作者は感謝して工科大学ブラウンシュヴァイク、ドイツで &quot;遺伝子から製品への&quot;共同研究センターSFB 578を介してドイツ研究協会（DFG）による財政支援を認める。

1。栽培の原子炉のセットアップおよび開始合計4つのバイオリアクターの栽培が行われています。 <ol><li> Aの栽培に2.2 Lの作業ボリュームで3 L攪拌タンクバイオリアクターを使用して、 ニジェール SKAn1015。 </li><li>反応器に72.6グラムのグルコース一水和物を注ぐと1.9 Lの脱イオン水でそれを埋める。 </li><li>例えば、3バッフル、2つの6枚羽根ディスクタービンインペラ、pH電極、エアフィルター、冷却指、エアフィルター、エアフィルターの無菌サンプリングのための液浸管と排気クーラーガス入口として原子炉装置の設置培地、接種、酸と塩基およびインレットホース。 </li><li> 20分間121℃で反応をオートクレーブ。 </li><li>酸 - 塩基貯蔵（2 M塩酸、2 M水酸化ナトリウム）とそれに対応するポンプを原子炉に接続し、pH制御ユニットと5.0のpH値±0.05を設定します。 </li><li>冷却水システムで原子炉をリンクし、加熱ジャケットを置く原子炉容器の周り。 </li><li>対応する制御ユニットと温度センサーを取り付け、37の温度を設定±0.1℃の温度制御ユニットで。 </li><li>原子炉の上に攪拌モータに合わせて、200 min -1の撹拌速度でサービスにそれを持って来る。 </li><li>滅菌インレットホースの滅菌最小限の成長媒体11トラフ1（250 mL）を追加します。培地調製のためのすべてのコンポーネントが20分間121℃でオートクレーブと一緒に混合した。 3栽培のためのコンポーネントが1グラム/ L（原子炉2）、3グラム/ L（原子炉3）と10グラム/ L（原子炉4）の濃度タルク粉末（3MgO•4SiO 2•H 2 O）が含まれています。使用する前に、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）のマイクロ粒子を再懸濁および滅菌培地に追加します。コントロール培養で（粒子なし）の50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）によるマイクロ粒子懸濁液を交換してください。 </li><li>胞子懸濁液（接種）を追加sはウーハーペニヒらに用意しました。ら（2011）11そのトラフ滅菌インレットホース（50 mL）の1その1X10 6 mLの-1に胞子量の濃度。接種は、栽培開始（H = 0 h）をマークします。 </li><li> 1.0 L min -1の速度で通気を開始します。 </li></ol> 2。 24、48、72栽培の時間後に無菌サンプリング<ol><li>小瓶チューブに無菌培養液50mLを取る。 </li><li>バイオマス乾燥重量、β-フラクトフラノシダーゼ活性の測定と顕微鏡分析用のサンプルを使用しています。 </li></ol> 3。 24時間、48時間および72時間後の栽培バイオマス乾燥重量の測定<ol><li>バイオマス試料は、少なくとも二重に取られることです。 </li><li>重量デシケーター中で乾燥後、マイクロスケールのセルロースフィルターと接続された水ジェット真空ポンプをブフナー漏斗にフィルタを配置します。 </li><li>定義されたサンプル量（例えば10 mL）でフィルタリングndはバイオマスから培地化合物を除去するために10 mLの脱イオン水でフィルターを洗浄してください。 </li><li>しわフィルタ一度途中で、ガラスのペトリ皿に入れて体重不変（少なくとも24時間）までコンパートメント乾燥機に入れます。 </li><li>デシケーター中でフィルタを冷却して重量を測定します。 </li><li>使用されるサンプルの体積で割った乾燥バイオマスの有無にかかわらず、フィルタの重量の差としてバイオマス乾燥重量を計算します。 </li></ol> 4。 24時間後GOD / POD-エッセイによるβ-フラクトフラノシダーゼの細胞外酵素活性の測定、48、栽培の72時間一緒に働きながら常に氷上でサンプルを格納します。 <ol><li>フィルタ1.5 mLの培養懸濁液トラフ反応管にフィルターを介して注射器で培養懸濁液を押すことにより、セルロースアセテートフィルター。使用するまで-20℃で反応管を格納します。 </li><li>反応混合物の使用20サンプルμLおよびスクロースからグルコースへの反応を開始するには0.05 Mリン酸緩衝液（pH 5.4）に溶解した1.65 Mショ糖の200μLを追加します。少なくとも複製に反応出キャリー。 </li><li>加熱ブロックで20分間40℃で反応混合物をインキュベートします。加熱ブロックで10分間95℃でインキュベートして反応を停止します。氷の上にそれを格納することによって、反応混合物を冷却し、4℃で10分間13.000グラムで遠心分離によって凝縮水をスピンダウン℃に</li><li> pHとグルコース、ショ糖の温度依存性の切断を考慮して、20μLの脱イオン水の代わりに、20μLのサンプルを使用してブランク値を実施しています。 </li><li>培養液中の残存グルコースを考慮して、各サンプルの負の制御を行う。そのエンドユーザーによる使用20種類のサンプルのμL及びスクロースを追加し、ステップ4.3で説明をインキュベートする前に、10分間95°Cで加熱することによりβ-フラクトフラノシダーゼを失活させた。 </li><li>次のような測定そのサンプルの希釈ured吸着は、キャリブレーション値の範囲内です。 </li><li>三重のすべての酵素アッセイを実施しています。ウェルマイクロタイタープレートに2μL希釈したサンプルを適用します。代わりに2μLのサンプルの10個の異なるノウハウ濃度（1 mMから15 mMまで）で10グルコース溶液2μLを使用して、それぞれがマイクロタイタープレート上に校正用の標準の範囲を適用します。ゼロ点の校正は、2μL脱イオン水の代わりに2μLのサンプルを使用しています。 </li><li>マルチピペットを用いて各ウェルに試薬溶液200μLを追加します。 </li><li>室温で10分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 6でマイクロタイタープレートを保存する度測定（最大で数時間）までC。 </li><li> 96ウェルサンライズマイクロプレートリーダーとマゼランのデータ検索ソフトウェアを使用して450nmにおける吸収を測定します。最大5秒まで混合時間を設定します。最大1秒までと残りの期間。 </li><li>スプレッドシートと結果チャートを開き、標準の範囲を使用して検量線を作成する： グラムlucose濃度= 1 X + bの吸収 </li><li>アクティビティを計算します。 活動=（吸収X希釈因子ブランク値）X A + B </li><li>サンプルの活動と適切なネガティブコントロールとの差を計算することによって、β-フラクトフラノシダーゼの活性を把握する。 </li><li>アカウントバイオマス乾燥重量とβ-フラクトフラノシダーゼ活性を11にとることによって次のように使用するための特定の生産性を計算します。 </li></ol> 5。栽培の72時間後に顕微鏡や自動画像解析<ol><li>場所は約3 mLの培養プラスチックペトリ皿中の懸濁液と形態学的構造が分離されるまで、生理食塩水でそれらを希釈してください。 </li><li>内蔵または接続されているカメラを備えて顕微鏡下でペトリ皿を置く。サンプルあたりの形態構造の約100の画像（ 図2）を取得して保存します。各画像に少なくとも一つのオブジェクトが完全に描かれていることに注意を払う。 </li><li>画像処理プログラムImageJは12と同じサンプルのすべての画像を開きます。プロセスツールの&quot;Makeバイナリ&quot;（ 図2）を使用して白黒に画像を変換します。画像のシリーズ全体にコマンドを適用するため、次のようにマクロのコードを使用します。 実行（、、バイナリを作る&quot;） </li><li>再びImageJを使用して処理バイナリイメージを開きます。形状因子フェレの直径、投影面積、周囲長、円形度、アスペクト比、分析ツールの &quot;Set測定&quot;を持つすべてのイメージのための真円度のundの堅牢性を計算します。セリにコマンドを適用するための画像のESは、次のようにマクロのコードを使用します。 ラン（ &quot;8ビット&quot;）; ラン（ &quot;バイナリを作成します&quot;）; 実行（ &quot;SETスケール...&quot;、 &quot;距離= X知られている= 1000ピクセル= 1単位=ミクロングローバル&quot;）; （ &quot;セットの測定...&quot;、 &quot;領域境界形状フェレの上限の表示は=なしの小数= 3をリダイレクトする&quot;を参照）を実行; （ &quot;粒子を分析...&quot;、 &quot;サイズ= 10000無限の真円度= 0.00から1.00のshow =表示をアウトライン&quot;）を実行します。 スケールバーを越えて直線を作成することにより、1000μmのに相関画素数としてXを決定します。 μmの中のスケールバーの長さの直線の画素数を関連付けることができます。 </li><li>スプレッドシートと各画像の形状係数の値を含む結果チャートを開きます。画像ごとに次のように形態の数を計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li>の値と考慮つのサンプルのすべての画像を取って形態番号の標準偏差を意味します計算します。 </lI&gt; <li>特定の生産性モルフォロジー数のグラフィカルな相関のグラフとデータ解析プログラムを使用して、数学的回帰による数学的関係を決定します。 </li></ol> 6。代表的な結果タルク微粒子Aの追加によりニジェール SKAn 1015形態が真のペレット形態から分散した、あるいは菌糸の形態に変更されます。ペレットの形態は、標準的な条件で展示されているのに対し、菌糸形態がタルク微粒子の10グラム/ L（ 図4）と培地の補充によって作成されます。同時にβ-フラクトフラノシダーゼの活性は3倍3から5の周りに増加します。タルク粉末の1または3 g / Lの補充は倍増フラクトフラノシダーゼ活性（ 図4）と、分散した形態につながる。 マイクロ粒子依存形態を包括的にモルによって記述することができる自動画像解析によって決定されるパラメータを使用して計算することができます。phology番号を指定します。完璧なラウンドと滑らかなペレットは顕微鏡画像で完全な円として表示されます。このような粒子のために形態番号が1の値を持ちます。菌糸形態の最小フラグメント0の形態の番号を得、一次元のラインのように簡略化することができます。細長い不規則なペレットまたは塊のようなすべての中間の形態学的形態は、したがって、0と1の間の値を持ちます。かなり大きな粒子はかなり低い形態番号11で、大規模な表面または細長い粒子と高い、真菌の粒子になります。 標準状態で原子炉1の形態は、展示約0.8モルフォロジー番号を入力します。 10グラム/ Lタルク粉末を反応器4の形態は、0.1の周りにMnを備えています。 1と3 g / Lのタルク粉濃度の原子炉2および3の形態の数は、分散したモルフォを実証し、これらの両極端の間にあるでれっと。ミクロ粒子に依存する形態が密接にβ-フラクトフラノシダーゼの生産性と関連しているので、形態の番号と図5と同様の生産性の数学的な相関が得られます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> 図1実験デザインと分析手順の全体的なスキーム。A.ニジェールは、72時間タンクバイオリアクターの攪拌3 Lに（微小粒子の有無にかかわらず）栽培されています。 24時間後、48と72ヘクタールのサンプルは再び、特定の生産性の計算に使用されているバイオマス乾燥重量とβ-フラクトフラノシダーゼの活性の測定のために取られています。 48時間後に菌の形態を顕微鏡で検査され、デジタル画像解析を特徴とする。画像解析の関連するパラメータは、数学的な特定の生産性と相関している形態の番号に結合されています。 <imgALT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：Aから形態学的構造の微視的生成された画像の画像処理のステップニジェール 。ステップ1：顕微鏡による画像取得。ステップ2：イメージの改善、必要に応じて。ステップ3：Ima​​geJのでは生成された画像の二値化、白黒（バイナリ）の画像。ステップ4：バイナリイメージによって処理され、不要なオブジェクトがクリアされます。ステップ5：形態素解析は、オープンソースプログラムImageJの &quot;分析粒子&quot;関数を使って行われている。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> 図3。 A.別の形態形追加されたマイクロ粒子の濃度に依存するニジェール 。微小粒子の濃度の増加とともにペレットのサイズは正確に小さなコア·シェル型ペレット、小さな群れも自由に分散した菌糸体にまで減少させることができるようにした。としての形態エンジニアリング液内培養におけるマイクロ粒子補給によってpergillusニジェールSKAn1015。微粒子（）は10 mg / L（B）、0.1グラム/ L（C）、0.2グラム/ L（D）、0.3グラム/ L（E）、0.6グラム/ L（F）、1.0グラム/ Lなし（G）、1.5グラム/ L（H）、2.0グラム/ L（I）、2.5グラム/ L（J）、3.0グラム/ L（K）、3.5グラム/ L（L）、4.0グラム/ L（M ）、4.5グラム/ L（N）、5.0グラム/ L（O）、10グラム/ L（P）、15グラム/ L（Q）、20グラム/ L（R）、30グラム/ L（S）と40〜50グラム/ L（T）。画像は、栽培の72時間後に光学顕微鏡で撮影された。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> 図4の依存性のフラクトフラノシダーゼ活性のタルク微粒子濃度を1g / L（原子炉2）、3グラム/ L（原子炉3）と10グラム/ L（原子炉4）。原子炉1は、微小粒子を添加したされていません。ここで栽培は、標準的な条件下で実施されています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> 図5の形態の代表的な良好な相関（R 2 = 0.91）番号と特定の生産性。形態番号は、特定の生産性（縦軸）に対して（横軸）にプロットされています。非線形回帰は指数の相関が得られます。

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	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

私は、開示することは何もありません。

菌類の形態の変更は数十年以来、バイオテクノロジーで注目されている。別の研究では、対照的に、pH値、電源入力、温度、培地の栄養素や接種濃度1として選択されたプロセスパラメータを変更しようとしたが、形態のむしろ不正確、不完全なコントロールに苦しんで、高いエネルギーコスト、抑制効果や製品の不安定ましたマイクロ粒子の補充は、粒子サイズと濃度の微調整の変動を介して菌の形態の正確なエンジニアリングを可能にします。これは、最適化のためにとAと生物工学的生産で高い生産形態のオーダーメイド設計のためのミクロ粒子を使用する新たな可能性を開きます。 ニジェールや他の糸状微生物。 デジタル画像解析は、真菌マクロ形態を特徴づけるための簡単​​な再現可能な方法です。しかし、サイズ、形状、表面特性のパラメータの様々な文献に記載されている形態学的構造のTERは、真菌形態の迅速な評価は複雑になります。関連するパラメータの組み合わせとして提示形態番号は、この欠点を回避し、形態学的構造の総合的特性評価のためだけでなく、生産性との直接的な数学の相関だけでなく、使用することができます。これが再び与えられた形態によって生産性の推定をレンダリングするため、プロセスの形態のカスタマイズが可能必要があります。 形態番号を使用して、それは様々なペレットと塊の形態4,5とを区別することが可能です。形態数の更なる発展のためにフラクタル次元の検討は有望と思われる。フラクタル次元は、オブジェクト13のプロパティを充填複雑さと質量の測定を提供し、したがって、菌糸形態の全体的な特徴付けのためにあらかじめ定めています。 CR菌糸生長フォームは以前にはるかに大きいの培養液の粘度2を示すことが示されているため、高い生産菌糸形態のeationは、しかし、特に大規模栽培でのプロセスのパフォーマンスの問題につながる可能性があります。これは、熱伝達や物質移動と高い電源入力を必要とし、1を動作させる栽培を行うとコストが高く停滞し、非混合ゾーンの形成の問題につながります。したがって、真菌の形態と培養液の粘度との関係は、形態を変更するときに考慮する必要がありますし、さらにモデルに組み込まれる。

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

糸状菌A.ニジェールは、食品から医薬品業界への工業的プロセスの広い範囲で広く使われている株である。この糸状菌の中で最も魅力的な、しばしば手に負えない特徴の一つは、その複雑な形態です。それは緻密な球状ペレットから粘性の菌糸体（ 図1）の範囲である。さまざまなプロセスパラメータと成分は菌類の形態1に影響を与えることが知られています。最適な生産性は、特定の形態学的形態と強く相関するので、菌の形態は、多くの工業生産の生産性のボトルネックを表しています。 正確に形態学的形状を制御するために、まっすぐ進むと、エレガントなアプローチでは、増加した酵素の生産2-6貢献培地に無機不溶性微粒子（含水ケイ酸マグネシウム、酸化アルミニウムやチタン、ケイ酸、酸化など）の追加です。 OBVがあるので、マイクロ粒子依存の形態と酵素生産との間のIOUの相関は、それが数学的に生産性と形態学的外観をリンクすることが望ましい。したがって、定量的な正確かつ包括的な形態学的な説明は、対象としています。 そこで、生成し、特徴づけるミクロ粒子に依存する形態学的構造を、おそらく糸状微生物の形態形成の理解に貢献する生産性（図1）真菌の形態を相互に関連付ける方法を提案する。 組換え株のA.ニジェール SKAn1015はタンクリアクターの攪拌3 Lで72時間栽培されています。 g / Lの事前接種に1グラム/ L、3グラム/ Lと10の濃度タルク微粒子の添加により形態学的構造の様々な再現性が生成されます。滅菌した試料は、酵素生産の成長の進捗状況や活動を決定するための24時間、48時間および72時間後に採取されています。ザ形成された製品は、高付加価値酵素β-フラクトフラノシダーゼ、中でもグルコース7-9ショ糖の反応を触媒する食品や製薬業界におけるネオ糖形成のための重要な生体触媒である。したがって、ショ糖を加えた後、グルコースの定量化は、生産β-フラクトフラノシダーゼの量を意味します。グルコースの定量は、96ウェルマイクロタイタープレートでハイスループット分析のために変更されたGOD / POD-アッセイ10によって行われます。 72時間後の菌の形態を顕微鏡で調べ、デジタル画像解析によって特徴付けられる。そうすることで、フェレの直径、投影面積、周囲長、円形度、アスペクト比、真円度のundの堅実さのような真菌のマクロ形態の粒子の形状因子は、オープンソースの画像処理プログラムImageJを用いて計算されています。関連するパラメータは、包括的な特性評価を可能にする無次元形態番号（Mn）が11に結合され真菌の形態。形態番号と生産の密接な相関関係は、数学的回帰で強調表示されます。

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

正確に生成すると総合的に糸状菌の形態を特徴づけるための方法<em&gt;アスペルギルスニジェール</em&gt;形態学的外観と生産性の数学的な相関を可能にする、説明されています。

のカスタマイズアスペルギルスニジェール</emタルク微粒子を添加することによって>モルフォロジー

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

19.1K ビュー.  Technische Universität Braunschweig. 正確に生成すると総合的に糸状菌の形態を特徴づけるための方法アスペルギルスニジェール形態学的外観と生産性の数学的な相関を可能にする、説明されています。

ビデオ: Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

マイクロアレイ実験のためのジベレラzeae子嚢胞子の生産とコレクション。

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

生物学

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are potent carcinogens that substantially reduce crop value in maize and other oil rich crops like peanut besides posing serious threat to human and animal health. Different approaches, including traditional breeding, transgenic expression of resistance associated proteins, and RNA interference (RNAi)-based host-induced gene silencing of critical A. flavus gene targets, are being evaluated to increase aflatoxin resistance in susceptible crops. Past studies have shown an important role of &#945;-amylase in A. flavus pathogenesis and aflatoxin production, suggesting this gene/enzyme is a potential target to reduce both A. flavus growth and aflatoxin production. In this regard, the current study was undertaken to evaluate heterologous expression (under control of the constitutive CaMV 35S promoter) of a Lablab purpureus L. &#945;-amylase inhibitor-like protein (AILP) in maize against A. flavus. AILP is a 36-kDa protein, which is a competitive inhibitor of A. flavus &#945;-amylase enzyme and belongs to the lectin&#8211;arcelin&#8211;&#945;-amylase inhibitor protein family in common bean. In vitro studies prior to the current work had demonstrated the role of AILP in inhibition of A. flavus &#945;-amylase activity and fungal growth. Fungal growth and aflatoxin production in mature kernels were monitored in real time using a GFP-expressing A. flavus strain. This kernel screening assay (KSA) is very simple to set up and provides reliable and reproducible data on infection and the extent of spread that could be quantified for evaluation of germplasm and transgenic lines. The fluorescence from the GFP strain is closely correlated to fungal growth and, by extension, it is well-correlated to aflatoxin values.&#160; The goal of the current work was to implement this previous knowledge in a commercially important crop like maize to increase aflatoxin resistance. Our results show a 35%&#8211;72% reduction in A. flavus growth in AILP-expressing transgenic maize kernels which, in turn, translated into a 62%&#8211;88% reduction in aflatoxin levels.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Here we present a protocol to analyze Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in maize kernels expressing an antifungal protein.&#160; Using a GFP-expressing A. flavus strain we monitored the infection and spread of the fungus in mature kernels in real time. The assay is rapid, reliable, and reproducible.

コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

環境学

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

生化学

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

Aspergillus oryzae, a filamentous fungus, is one of the most widely used hosts for industrial applications including large-scale production of proteins. A polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation method is generally used for the introduction of heterologous genes into A. oryzae. The conventional method typically requires three weeks for the screening of favorable transformants. Here, a new technique, the direct liquid-culture (DLC) screening method, is introduced which reduces the screening time to six days in a 200 mL flask format or to 10 days in a 24 well microplate format. The DLC screening method ensures the acquisition of positive transformants and evaluation of the secretory production of heterologous proteins in a single step, unlike the conventional screening method where two separate steps are required for the same. The protocol for PEG-mediated protoplast transformation of A. oryzae is described, which consists of five steps: preparation of fresh spore suspension, preculture, preparation of protoplasts, introduction of DNA, and DLC screening. For successful results in DLC screening, it is critical to use a nutrient-rich medium with optimized osmotic pressure. The protocol should further popularize the use of A. oryzae as a host of choice in the industrial production of proteins.

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

A direct liquid-culture (DLC) screening method has been developed which significantly reduces the time required for polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation of the filamentous fungus, Aspergillus oryzae, when employed for evaluation of the secretory production of heterologous proteins. This method dramatically increases the throughput of the evaluation protocol.

Aspergillus oryzae, a filamentous fungus, is one of the most widely used hosts for industrial applications including large-scale production of proteins. A ...

遺伝学

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

SAP-ASを用いたアーバスキュラー菌根菌の培養による観察強化

Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are difficult to manipulate and observe due to their permanent association with plant roots and propagation in the rhizosphere. Typically, AM fungi are cultured under in vivo conditions in pot culture with an autotrophic host or under in vitro conditions with Ri Transfer-DNA transformed roots (heterotrophic host) in a Petri dish. Additionally, the cultivation of AM fungi in pot culture occurs in an opaque and non-sterile environment. In contrast, in vitro culture involves the propagation of AM fungi in a sterile, transparent environment. The superabsorbent polymer-based autotrophic system (SAP-AS) has recently been developed and shown to combine the advantages of both methods while avoiding their respective limitations (opacity and heterotrophic host, sterility). Here, we present a detailed protocol for easy preparation, single spore inoculation, and observation of AM fungi in SAP-AS. By modifying the Petri dishes, high-resolution photographic and video observations were possible on living specimens, which would have been difficult or impossible with current in vivo and in vitro techniques.

著者スポットライト:SAP-AS による AM 菌類研究の強化 — 一胞子培養のための新しい技術

Here, we describe a simple and inexpensive technique for inoculating and observing arbuscular mycorrhizal fungi in superabsorbent polymer-based autotrophic systems.

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are difficult to manipulate and observe due to their permanent association with plant roots and propagation in the ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

生物工学

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

のカスタマイズアスペルギルスニジェールモルフォロジー

要約

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マイクロアレイ実験のためのジベレラzeae子嚢胞子の生産とコレクション。

コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ・ハンティエラオマネンシス

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

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マイクロアレイ実験のためのジベレラzeae子嚢胞子の生産とコレクション。

コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

高吸水性ポリマー系独立栄養系におけるアーバスキュラー菌根培養物の接種と観察

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ・ハンティエラオマネンシス

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化