々はセル6の人口を反映した情報を明らかにするために、単一セルの測定を行った。単一セルの測定は、他の細胞との近接によって動じない複雑な形をした細胞の分析を提供してくれます。この方法は、細胞形状の変化や化学stimualtion 7,8後の膜結合タンパク質の位置を検討する上で科学者を支援するでしょう。細胞の分析では、その細胞外肢に対する細胞内核の区画からのデータを含める必要があります。 2D画像から得ることができる最大のデータを含めることはセルの中央面を横切っていますが、核と細胞膜の最も外側の位置が異なるz平面上に配置され、2Dの可視化は切り捨て画像。核は3〜4μmのガラスカバースリップ上に配置されている細胞接着ポイント、上方に配置されているように、データの拡張量は失われます。この受容体は空間的な再編成が唯一の3D画像で見られ、分析せずに定量化することができませんすることができます。このツールは、2Dデータによって断片化の代わりに、全体としてのセルラーシステムに対応して情報を提供し、従来の2次元的な分析技術を用いて検出されていない細胞の変化を視覚化して測定するための新しいアプローチを提供します。その他記載された技術9と一緒に、単一細胞を測定するためのこのアプローチは、私たちは携帯ダイナミクスと細胞の可塑性の基盤の複雑さを調べることができます。 このメソッドは、Imarisに限ったことではないとコンピューティング言語のソフトウェアとのインタフェースの任意のデータ可視化ソフトウェアに適用することができます。システムへの将来の改善が生きているから取られた3次元の細胞の形態学的分析が含まれます細胞化学的固定や化学染色せずに、自然な状態でセル全体の検査を可能にする。我々は時間をかけて同じセルに表現型の測定を定量化することができるので、生きた細胞の画像を取得することも、細胞間のばらつきをなくすことができます。 我々は、他の科学者が定量イメージング技術のギャップを埋めるのに役立ちます、明記していない形の細胞の構造を測定するために、その可能性と、私たちのプラットフォーム技術を信じています。この新しいアプローチは、他の単一セルのプロファイリング10、創薬プロセスのための補助ツールとして、この細胞ベースアッセイを作り、多数の単一細胞表現型変化の特性評価に適用可能である。このプラットフォームが進化するにつれ、細胞形態がすでに、小分子阻害剤11を識別するためのハイスループットスクリーニングに利用されているので、このメソッドは同じpharmacologiに影響を与える単一細胞からの用量応答曲線を決定するために有用であることを期待calは、ターゲットが、異なる作用機序を持つ。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ヒト胚腎臓（HEK293） </td><td>アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクション</td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>インビトロジェン</td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488（IgG2bで） </td><td>インビトロジェン</td><td> -11001 </td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗HA.11抗体（IgG 1） </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td>シグマ</td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30（AS-30） </td><td>シグマ</td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images

蛍光画像を測定するための最も一般的なソフトウェア分析ツールは、2次元（2D）のデータポイントの包含と除外のためのマニュアル設定に依存するデータ、分析の解釈と所見をサポートするためにコンピュータ支援パターン認識のためのものです。それは、細胞ダイナミクスの複雑さをキャプチャし、生物系内の細胞の可塑性の基礎を理解することができるようにするために、3次元（3D）データセットから構成され、蛍光像を測定することができるようにすることがますます重要になってきている。洗練された顕微鏡の楽器は、マルチスペクトル蛍光画像の取得と、収集した2D画像の3D表現を提供する共焦点スタックから画像を再構成する強力な解析ソフトウェアを介して3次元蛍光画像の可視化を許可されています。先進的なデザインをベース立体学法は、原送信の近似や仮定から進展している複雑な組織切片でも2リットルモデルベースの立体学1。顕微鏡でこれらの科学的進歩にもかかわらず、必要性が完全に細胞形態、タンパク質の局在化と受容体の輸送の複雑な変化の分析と定量化を可能にするために本質的な3Dデータを活用して自動化された分析方法のために残してあります。 蛍光画像を定量化することが可能な現在の技術は、メタモーフ（Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール）とマニュアル分析を提供する画像J（NIH）を含む。 Imaris（アンドール·テクノロジー、ベルファスト、北アイルランド）ソフトウェアは、ボリューム·イメージに入れたり、3Dオブジェクトを作成するには、2Dスライスのシリーズで描くことができる測定ポイントの手動作成を可能にする機能MeasurementProを提供します。このメソッドは、2つのオブジェクト間のラインの距離を測定したり、関心のある領域を囲むポリゴンを作成するためにシングルクリックポイント測定に便利ですが、それはCOMPLに適用することは困難である旧セルラーネットワーク構造。フィラメントトレーサー（アンドール）ただし、このモジュールはそのような樹状突起、軸索と棘（構造木のような）で構成されている神経細胞のように定義された構造を測定するために開発されたフィラメント状の3D神経を自動的に検出します。このモジュールは、巧妙に非神経細胞3への形態学的測定を行うために利用されているが、出力データではなくアモルファス状の細胞モデルというより定義されたセルの形状に依存するソフトウェアを使用して拡張セルラーネットワークの情報を提供します。アモルファス状の細胞を分析し、生物学的なアプリケーションへのソフトウェアは、より適切な意思の問題を克服するために、ImarisはImaris Cellを開発しました。これは、細胞内小器官との間の関係を計算するために開発されたEidgenössische工科音楽大学との科学的なプロジェクトだった。ソフトウェアは、セルごとに1つの原子核を強制することにより、生物学的な制約の検出を可能にしますが、およびセグメント細胞に細胞膜を使用して、それが理想的には空隙なしで細胞表面を作成するため、連続していない蛍光データを分析するために利用することはできません。我々の知る限り、現時点では3Dの蛍光画像から地形情報を提供するには、ユーザーによる変更が可能な自動化されたアプローチは、未定義の形状（ 図1）の細胞空間情報を達成することが開発されていない。 我々は、MATLAB（マットワークス株式会社）にインターフェースImarisコアソフトウェアモジュールとImaris XTを使用して分析プラットフォームを開発しました。これらのツールは、事前定義された形状とすることなく、一貫性のない蛍光ネットワークコンポーネントを持つ細胞の三次元計測を可能にします。さらに、この方法は、コンピュータのアプリケーションに精通している生物学的システムの専門知識を拡張しますが、していない研究者は、細胞動態の形態学的変化の定量を行うことができます。

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An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

我々は、単一細胞の三次元共焦点蛍光から取ら未定義形状の形態の変化を測定するためにImaris神経科学、ImarisXTとMATLABを利用したソフトウェアプラットフォームを開発しました。この新しいアプローチは、受容体活性化に続く細胞形状の変化を定量化するため、創薬のための可能な追加ツールを表すために使用することができます。

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K ビュー.  University of California, San Francisco. 我々は、単一細胞の三次元共焦点蛍光から取ら未定義形状の形態の変化を測定するためにImaris神経科学、ImarisXTとMATLABを利用したソフトウェアプラットフォームを開発しました。この新しいアプローチは、受容体活性化に続く細胞形状の変化を定量化するため、創薬のための可能な追加ツールを表すために使用することができます。

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

生物学

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

ラットにおける乳腺の形態と乳癌リスクの変化

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.

ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...