CIBCフェローシップ（ja）およびNSERC助成（RZ）。我々は、赤外線カメラに関する彼の助けのためロッシュM.コモ（Brainsight）、MRコンパチブルトラッカーや他のハードウェアのサポートに感謝しています。我々はまた、コイルホルダ用の多関節アームを設計し、ビデオで表示される数値のいくつかを提供するブライアン·ハインズ（Hybexイノベーション株式会社）に感謝しています。そして、私たちは、実験の設計を最適化する助けモントリオール神経学研究所のマクコーネル脳イメージングセンターからすべてのMR技術とM.フェレイラ氏に感謝します。

プロトコルは2日間のセッション（必ずしも連続しない）に分かれています。初日は領域は、TMSと対象とするために、各参加者のために定義するために解剖学的および機能的MRスキャンで構成fMRIのローカライザーで構成されています。二日目は、fMRIのセッションで構成されています事前とTMSは特別なMRコンパチブルTMSコイル（Magstim株式会社、ウェールズ、英国）とフレームレス定位システム（Brainsight）を使用して、スキャナの内部に適用されるポストTMS。後者は、各参加者の解剖学的および機能的なデータに相対皮質領域でリアルタイムTMSコイルの位置に使用されます。 1。ローカライザーセッション<ul><li>あなたの参加者の高解像度の解剖学的画像を取得して起動します。 </li><li>次に、任意のBOLD効果やMRIスキャンノイズ14,15に起因する聴覚マスキングを最小限に抑えるために、勾配エコーEPIパルスおよびスパースサンプリングのパラダイムを用いて機能画像を取得する。我々のケースでは、fMRIはdを行っている参加者が2つの連続した5分音符のメロディーは2,16、同一または異なっているかどうかを判断する必要がありますているメロディータスクをuring。被験者は5ノートの等しい2つの長さのパターン、C5の同じピッチですべてを聞いて、第2刺激後の左ボタンをクリックするように指示されている無差別の聴覚制御タスクも、含まれています。沈黙の期間はまた、各実行中のタスクの試験間でランダムに挿入されます。 12分16秒の合計持続時間のために、メロディの弁別、24聴覚制御試験と沈黙の24周期の24試験：合計で72試験は無作為化された順に記載しています。 </li><li>解剖学的および/または機能的なランドマークを用いた刺激部位を定義します。一つは、TMSがあるため深さにおける電界強度の減衰の刺激部位の深さに関する制限されていることを認識する必要があり、3センチメートル6,17よりも深い領域に達することを期待することはできません。重要なステップは、パートごとに類似したランドマークを使用することですなぜなら参加者間の構造と機能に違いがあるため難しいかもしれicipant、。ここでは、解剖学的および機能的なランドマークの両方を使用して配置された各参加者でHeschlの回を、ターゲットにしています。我々は、ハーバード·オックスフォード構造アトラス（が提供するHeschlの回のマスク使用<a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html" target="_blank">http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html</a> ）とTMSターゲットがピークによって個別に定義されていますHeschlの回2内活性化。加えて、我々はまた、このような音響と体性感覚の成果物としてのTMSの非特異的効果を制御するためのコントロールサイトとして使用される頂点の位置を定義します。頂点はイニオンと鼻筋、左右intertragalノッチから等距離の点の間に中間として解剖学的に定義されています。刺激部位（ すなわち Heschlの回または頂点）の順序は全体で相殺される個人。 </li></ul> 2。事前·事後のTMSのfMRI実験プリTMS fMRIのセッション<ul><li>スキャナに直接移動する参加者を準備します。これは、金属の除去を含むとTMSとMRスクリーニングフォームを充填。 </li><li>解剖学的および機能的なスキャン（ローカライザーのセッションで行われたものと同じ、第1節を参照）で、MRの取得を開始します。 </li></ul> MRI環境におけるフレームレス定位とTMS フレームレス定位システムは、赤外線カメラ（ポラリススペクトル）、登録手順とコンピュータのために使用するいくつかのツールと​​トラッカー（Brainsight）から構成される。コンピュータがスキャナ室の外側に位置するが、スキャナ室の入口に位置し、スキャナのドアは、TMSの適用中に開いたままです。ツールやトラッカーは、MR互換性があるだけでなく、赤外線カメラを支える三脚（自家製）とthアールereforeはスキャナ室の内部で使用。赤外線カメラは、MR-互換性がありませんので、スキャナーベッドから約2メートルで、スキャナのドアの近くスキャナ室、（安全手順についての説明を参照してください）​​の内側に配置されています。 TMSの刺激システムは、MRIスキャナ室に隣接する部屋に位置しています。我々は、MRI適合性のTMSコイルスキャナ室の内側に位置しており、RFフィルターチューブを通って、7メートルケーブルを介して、TMSシステムに接続を使用しています。 <ul><li>定位ソフトウェアパッケージ（ 例えば Brainsight）にご参加者の解剖学的および機能画像と刺激ターゲットをロードします。ここでは、右Heschlの回をターゲットにされます。 </li><li>プリTMS fMRIの買収後、32チャネル·ヘッド·コイル（シーメンス3Tスキャナと32チャンネルヘッドコイルの構成を使用している場合）の上部MRヘッドのコイル部分を削除します。 </li><li>次に、スキャナのベッドの上で参加者を下にスライドさせます。 </li><li> participで設定ヘッドバンドとトラッカーを修正アリの頭部。 </li><li>スキャナベッドに多関節アームを取り付け、アームにMRコンパチブルTMSコイルを固定してください。 </li><li>すべてのトラッカーとコイルはカメラの視野にあることを確認します。ここでは、カメラが若干右半球をターゲットとした場合、コイルの変位の簡単追跡を有効にする参加者の右側に移動されます。 </li><li>定位ツール（ つまり 、ポインタツール）を使用して被検者の頭部をキャリブレーションします。これは、解剖学的データで同じランドマークの参加者の頭（私たちの例では、例えば鼻の先、[後]と両耳の耳珠）でいくつかのランドマークをcoregisteringすることによって行われます。この手順では、2つの実験は、一人の参加者の頭の上にポインタツールを配置するため、参加者の頭の近くにして、コンピュータの登録を行うスキャナ室の入り口に他の実験を必要とされている。 </li><li>トンに対する接線のMRコンパチブルのTMSコイルを置き彼頭皮、および赤外線カメラ向けコイルトラッカー。コイルは正中2に後方と平行ポインティングコイルハンドル付き配向されている。多関節アームにネジを使用して、コイルの位置を修正します。 </li><li> MRIスキャナに隣接する部屋では、TMSのシステムの電源をオンにし、刺激を開始します。 TMSは、40代のための5Hzので繰り返し50Hzで3パルスで構成されるパターン化されたプロトコル、 すなわち 、連続シータバースト刺激（CTBS）、続いて適用されます。我々は、刺激出力18,19によって定義された固定の刺激強度（41％）を使用します。それは（安全手順については議論のセクションを参照）、健康な集団20の刺激中止後30分間の持続時間のために皮質可塑性を調節することが示されているように我々は、このプロトコルを選択しました。 </li></ul>ポストTMSのfMRIのセッション<ul><li>刺激が完了したら、それはできるだけ早くスキャナに対象を取り戻すことが重要です。 Tを削除するMSがスキャナ室からコイル、及び多関節アームを取り外します。 MRヘッドのコイルに、参加者の頭を後ろにスライドさせます。お使いのスキャナが準備済みで行く準備ができていることを確認します。我々のアドバイスは、全体のTMSのセッション中に発生した身体のプラットフォームを維持し、最小限にローカライザースキャンの回数と期間を削減することです。 </li><li> rTMSの効果が一時的なものなので、最終的なスキャンセッションは、機能スキャンで始まらなければなりません。再び、我々はメロディタスクの12分間実行中にfMRIを実施しました。 </li><li>最後のスキャンが完了したら、解剖スキャンで仕上げてください。 </li></ul> 3。代表的な結果 fMRIデータの解析は、事前·事後のTMS fMRIのセッションの両方に対して個別に行われている。各fMRIのセッションのために（ すなわち 、事前と事後TMS）は、メロディーと聴覚制御タスクとのコントラストが左右Heschlの脳回、上側頭脳回、下前頭脳回とprecenでタスク関連活性を示す最大スペクトル脳回（ 図1のB）。事前·事後のTMS fMRIのセッションとの違いを評価するために、我々はスチューデントのt検定を用いて、ランダム効果分析を行う。意義は、z&gt; 2のしきい値とpの補正されたクラスタのしきい値= 0.05で識別されるクラスタを使用して決定されます。 図1 Cは単一の参加者のためのコントラストポストマイナスプレCTBSを表しています。データは右Heschlの回（黒丸）を標的CTBSは左Heschlの回を含む反対（左）聴覚野におけるfMRIの応答の増加を誘導することを示唆している。 fMRIの応答の変化はまた、二国間で左中心後回、左の島にと横後頭葉皮質で発見されています。しかし、fMRIの応答に有意な変化は、コイルの下に見られません。また、同様の結合されたTMS-fMRIのプロトコルは、頂点（コントロール·サイト）を刺激するために繰り返されます。頂点の上に適用さCTBSと事前·事後fMRIのセッションの比較は、どのsignificaを示さなかったntの効果（データは示さず）。 <img src="/files/ftp_upload/3985/3985fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：個々のプレTMS fMRIのデータ（）、ポストTMS fMRIデータ（B）とポストマイナスプレTMS fMRIのデータ（C）の分析。プリTMS fMRIのセッション（A）中とポストTMS fMRIのセッション（B）の単一の参加者のためのコントラストメロディ差別マイナス聴覚制御試験のAの結果。左から右へ：軸冠状および矢状ビュー。 （a）も（b）、TMSのコイルは、次の場所に右Heschlの回（黒丸）を標的としたx = 54、Y = -13、Z = 1（MNI152標準スペース）。事前·事後のTMS fMRIのセッションの両方の場合、座標値は、x = -54、Y = -13、Z = 1（MNI152標準スペース）刺激部位（ すなわち右Heschlの回で左半球の変化を示すことで表示されます）。スチューデントのt検定を用いたコントラストポストマイナスプレTMS fMRIのセッションの後は、結果。

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、聴覚野の機能的な組織を調査するためにオフラインTMSおよびfMRIを組み合わせるプロトコルを記述します。次のセクションでは、我々はそのようなアプローチを実施する際に考慮すべき方法論的な要因を説明します。 ポストTMS fMRIのセッションの取得とタイミング 事前·事後のTMS fMRIのセッションのスキャンの取得と相殺の順序 それは、2つの機能の​​スキャンの間に強固な登録を取得するために、TMSの前と後のMR解剖スキャンを取得することが重要です。そうでなければ、得られた機能的な違いはなく、fMRI信号のTMS誘発性の変化に比べて二つの機能の​​スキャンの間に位置ずれの問題をやるためであるかもしれません。加えて、任意のfMRI-TMSセッション（偶数fMRIのローカライザーセッションの前）の前に、それは、fMRIの定量的な比較を可能にするために、fMRI信号の安定性と再現性を評価することが重要である応答の大きさ。実際、それは1つが単独でこの要因による違いを期待してもよい程度をテストするために件名をTMS（なし）を削除し、再導入した後にスキャンを繰り返し、いくつかのパイロット·スタディを実行するのは良い考えかもしれません。間のセッションの比較は、MRI環境だけでなく、21を実行するタスクを含めたMRI実験·コンテキストへの馴化などの非特定のTMSの要因によって影響を受ける可能性がある。この問題を克服するための1は、参加者全体で相殺する前と後のTMS fMRIのセッションの順序をする可能性があります。たとえば、1は、TMSで始まり、その後、ポストTMS fMRIのセッションを行うことができ、その後、数時間（または日）待ってから、プレTMS fMRIのセッションを行う。このような設計は、そのような主題の可用性などとMRスキャナのTMSの効果や実務​​上の留意点の予想された持続時間に依存します。もう一つのアプローチは、そうではないかもしれませんがしかし、それらの使用はまだ議論されて、偽またはプラセボ刺激を使用することです同じ音響と実刺激群と偽TMSが本当の刺激22から24と同様の効果を有することが示されているような感覚を体性感覚（ 例えば、筋肉のひきつり）を提供します。さらなるアプローチは、いくつかの領域にTMSを適用して、サイト間での違いを評価することであり、この比較では、TMSの非特異的な影響は、サイト24の両端に等価であることを前提としています。たとえば、頂点は、我々がここに示されたように、TMSを伴う音響と体性感覚のアーティファクトをコントロールするために使用することができます。 スキャン収集のタイミング rTMSの効果が一時的なものなので、TMSの終了後できるだけ早くスキャナに戻す件名を取得することが重要です。このような理由から、我々はMRI対応のTMSコイルを使用し、参加者はスキャナのベッドの上で横たわっていたときに、TMSを適用しています。しかし、この機器が使用できない場合は、それがスキャナ室の外にTMSを適用することも可能である<suP&gt; 13。しかし参加者がスキャナ室を残してありますので、これはより多くの時間を必要とし、1は実験者の動きや相互作用によって誘導される二次的な影響を排除することはできません。 TMSの中に発生したプラットフォームを維持し、TMSが完了する前に刺激がロードされていることを確認してください。 2研究者の最小値は、TMSのセッションを担当1、MRIセッションを担当し、他の1存在しなければならない。 TMSからポストfMRIのセッションへの移行中は、参加者ができるだけ少ないように実験者と対話する必要があることを認識していることを確認することが重要です。 TMSのポストのfMRIスキャンの時間は重要であり、相対rTMSの誘導効果の持続時間をスケジュールする必要があります。また、時間12オーバーrTMSの誘導効果をマップするためにrTMSの終了後一定の間隔を置いて複数の後処理TMS fMRIのセッションを行うことも面白いかもしれません。 TMSのサイトやstimulatの深さの定義<html>イオン TMSとfMRIの組み合わせは、前頭前野、前頭葉、側頭頭頂皮質や皮質内の任意の領域を標的とするために使用することができます。主な制約は、参加者が事後/後頭部がアクセスできない場合がありますので、スキャナのベッドの上で横たわっているときに対象地域は、TMSコイルにアクセス可能であるべきであるということです。参加者はまた、TMSの中にスキャナのベッドの上に座ることができますが、この場合には、ニューロナビゲーションの使用は、特に赤外線カメラは、TMSの後頭部へのアクセスを制限します。 参加者は、スキャナのベッドの上に横たわっているときに、TMSを適用するためのもう一つの制限は、コイルの位置と向きの柔軟性の欠如である。このような理由から、我々の研究では、TMSコイルが正中線に後方に平行ポインティングコイルハンドルに配置された。聴覚皮質を刺激する2時以前の研究では、コイルの向きの有意差は認められなかった。 ontentは&quot;&gt; TMSの研究のもう一つの一般的な制限要因が刺激された領域の深さである。それは、TMSは3cm深さ6,17より深い領域に到達しない可能性があることが示されている。したがって、我々の研究では、それがで誘発された変化をrTMSのことはほとんどありませんHGの内側部分は、一次聴覚野のサイトでは、逆に、HGは上側頭回の外側縁にすべての方法を拡張し、ピッチ処理25,26の役割を果たすと考えられているこのエリアは、非常に可能性があったTMSにより対象とした。この対価は、もちろん、すべてのTMSの研究に適用されますが、TMSの効果がその所望の目標に達したかどうかについての不確実性を考えると、fMRIはこういう事情であるかどうかを客観的に判断するために役立つ可能性があります。 MR環境でCTBSプロトコルの技術的な考慮事項 そこで、MR対応機器なしで、したがってこれまで常にMRスキャナの部屋の外で使用されていCTBSプロトコル（50Hzの）は、使用20,27-29。これは、MRコンパチブルTMS装置を用いたMR環境内CTBSを適用した最初の研究である。そのようなプロトコルを実装するには、これはセットアップを効果的に刺激からコイル30に拡張された実行中のMR -互換性のあるケーブルのインピーダンス増加により約20％のTMS出力強度を減少させることに注意することが重要です。また、この出力制限は、いくつかの国（ヨーロッパ、カナダ対230V電源で例えば 115V電源）のために、より重要である可能性があります。あなたはMagstim機器を使用している場合は、あなたのシステムの電力​​を増加させるために、追加モジュール（ラピッド-2プラスワンモジュール）を取得する必要があるかもしれません。赤外線カメラはMRスキャナの穴から安全な距離に配置する必要があるため、大規模な測定体積（&gt;を提供することができる必要がありますように組み合わせ、TMSとfMRIの別の制限は、MRの部屋の中のフレームレス定位の使用を含む2メートルラメータ）。我々はポラリススペクトル（NDIポラリス、選んだ理由です<a href="http://www.ndigital.com/medical/polarisfamily.php" target="_blank">http://www.ndigital.com/medical/polarisfamily.php</a> 3メートルまでの視野を提供します）。 （ 例えば MRCシステムズGmbH、ドイツ）を使用することができるMRコンパチブル赤外線カメラもあります。 CTBSプロトコルが連続fMRIの取得中にオンラインで適用されない場合がありますことに注意することが重要です。我々は以前に31ともBestmann らによってテストされた32、90ミリ秒の無音期間が刺激の充電期間中に、TMS-コイルを通って漏れ電流によるMR画像上のアーチファクトを避けるために、すべてのTMSのパルスの後に必要です。連続TBSはfMRIの買収に収まら従って可能性は低い200ミリ、で区切られた50Hzの（パルス間の20ミリ秒）で配信3パルスの列車で構成されています。また、CTBSは通常40歳代（600パルス）、WHの間のみ適用されますICHは、EPIシーケンスの多くの繰り返しを許可していません。連続TBSのプロトコルが聴覚野に強い神経活動につながるべきかも非常にうるさいですので、聴覚処理を調査するのに適しないかもしれません。しかし、このような間欠的または中間TBSなどTBSの他のモダリティは、適切な長いTR 20で適用することができる。 組み合わせCTBSとfMRIの安全 CTBSの安全 それは、高周波数のバースト（50ヘルツ）を実現しますので、注意33して使用する必要がありますので、連続的なTBSは他の反復的なTMSのプロトコルよりも発作のリスクが高いと付与の理論的可能性を秘めています。参加者が研究されているときはいつも、rTMSの使用経験があり、発作の管理に熟練している医師や看護師は、rTMSの研究室から手の届くところにあるべきである。 CTBSを使用して発作の1つのケースは、健康な人でも報告されている彼らはオリジナルのプロトコル20（ つまり、80％の活性運動閾値）よりも高い強度（ すなわち 100％安静運動閾値）を用いたてんかん34の危険因子を持つ。発作の場合に従うべき手順は、安全ガイドライン35,36に記載されています。 MRの互換性ツール TMSはMRスキャナルーム内適用されるときは、スキャナの内部で使用するすべてのツールは、MR互換性があることが重要です。ここでは、TMSコイルをマウントするための多関節アーム（カスタムビルト）は、MRコンパチブル（アセタール、ポリカーボネートで作られた）であった、とMRベッド仕様の範囲内に収まる。多関節アームは、刺激の長い期間のために特に有用であるとコイルの柔軟なポジショニングを提供し、複数の方向に回転が可能になります。位置決めやトラッキングのために使用トラッカー（Brainsight）は、MR互換性があります。赤外線カメラ（ポラリス）はMRスキャナの部屋の中ですが、MRスキャナ（スキャナベッドから少なくとも2メートル）から安全な距離を保った。この距離で、磁界は冷蔵庫のマグネット（50ガウス）よりも小さい0.3 MT（3ガウス）（シーメンスから技術者との個人的なコミュニケーション、37,38）、そのままここに赤外線カメラのシールドいいえ、必要ありません。 TMSの刺激システムにつきましては、スキャナに観察スイート隣で設定されているポータブルデバイスを使用していました。 刺激のパラメータ 人間の最初のCTBSの研究では、Huang ら 20 50Hzで3パルスのバーストを適用し、80％活性運動閾値で、一次運動野の上5Hzので繰り返すことであった。我々はHeschlの回をターゲットにCTBSを使用しているので、ここで、我々は、基準尺度としてアクティブなモータのしきい値を使用すると、この脳領域の興奮性の良い指標ではないかもしれないことと考えた。また、MR環境内部CTBS、このセットアップeffを使用ectively約20％（前のセクションを参照）で出力強度を低減します。参考として、Bestmann らの研究39セットアップ同様のを使用して（MRコンパチブルTMSコイルとすなわち Magstimシステム）は、個々のアクティブな70％に相当する12名の42％最大刺激出力の刺激の平均強度を報告した運動閾値。ここでは、我々はそのためCTBS使用のための安全ガイドライン内の前CTBSスタディやフィットに匹敵する刺激出力の41％を使用し、Oberman らを参照してください。レビューのために40。 また、生物学的組織や静磁場との相互作用のいくつかの物理的なメカニズムが理論的には、生理的または生化学的プロセス37の変化につながる可能性があることに留意しなければならない。しかし、いくつかの研究は、これらの効果が有意38,41,42のしきい値を下回っていることを報告して公開されています。加えて、我々の研究のTMSワシントン州参加者はMRスキャナのボアのスキャナーベッドと外側に横たわっていたときsは、オフラインを行った。この場合、主磁場環境は、磁石からの距離に伴って減少する静磁場B0で構成されており、参加者の距離で、磁界の強さ（= 3ガウス、または約10倍の強度3MT前後である地球の磁場）37,43。 結論コンバインドrTMSのとfMRI技術が動作基盤となる脳活動でTMS誘発性の変化を評価するための定量的な手段を提供します。 TMSは、それ自体が時間の行動を解析することができますが、結果の解釈がもともと4,44,45思ったほど簡単ではないという文献の増加実現があります。主な理由は、TMSが刺激領域における神経活動の変化を誘導することですが、また、刺激部位から離れた地域で、振る舞いCAの変化nnotは機能活性および接続の基本的な変更に関する情報を提供します。 したがって、私たちの研究では、fMRIは、TMSの前後に行った。我々は、その権利Heschlの回の上に適用連続シータバースト刺激が対側半球の相同領​​域におけるfMRIの応答の増加を誘発示した。この知見は、TMSによって誘発される干渉10,13,46,47後の対側半球の相同領域の役割を示す視覚や言語処理に関する先行研究に沿ったものである。そのような半球間相互作用が機能、または用語塑性短いから結果を保持するために代償であるかどうかはよく理解されておらず、さらなる研究がそのようなメカニズムの本質を理解するのに必要です。 聴覚神経回路網の機能的活性化パターンと接続性を調査するために組み合わせるTMSおよびオフラインfMRIをオープン新たな視点、特にトンにも便利です可能編成または皮質可塑性を評価O。また、この組み合わせはまた、聴覚神経学的または精神疾患のフォローアップ長期的な臨床評価をし、評価するために使用することができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td></tr><tr><td>経頭蓋磁気刺激</td><td> MagstimスーパーRapid2刺激すると、Rapid-2プラスワンモジュール</td><td> Magstim株式会社、ウェールズ、イギリス</td></tr><tr><td>磁気刺激用コイル</td><td> MRI対応70ミリメートル8の字コイル</td><td> Magstim株式会社、ウェールズ、イギリス</td></tr><tr><td>磁気共鳴画像</td><td> 3-Tシーメンストリオスキャナ、32チャネル·ヘッドコイル</td><td>シーメンス社、ドイツ</td></tr><tr><td>フレームレス定位脳手術</td><td> Brainsight </td><td>ローグリサーチ社、モントリオール、カナダ</td></tr><tr><td>光学測定システム</td><td>ポラリススペクトル</td><td>ノーザン·デジタル社は、オンタリオ州、カナダ</td></tr><tr><td>コイルホルダ用の多関節アーム</td><td>標準</td><td> Hybex Innovatイオン（株）、アンジュ、カナダ</td></tr><tr><td> MRI対応インサートイヤホン</td><td> Sensimetrics、モデルS14 </td><td> Sensimetricsコーポレーション、米国マサチューセッツ州</td></tr></tbody></table>

mapping the after-effects of theta burst stimulation on the human auditory cortex with functional imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

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Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

聴覚処理は、音声や音楽関連の処理の基礎となっています。経頭蓋磁気刺激（TMS）を認知、感覚と運動のシステムを研究するために正常に使用されているが、まれにオーディションを受けるために適用されていません。ここでは、聴覚皮質の機能的な組織を理解することは機能的磁気共鳴画像法と組み合わせるTMSを検討した。

機能イメージングによるヒト聴覚皮質上のシータバースト刺激の後遺症のマッピング

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K ビュー.  McGill University. 聴覚処理は、音声や音楽関連の処理の基礎となっています。経頭蓋磁気刺激（TMS）を認知、感覚と運動のシステムを研究するために正常に使用されているが、まれにオーディションを受けるために適用されていません。ここでは、聴覚皮質の機能的な組織を理解することは機能的磁気共鳴画像法と組み合わせるTMSを検討した。

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Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

生物学

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

強化、Eyetracking、および生体モニタリングによる機能イメージング

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

FDG micro-PET/CTマウスにおける褐色脂肪の機能イメージング

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

ギャップ結合細胞間コミュニケーション：毒物および毒素の有害効果を評価するための機能バイオマーカー、および天然物の健康上の利点

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...