Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) durch den Sonderforschungsbereich SFB 578 &quot;Vom Gen zum Produkt&quot; an der Technischen Universität Braunschweig, Deutschland zur Verfügung gestellt.

1. Reactor-Setup und Beginn der Kultivierung 4 Bioreaktor-Kultivierungen insgesamt durchgeführt werden. <ol><li> Verwenden Sie ein 3 L Rührkessel-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 2,2 L für die Kultivierung von A. niger SKAn1015. </li><li> Gießen 72,6 g Glucose-Monohydrat in den Reaktor und füllen Sie ihn mit 1,9 l entionisiertem Wasser. </li><li> Installieren des Reaktors Geräte wie 3 Schikanen, zwei Sechs-beschaufelten Scheibe Turbinenrades, eine pH-Elektrode, einen Gaseinlaß mit Luftfilter, ein Kühlfinger, einem Abgas-Luft-Kühler mit Luftfilter, ein Tauchrohr zur sterilen Probenahme mit Luftfilter und Zulaufschläuche für mittlere, Inokulum, Säure und Base. </li><li> Autoklav den Reaktor bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Verbinden Sie den Reaktor mit dem Säure-Basen-Reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) und den entsprechenden Pumpen und die Einrichtung eines pH-Wert von 5,0 ± 0,05 pH-Wert mit dem Steuergerät. </li><li> Verknüpfen Sie den Reaktor mit dem Kühlwasser-System und setzen Sie den Heizmantelin den Reaktor. </li><li> Installieren Sie den Temperaturfühler mit entsprechender Steuerung und Einrichtung einer Temperatur von 37 ± 0,1 ° C bei der Temperatur Steuereinheit. </li><li> Montieren Sie den Motor Agitation der Spitze des Reaktors und bringen sie in Betrieb mit einer Rührgeschwindigkeit von 200 min -1. </li><li> In dem sterilen ein minimales Wachstum Medium 11 Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (250 ml). Für mittlere Vorbereitung alle Komponenten wurden bei 121 ° C für 20 min autoklaviert und miteinander vermischt. Drei Kulturen die Komponenten umfassen Talkum (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) in den Konzentrationen von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Vor der Verwendung erneut zu suspendieren die Mikropartikel in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5) und fügen sie in den sterilen Medium. In Kontrollkulturen (ohne Partikel) ersetzen Sie den Mikro-Suspension mit 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5). </li><li> Fügen Sie die Sporensuspension (Inokulum) eines vorbereitet in Wucherpfennig et. al (2011) 11 Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (50 ml), so dass die Konzentration von Sporen beträgt 1x10 6 ml -1. Die Impfung stellt den Beginn des Anbaus (h = 0 h). </li><li> Starten Sie die Belüftung mit einer Rate von 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Sterile Probenahme nach 24, 48 und 72 h Kultivierung <ol><li> Nehmen 50 ml sterilem Kulturbrühe in einem Flakon Rohr. </li><li> Verwenden Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht, β-Fructofuranosidase Aktivität und mikroskopische Analyse. </li></ol> 3. Bestimmung des Biomasse-Trockengewicht nach 24, 48 und 72 h Kultivierung <ol><li> Biomasse Proben zu mindestens doppelt gemacht werden. </li><li> Gewicht ein Cellulose-Filter mit einem Mikro-Skalen nach dem Trocknen im Exsikkator und platzieren Sie den Filter in einem Büchner-Trichter mit angeschlossenem Wasserstrahl-Vakuumpumpe. </li><li> Filtern sie ein definiertes Probenvolumen (zB 10 ml) einenND spülen Sie den Filter mit 10 ml destilliertem Wasser auf Medium Verbindungen aus der Biomasse zu entfernen. </li><li> Falten der Filter einmal in der Mitte, legen Sie sie in einem Glas-Petrischale und steckte es in ein Fach Trockner bis zur Gewichtskonstanz (mindestens 24 h). </li><li> Kühlen Sie den Filter in einem Exsikkator und Bestimmung des Gewichts. </li><li> Berechnen Sie die Biomasse Trockengewicht als die Differenz zwischen dem Gewicht des Filters mit und ohne getrocknete Biomasse von der verwendeten Probe dividiert. </li></ol> 4. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der extrazellulären β-Fructofuranosidase von GOD / POD-Essay nach 24, 48 und 72 h Kultivierung Lagern Sie die Proben auf Eis ständig während der Arbeit mit ihnen. <ol><li> Filter 1,5 ml Kultur Suspensionstrog ein Celluloseacetat-Filter durch Drücken der Kultursuspension mit einer Spritze durch den Filter in ein Reaktionsrohr. Bewahren Sie das Reaktionsrohr bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Für die Reaktionsmischung verwenden 20ul-Probe und mit 200 ul von 1,65 M Saccharose in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 5,4) aufgelöst, um die Reaktion von Saccharose zu Glucose zu initiieren. Cary aus der Reaktion mindestens in zweifacher Ausführung. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 40 ° C für 20 min in einem Heizblock. Stoppen der Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min in einem Heizblock. Das Reaktionsgemisch wird durch Lagerung auf Eis und Spin-down das kondensierte Wasser durch Zentrifugieren bei 13.000 g für 10 min bei 4 ° C </li><li> Um den pH-Wert und Temperatur abhängige Spaltung von Saccharose zu Glukose ausmachen, führen Sie eine leere Wert mit 20 ul entionisiertem Wasser anstelle von 20 ul Probe. </li><li> Um restliche Glucose in der Kulturbrühe zu berücksichtigen, Durchführung einer negativen Kontrolle für jede Probe. Zu diesem Zweck Verwendung von 20 ul der Probe zu inaktivieren und β-Fructofuranosidase durch Erhitzen bei 95 ° C für 10 min vor der Saccharose hinzugefügt und die Platte wie in Schritt 4.3 beschrieben. </li><li> Verdünnen der Proben, so dass die folgenden Maßnahmenured Adsorption ist in der kalibrierten Wertebereich. </li><li> Führen Sie alle enzymatischen Assays in dreifacher Ausfertigung. Bewerben 2 ul verdünnte Probe in eine Mikrotiterplatte gut. Tragen Sie einen Standard für die Kalibrierung auf der Mikrotiterplatte durch jede Verwendung von 2 ul von zehn Glukose-Lösungen mit zehn unterschiedlichen Know-Konzentrationen (ab 1 mm bis 15 mm) anstelle von 2 ul Probe. Für Null-Punkt-Kalibrierung verwenden 2 ul entionisiertem Wasser anstelle von 2 ul Probe. </li><li> Fügen Sie 200 ul der Reagenzlösung in jede Vertiefung mit Hilfe einer Multi-Pipette. </li><li> Inkubieren des Gemisches für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bewahren Sie die Mikrotiterplatte bei 6 ° C bis zur Messung (ein paar Stunden bei den meisten). </li><li> Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einer 96-well Mikrotiterplatten-Photometer Sonnenaufgang und die Magellan Datenwiederherstellung Software. Stellen Sie die Mischzeit bis zu 5 sek. und der Ruhezeit bis zu 1 sek. </li><li> Öffnen Sie das Ergebnis Tabelle mit einem Tabellenkalkulationsprogramm und erstellen Sie eine Eichgerade mit dem Standard-Sortiment: glucose Konzentration X = a + b-Absorption </li><li> Berechnen Sie die Aktivität: Aktivität = (Absorption x Verdünnungsfaktor-Blindwert) X a + b </li><li> Finde heraus, die β-Fructofuranosidase Aktivität durch Berechnung der Differenz zwischen den Aktivitäten der Probe und der entsprechenden negativen Kontrolle. </li><li> Berechnen Sie die spezifische Produktivität für folgende Verwendung unter Berücksichtigung Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Tätigkeit 11. </li></ol> 5. Mikroskopie und automatisierte Bildanalyse nach 72 h Kultivierung <ol><li> Platz in 3 ml-Suspension in einer Kunststoff-Petrischale undverdünnen mit physiologischer Kochsalzlösung, bis die morphologischen Strukturen getrennt sind. </li><li> Situieren die Petrischale unter dem Mikroskop, das eine integrierte oder angeschlossene Kamera verfügt. Erfassen und Speichern des etwa 100 Bilder (Abbildung 2) von morphologischen Strukturen pro Probe. Beachten Sie, dass für jedes Bild wenigstens ein Objekt vollständig abgebildet. </li><li> Öffnen Sie alle Bilder von der gleichen Probe mit dem Bildverarbeitungsprogramm ImageJ 12. Konvertieren Sie die Bilder auf schwarz und weiß mit der Prozess-Tool &quot;Make Binary&quot; (Abbildung 2). Für die Anwendung des Befehls an die ganze Reihe von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt. laufen (,, Machen Sie Binary &quot;) </li><li> Öffnen Sie die bearbeiteten Bilder mit binären ImageJ wieder. Berechnen Sie die Formfaktoren Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität für jedes Bild mit dem Analysetool &quot;Set Measurement&quot;. Zum Aufbringen der Befehl zu einer ernstES von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt. laufen (&quot;8-Bit&quot;); ausgeführt werden (&quot;Make Binary&quot;); laufen (&quot;Set Scale ...&quot;, &quot;Abstand = X bekannt = 1000 Pixel = 1 VE = um globale&quot;); laufen (&quot;Set Maße ...&quot;, &quot;Bereich Umfangsform Feret-Limit-Anzeige redirect = None dezimal = 3&quot;); laufen (&quot;Analyze Particles ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity Zirkularität = 0,00-1,00 show = Outlines Display&quot;); Bestimmen X die Anzahl der Pixel, die 1000 um korreliert, indem er eine gerade Linie in einem Maßstab. Korrelieren der Anzahl von Pixeln aus der geraden Linie mit der Länge der Balken in um. </li><li> Öffnen Sie das Ergebnis Diagramm mit Formfaktor Werte für jedes Bild mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie eine Morphologie-Nummer wie folgt für jedes Bild. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Berechnen Sie Mittelwert und Standardabweichung für die Morphologie Zahl unter Berücksichtigung aller Bilder einer Probe. </li&gt; <li> Verwenden Sie eine Graphik-und Datenanalyse-Programm für graphische Korrelation der Morphologie, die dem spezifischen Produktivität und bestimmen Sie die mathematische Beziehung durch mathematische Regression. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Durch Zugabe von Talkum Mikropartikel A. niger SKAN 1015 Morphologie wird von einem echten Pelletmorphologie zu einem verteilten oder sogar Myzel Morphologie verändert. Während Pelletmorphologie unter Standardbedingungen zeigte ein Myzel Morphologie durch Ergänzung Medium mit 10 g / l Talkum Mikropartikel (4.) Erstellt. Gleichzeitig die Aktivität von β-Fructofuranosidase erhöht um 3-fach 3-5. Eine Ergänzung von 1 oder 3 g / l Talkpulver führt zu einer dispergierten Morphologie mit einer doppelten Fructofuranosidase Aktivität (4.). Die Mikro-Partikel abhängig Morphologie in umfassender Weise durch die Mor beschrieben werdenMorphologie Zahl, die anhand von Parametern automatische Bildanalyse bestimmt werden kann. Perfekt abgerundete und glatte Pellets werden in mikroskopischen Bildern erscheinen als perfekte Kreise. Für solche Teilchen die Morphologie hat einen Wert von 1. Die kleinste Fragment von Mycel Morphologie als eindimensionale Linie was eine Morphologie Zahl von 0 vereinfacht werden. Alle Zwischen-morphologische Formen wie längliche unregelmäßige Pellets oder Klumpen müssen daher Werte zwischen 0 und 1. Ziemlich große Partikel werden in einem hohen, Pilz-Partikel mit einer großen Oberfläche oder längliche Partikel, in einem eher niedrigen Morphologie der Nummer 11 zur Folge haben. Unter Standardbedingungen die Morphologie in Reaktor 1 weist eine Morphologie Zahl rund 0,8. Die Morphologie im Reaktor 4 mit 10 g / L Talkpulver ist mit einem Mn etwa 0,1. Die Morphologie Anzahl von Reaktoren 2 und 3, mit Talkum Puder Konzentrationen von 1 und 3 g / l, zwischen diesen Extremen liegt, zeigt eine dispergierte morphologie. Da Mikro-Partikel-Morphologie abhängig ist eng mit dem β-Fructofuranosidase Produktivität bezogen, wird eine mathematische Korrelation von Morphologie und Produktivität Zahl ähnlich wie Abbildung 5 erhalten. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine Systematik des experimentellen Designs und des analytischen Verfahrens. A. niger kultiviert wird (mit oder ohne Mikro-Teilchen) in einem 3 L Rührkessel-Bioreaktor für 72 h. Nach 24, 48 und 72 ha Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Aktivität, was wiederum zur Berechnung der spezifischen Produktivität verwendet getroffen werden. Nach 48 h wird die Pilz-Morphologie wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Relevante Parameter der Bildanalyse auf eine Morphologie-Nummer, die mathematische Beziehung mit der spezifischen Produktivität kombiniert. <imgalt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Schritte der Bildverarbeitung für die mikroskopische-generierte Bilder von morphologischen Strukturen von A. Niger. Schritt 1: Bildaufnahme mit dem Mikroskop. Schritt 2: Imageverbesserung, wenn nötig. Schritt 3: Bild Binarisierung, schwarz-weiß (binär) Bild in ImageJ erzeugt. Schritt 4: das binäre Bild wird durch verarbeitet und unerwünschte Objekt gelöscht werden. Schritt 5: morphologische Analyse wird mit der &quot;Analyze Partikel&quot;-Funktion der Open-Source-Programm ImageJ durchgeführt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verschiedene morphologische Formen von A. niger abhängig von der Konzentration des zugesetzten Mikropartikel. Mit zunehmender Konzentration von Mikro-Partikeln gegeben das Pellet Größe exakt verringert werden kann bis hin zu kleinen Kern-Schale-Pellets, kleine Herden und sogar frei verteilt Myzel. Morphologie Engineering Alspergillus niger SKAn1015 durch Mikro-Partikel-Supplementation in Submerskultur. Ohne Mikropartikel (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / l (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / l (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / l (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (A), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) und 40-50 g / L (T). Die Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie nach 72 h der Landwirtschaft entzogen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> 4. Fructofuranosidase Aktivität in Abhängigkeit von Talk Mikropartikel Konzentration von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Reaktor 1 ist nicht mit Mikro-Partikel ergänzt, hier der Anbau wird unter Standard-Bedingungen durchgeführt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vertreter gute Korrelation (R 2 = 0,91) der MorphologieAnzahl und die spezifische Produktivität. Die Morphologie Zahl aufgetragen (Abszisse) gegen die spezifische Produktivität (Ordinate). Nichtlineare Regression ergibt den exponentiellen Korrelation.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

Ich habe nichts zu offenbaren.

Die Modifizierung von Pilz-Morphologie hat Interesse an der Biotechnologie seit vielen Jahrzehnten. Verschiedene Studien haben versucht, ausgewählte Prozessparameter wie pH-Wert, Leistungsaufnahme, Temperatur, Medium Nährstoffe oder Inokulumkonzentration 1 variieren, leiden aber unter eher ungenau, unvollständig und Kontrolle der Morphologie, hohe Energiekosten, Hemmeffekte Produkt oder Instabilität, Im Gegensatz dazu Die Ergänzung von Mikropartikeln erlaubt eine präzise Konstruktion von Pilz Morphologie durch Feinabstimmung Variation der Teilchengröße und Konzentration. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, um Mikro-Partikel zur Optimierung und zur maßgeschneiderten Entwicklung von Hochgeschwindigkeits produzierenden Morphologie verwenden in der biotechnologischen Produktion mit A. niger und andere filamentöse Mikroorganismen. Die digitale Bildanalyse ist ein leicht reproduzierbares Verfahren zur Pilz-Makro-Morphologie zu charakterisieren. Allerdings ist die Vielzahl von Parametern für die Größe, Form und Oberflächeneigenschaftenter von morphologischen Strukturen in der Literatur beschrieben ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Pilz-Morphologie kompliziert. Das vorgestellte Morphologie Zahl als eine Kombination von relevanten Parametern, vermeidet diesen Nachteil und kann nicht nur für die umfassende Charakterisierung von morphologischen Strukturen, sondern auch für die direkte mathematische Korrelation mit der Produktivität genutzt werden. Dies wiederum macht eine Schätzung der Produktivität durch die Morphologie gegeben und damit eine Anpassung der Morphologie für Prozess muss möglich. Mit der Morphologie Zahl, ist es möglich, zwischen verschiedenen Pellets und verklumpen Morphologien 4,5 unterscheiden. Für die weitere Entwicklung der Morphologie Zahl der Betrachtung der fraktalen Dimension scheint vielversprechend zu sein. Eine fraktale Dimension ergibt eine Messung der Komplexität und der Masse füllen Eigenschaften eines Objekts 13 und ist daher für eine ganzheitliche Charakterisierung von Mycel-Morphologie prädestiniert. Die creation eines hohen produzierenden Mycel-Morphologie, könnte jedoch zu Problemen mit Prozess-Performance vor allem in großflächigen Anbau führen, weil das Myzelwachstum Formular wurde zuvor gezeigt wurde, weisen viel größere Kulturbrühe Viskositäten 2. Dies führt zu Problemen mit Wärme-und Stofftransport und die Bildung von gemischten Zonen nicht stagniert, die eine höhere Leistungsaufnahme und machen den Anbau teurer zu 1 voraussetzen. Deshalb Beziehung zwischen Pilz Morphologie und Kulturbrühe Viskosität sollte berücksichtigt werden, wenn die Änderung der Morphologie und in weiteren Modellen eingebaut werden können.

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

Der filamentöse Pilz A. niger ist ein weit verbreitetes Stamm in einem breiten Bereich industrieller Prozesse aus der Nahrung der pharmazeutischen Industrie. Eines der faszinierendsten und oft unkontrollierbaren Merkmale dieser filamentösen Organismus ist seine komplexe Morphologie. Es reicht von dichten kugelförmigen Pellets zu zähflüssig Myzelien (Abbildung 1). Verschiedene Prozessparameter und Zutaten sind dafür bekannt, Pilz-Morphologie 1 zu beeinflussen. Da eine optimale Produktivität korreliert stark mit einer bestimmten morphologischen Form, die Pilz-Morphologie stellt oft den Engpass bei der Produktivität in der industriellen Produktion. Ein geradlinig und elegante Methode zur präzisen Steuerung morphologische Form ist der Zusatz von anorganischen unlöslichen Mikropartikel (wie wasserhaltiges Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Titan-Silikat-Oxid) zu dem Kulturmedium Beitrag zur höheren Enzymproduktion 2-6. Da es eine obvdene Korrelation zwischen Mikro-Partikel abhängig Morphologie und Enzymproduktion ist es wünschenswert, mathematisch zu verknüpfen Produktivität und morphologische Erscheinungsbild. Daher ist eine genaue quantitative und ganzheitliche morphologische Beschreibung wird angestrebt. So stellen wir eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung von Mikro-Partikel abhängig morphologischen Strukturen und zur Pilz-Morphologie mit der Produktivität (Abbildung 1), die möglicherweise trägt zu einem besseren Verständnis der Morphogenese von fadenförmigen Mikroorganismen zu korrelieren. Der rekombinante Stamm A. niger SKAn1015 wird 72 h in einem 3 l Rührkessel Bioreaktor. Durch Zugabe von Talk Mikropartikel in einer Konzentration von 1 g / l, 3 g / l und 10 g / l vor der Inokulation eine Vielzahl von morphologischen Strukturen reproduzierbar erzeugt. Sterile Proben werden nach 24, 48 und 72 Stunden zur Bestimmung der Wachstumsprozess und die Aktivität des hergestellten Enzyms gemacht. Diegebildete Produkt ist der hochwertige Enzym β-Fructofuranosidase, ein wichtiger Biokatalysator für neo-Zucker-Bildung in Lebensmitteln oder pharmazeutischen Industrie, die unter anderem katalysiert die Reaktion von Saccharose zu Glucose 7-9. Daher bedeutet die Quantifizierung von Glucose nach Zugabe von Saccharose die Menge des produzierten β-Fructofuranosidase. Glukose wird durch eine Quantifizierung GOD / POD-Assay-10, die für High-Throughput-Analyse in 96-well Mikrotiterplatten modifiziert wird. Pilz-Morphologie nach 72 Stunden wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Dabei werden Partikelform Faktoren für Pilz-Makro-Morphologie wie Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität mit dem Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm ImageJ berechnet. Relevante Parameter werden auf einer dimensionslosen Zahl Morphologie (Mn) 11, die eine umfassende Charakterisierung ermöglicht kombiniertPilz Morphologie. Die enge Korrelation der Morphologie Anzahl und Produktivität werden durch mathematische Regression hervorgehoben.

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Verfahren genau zu erzeugen und umfassend charakterisieren Morphologie Fadenpilz<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; Wird beschrieben, mit dessen Hilfe mathematische Korrelation von morphologischen Aussehen und Produktivität.

Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

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Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Forschung

Biologie

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are potent carcinogens that substantially reduce crop value in maize and other oil rich crops like peanut besides posing serious threat to human and animal health. Different approaches, including traditional breeding, transgenic expression of resistance associated proteins, and RNA interference (RNAi)-based host-induced gene silencing of critical A. flavus gene targets, are being evaluated to increase aflatoxin resistance in susceptible crops. Past studies have shown an important role of &#945;-amylase in A. flavus pathogenesis and aflatoxin production, suggesting this gene/enzyme is a potential target to reduce both A. flavus growth and aflatoxin production. In this regard, the current study was undertaken to evaluate heterologous expression (under control of the constitutive CaMV 35S promoter) of a Lablab purpureus L. &#945;-amylase inhibitor-like protein (AILP) in maize against A. flavus. AILP is a 36-kDa protein, which is a competitive inhibitor of A. flavus &#945;-amylase enzyme and belongs to the lectin&#8211;arcelin&#8211;&#945;-amylase inhibitor protein family in common bean. In vitro studies prior to the current work had demonstrated the role of AILP in inhibition of A. flavus &#945;-amylase activity and fungal growth. Fungal growth and aflatoxin production in mature kernels were monitored in real time using a GFP-expressing A. flavus strain. This kernel screening assay (KSA) is very simple to set up and provides reliable and reproducible data on infection and the extent of spread that could be quantified for evaluation of germplasm and transgenic lines. The fluorescence from the GFP strain is closely correlated to fungal growth and, by extension, it is well-correlated to aflatoxin values.&#160; The goal of the current work was to implement this previous knowledge in a commercially important crop like maize to increase aflatoxin resistance. Our results show a 35%&#8211;72% reduction in A. flavus growth in AILP-expressing transgenic maize kernels which, in turn, translated into a 62%&#8211;88% reduction in aflatoxin levels.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Here we present a protocol to analyze Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in maize kernels expressing an antifungal protein.&#160; Using a GFP-expressing A. flavus strain we monitored the infection and spread of the fungus in mature kernels in real time. The assay is rapid, reliable, and reproducible.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Umwelt

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Biochemie

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

Aspergillus oryzae, a filamentous fungus, is one of the most widely used hosts for industrial applications including large-scale production of proteins. A polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation method is generally used for the introduction of heterologous genes into A. oryzae. The conventional method typically requires three weeks for the screening of favorable transformants. Here, a new technique, the direct liquid-culture (DLC) screening method, is introduced which reduces the screening time to six days in a 200 mL flask format or to 10 days in a 24 well microplate format. The DLC screening method ensures the acquisition of positive transformants and evaluation of the secretory production of heterologous proteins in a single step, unlike the conventional screening method where two separate steps are required for the same. The protocol for PEG-mediated protoplast transformation of A. oryzae is described, which consists of five steps: preparation of fresh spore suspension, preculture, preparation of protoplasts, introduction of DNA, and DLC screening. For successful results in DLC screening, it is critical to use a nutrient-rich medium with optimized osmotic pressure. The protocol should further popularize the use of A. oryzae as a host of choice in the industrial production of proteins.

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

A direct liquid-culture (DLC) screening method has been developed which significantly reduces the time required for polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation of the filamentous fungus, Aspergillus oryzae, when employed for evaluation of the secretory production of heterologous proteins. This method dramatically increases the throughput of the evaluation protocol.

Aspergillus oryzae, a filamentous fungus, is one of the most widely used hosts for industrial applications including large-scale production of proteins. A ...

Genetik

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Kultivierung von arbuskulären Mykorrhizapilzen mit SAP-AS zur besseren Beobachtung

Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are difficult to manipulate and observe due to their permanent association with plant roots and propagation in the rhizosphere. Typically, AM fungi are cultured under in vivo conditions in pot culture with an autotrophic host or under in vitro conditions with Ri Transfer-DNA transformed roots (heterotrophic host) in a Petri dish. Additionally, the cultivation of AM fungi in pot culture occurs in an opaque and non-sterile environment. In contrast, in vitro culture involves the propagation of AM fungi in a sterile, transparent environment. The superabsorbent polymer-based autotrophic system (SAP-AS) has recently been developed and shown to combine the advantages of both methods while avoiding their respective limitations (opacity and heterotrophic host, sterility). Here, we present a detailed protocol for easy preparation, single spore inoculation, and observation of AM fungi in SAP-AS. By modifying the Petri dishes, high-resolution photographic and video observations were possible on living specimens, which would have been difficult or impossible with current in vivo and in vitro techniques.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der AM-Pilzforschung mit SAP-AS – eine neuartige Technik für Einzelsporenkulturen

Here, we describe a simple and inexpensive technique for inoculating and observing arbuscular mycorrhizal fungi in superabsorbent polymer-based autotrophic systems.

Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizakulturen auf superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are difficult to manipulate and observe due to their permanent association with plant roots and propagation in the ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Biotechnik

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

Zusammenfassung

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Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizakulturen auf superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen

Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizakulturen auf superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen

Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizakulturen auf superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam