I am grateful to Dr. Masaru Fujimoto for his technical suggestions for VAEM. I am also grateful to Prof. Koh Iba and Dr. Mimi Hashimoto-Sugimoto for providing GFP-PATROL1 transgenic plants, and discussions about PATROL1. I thank Prof. Seiichiro Hasezawa for his continuing support of my work. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI grant number 25711017.

苗の調製<ol><li>種子を滅菌します。 <ol><li> 1μlの10％トリトンX-100〜500μlの滅菌水：500μLのNaClO（5.0％有効塩素）を加えることによって滅菌溶液を調製します。 </li><li>場所の約 10 形質転換A. 1.5 mlチューブに、GFP-PATROL1 8を運ぶ シロイヌナズナの種子。 </li><li> 1ミリリットルの70％エタノール溶液を追加し、5回反転させてよく混ぜます。 1分間のままにしておきます。 </li><li>種子は、チューブの底に沈む確認します。クリーンクリーンベンチでは、静かにマイクロピペットを用いて70％のエタノールを除去し、1ミリリットルに滅菌溶液を添加。 5回反転させることによって十分に混合し、5分間放置します。 </li><li>種子を洗ってください。それでもクリーンベンチに無菌状態の下で働いて、静かにマイクロピペットを用いて溶液を除去し、1ミリリットルに滅菌水を追加します。この5回繰り返します。滅菌種子は、2日間4℃で滅菌水に格納されてもよいです。 </li></ol></li><li>だから、0.5％ジェランガム固化1/2ムラシゲ・スクーグ培地プレート（pHは5.8）9の滅菌種子ワットサージカルテープの二つの層を用いてプレート上にふたをテープで固定します。 </li><li>冷蔵室、O / Nで、4℃で暗所でプレートをインキュベートします。 </li><li> 100マイクロモルメートル-2秒 -1白いライトを使用して12時間/ 12時間の明暗サイクルで23.5℃に設定し、成長チャンバ内にプレートを移し、7日間インキュベートします。長い1mm程度の子葉と苗木は、その後収穫することができます。 </li></ol> 2.スカイドロップ子葉片の取り付け注：VAEM観察用の試料の調製における重要な要因は、試料とカバーガラスの間に気泡の混入を回避されます。気泡が大きく屈折率の差を生じさせることによってVAEMの画質を低下させます。我々は、「空のドロップ」と呼ばれている単純な実装方法は、気泡を回避するために使用することができA.間のシロイヌナズナ子葉とカバーガラス。これは、観測の直前に行​​われる必要があります。 <ol><li> 76：スライドガラス（サイズの中央に基礎緩衝液30μl[5 mMの2-（N-モルホリノ） -エタン酸トリス（MES-トリス）pH6.5で、50mMの塩化カリウム、100μMのCaCl 2]を配置します×26ミリメートル、厚さ：1.0〜1.2ミリメートル）。 </li><li>解剖ハサミを使用して、7日齢の苗から子葉を削除します。観察側が基底バッファ降下（ 図1、ステップ1）上に向けて子葉をフロート。 </li><li>カバーガラスの中心に基礎緩衝液30μlを置き（サイズ：18×18ミリメートル、厚さ：0.12〜0.17ミリメートル）（ 図1、ステップ2）。逆さまに静かにカバーガラスを回します。表面張力が脱落バッファ低下を防ぐことができます。一方の縁部にピンセットでカバーガラスを保持します。バッファ降下は約子葉の上にあるように、スライドガラス上に反対側の端を置きます。 </li><li>それは子葉試料（ 図1、ステップ3）の真上になるように、スライド上の静止カバーガラスのエッジ、まだピンセットで反対側の縁部を保持して、カバーガラスの下にバッファのドロップの位置を調整します。カバーガラスを手放します。気泡のない準備で得られた試​​料のドロップをマウントします。 </li><li>糸くずの出ない組織を使用して余分なバッファを拭き取ってください。すぐに準備を観察し（ステップ3を参照）。 注：サンプルをシールする必要はありません。 </li></ol> 3. VAEM観察ムービー取得倒立顕微鏡はTIRFユニットと1.49の開口数とTIRF対物レンズを搭載しています。注：以下のように本研究で使用するTIRF顕微鏡システム9について説明します 。レーザー入射角のコンピュータ制御は、制御ボックスが使用されます。緑色蛍光タンパク質（GFP）は、488nmの光励起半導体レーザで励起され、そしてt彼は、蛍光が葉緑体の自己蛍光を防ぐために、510から550 nmのバンドパスフィルタを介して検出されます。ファイバ出力電力の測定された最大値は13.0から13.5ミリワットです。検出のために、電子増倍電荷結合素子（EM-CCD）カメラヘッドシステムとCマウントカメラ倍率変更手段が使用されます。 <ol><li>製造元の指示に従ってを中心と集光レーザーを調整します。 注：この手順は、正確なVAEM観測のために重要です。それは強くレーザー経路の調整手順の定期的なチェックは、あなたの顕微鏡に応じて、実行することをお勧めします。 <ol><li>顕微鏡室の天井に対物レンズのない光路で照射中心位置を決定します。中央の位置をマークするには、天井に色付きの円シールを置く（ 図2、ステップ1、2）。 </li><li>対物レンズ（ 図2、ステップ3、4）で天井を照らします。私を移動します中心位置（ 図2、ステップ5）に地域をlluminated。レーザー（ 図2、ステップ6）フォーカス。微調整の中心に集光されたレーザ（ 図2、ステップ7）の位置。 </li></ol></li><li>顕微鏡のステージ上の試料をセットし、明視野照明を使用して観察するためのセルを選択します。 </li><li>蛍光タンパク質は、細胞で観察することができることを確認し、落射蛍光照明（ 図3A）を用いて細胞表面でのz -軸位置を設定します。 </li><li> VAEM観測を行います。 <ol><li>コントローラボックスで徐々にレーザービームの入射角を傾け。同時に、慎重にライブ映像を監視します。最初は、イメージが（ 図3B）ぼかされます。 </li><li>レーザー角が増加するにつれて、VAEM画像は最終的には鮮明な画像（ 図3CおよびD）を製造する 、より少ない不鮮明になるであろう。この時点で、increaを停止レーザー角度を歌います。蛍光信号が失われた場合、より浅い角度に減少します。 </li><li>微調整のレーザー入射角は、より良好な画像を得ることができます。 Z -軸の位置の微調整は、画像を改善することができます。必要に応じて、光学パラメータ（レーザー出力、波長フィルタセット）を調整し、画像センサパラメータ[画像サイズ、露出時間、ゲイン、デジタイザと電子増倍（EM）ゲイン]。 注：以下のように上述のTIRF顕微鏡装置の場合には、代表的なパラメータです。ちょうどカメラの前でレンズの倍率：2倍。レーザー出力：1.0 mWの。画像サイズ：512×512ピクセル。露光時間：100ミリ秒。ゲイン：5×を。デジタイザ：11 MHzの。 EMゲイン：100。 </li></ol></li><li>商用顕微鏡ソフトウェアを使用して、複数ページのTIFF画像ファイルとして映画を取得します。ここでは、映画は、気孔細胞の表面上の点滅GFP標識されたドットです。 注：代表画像取得条件はFOLの通りであります安値。取得モード：ストリームは、RAMに。フレームの数：600;マルチページTIFFファイルサイズ：〜302メガバイト</li></ol>フィジーソフトウェアを使用したGFP標識ドット滞留時間の定量化のための4カイモグラフ分析<ol><li>著者の命令（http://fiji.sc/Fiji）を使用して、フィジー（ &#39;フィジーはちょうどImageJのである&#39;）ソフトウェア10をインストールします 。 </li><li>フィジーを実行し、フィジーメニュー「 ファイルを開く」を使用して取得したマルチページTIFFファイルを開きます。 </li><li>フィジーツールバーメニュー「 直線選択ツール」を使用して 、目的の部位に線を配置します。必要に応じて、「 セグメント化されたライン選択ツール 」または「 フリーハンドライン選択ツール」を使用します。ここに提示した結果では、100ピクセル（8.0ミクロンに相当する）の直線を子会社細胞（ 図4A）の上に置きました。 </li><li>フィジーメニューの 「画像・スタックダイナミックResliceを使用してカイモグラフイメージを作ります</eM&gt; &quot;（http://fiji.sc/Dynamic_Reslice）（ 図4B）。カイモグラフイメージで必要に応じて、「垂直フリップ 」とチェックボックスウィンドウで「90度回転」も（ここで提示された結果では使用されません）があり、x軸とy軸線位置に対応する（100画素を示しそれぞれ8.0μm）とし、観測時間（600ピクセルが60秒に相当）、。カイモグラフイメージが満足できない場合は、複数ページの画像上の線の位置と種類は（ストレート、セグメント化され、フリーハンド）のよう。変更することができますラインの変更、カイモグラフイメージが動的に変化します。フィジーメニュー「ファイルとして保存-TIFF」を使用して、TIFFファイルとしてカイモグラフ画像を保存します。 </li><li>時間軸の向きにブロブの長さを測定します。 <ol><li>ノイズリダクションを実行するには、フィジーメニュー「 プロセス・フィルタ-ぼかし（ガウス）」を使用してカイモグラフ画像にガウスフィルタを適用します。 「 シグマ（ラッドIUS）」パラメータが調整可能（1ピクセル半径が提示された結果のために使用される）です。 </li><li>セグメントフィジーメニューを使用して、しきい値による信号領域、「イメージ・調整・しきい値を 」。 注：選択可能ないくつかの閾値化アルゴリズムがあります。提示された結果では、「円」のアルゴリズムは、（ 図4C）を選択しました。 </li><li>メニューを使用してブロブの-軸の長さを時間（y）を測定するための準備」 を分析・セットの測定を 」。 「 セット測定」ウィンドウの「 境界の矩形」を確認してください。理想的には、領域セットは、ノイズを排除するために、可能な限り小さくすべきです。ここでは、最小面積は50ピクセルに設定しました。時間（y）を測定し、メニュー「 分析・解析粒子」を使用してブロブの長さを-axis。結果の値を取得し、測定領域の信頼性を証明するために、「 結果の表示」をチェックし、「Managerへの追加&lt;/ em&gt;の &quot;ボックス。 </li><li> 「 高さ 」の欄の値は、（y）が測定されたブロブ（ 図4D）のための長さを-axis時間です。結果テーブルメニュー「ファイルとして保存」を使用して値を保存し、計算し、統計パッケージ、および/ ​​または表計算ソフト（ 図4E）を使用してブロブ画像期間のデータセットを処理します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+dynamics+and+functional+redundancy+of+the+Arabidopsis+dynamin-related+isoforms+DRP1A+and+DRP1C+during+plant+development.">Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).</li><li>Fujimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+dynamin-related+proteins+DRP2B+and+DRP1A+participate+together+in+clathrin-coated+vesicle+formation+during+endocytosis.">Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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J., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane+microdomain-associated+protein,+Arabidopsis+Flot1,+is+involved+in+a+clathrin-independent+endocytic+pathway+and+is+required+for+seedling+development.">A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development.</a> Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).</li><li>Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament+dynamics+are+dominated+by+rapid+growth+and+severing+activity+in+the+Arabidopsis+cortical+array.">Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array.</a> J. 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著者は、開示することは何もありません。

このビデオの記事では、プロトコルは、 シロイヌナズナの気孔複合体上のGFP-PATROL1ドットの動的挙動を監視し、測定するために与えられています。ここに示されているように、VAEM観測は、植物の細胞表面のライブイメージングのための強力なツールです。高感度EM-CCDはVAEM光学系では比較的弱い励起レーザの使用を可能にするため、GFP-PATROL1の監視のためにここに使用した実験条件下では、ビデオキャプチャの1分間使用したサンプルはほとんど蛍光退色がありました。レーザーを中心と各実験の開始前に、焦点を当て、成功VAEM観測のために重要です。ユーザーがVAEMを使用する前に選択した顕微鏡会社から専門のスタッフによって訓練されるべきです。 VAEMは、GFP-PATROL1が原形質膜に点滅不動のドット状の区画とダイナ​​ミックな局在を持っていることが明らかになりました。蛍光標識された原形質膜プロトンポンプAHA1ミスLpatrol1変異孔辺細胞と子会社細胞でocalizes、以前に8,9を報告したように。したがって、VAEM可視化GFP-PATROL1ドットダイナミクスは、原形質膜へのプロトンポンプの送達を表すことができます。 GFP-PATROL1のこの動的挙動は、植物細胞の表面上のリアルタイムのタンパク質ダイナミクスを明らかにVAEMの有用性を示し、従来のガルバノミラー型共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて可視化することは困難です。 GFP-PATROL1観察は、植物細胞生物学におけるVAEMアプリケーションのほんの一例です。 VAEMは（植物細胞における細胞質の薄い表層における多数の事象のモニタリングに適用可能で、例えば、酵素の細胞壁合成の分泌または修飾11,12、原形質膜タンパク質のダイナミクス7,13,14、皮質微小管動態4アクチンミクロフィラメント4,15の再配列および細胞小器官の動き6）。植物細胞の科学者の広い範囲が恩恵を受ける必要がありますVAEM技術からフィット。 生物学的な画像データの定量的評価は、最近、顕微鏡装置およびコンピューティングの進歩によって駆動、重要になってきました。 600（T）画素×512（Y）×512（X）を含むVAEM動画データを容易にわずか数分で得ることができます。画像解析は、蛍光標識されたタンパク質の寿命や移動を測定するだけでなく、大規模な、多次元画像データセットからの生体情報をマイニングしていないだけに役立ちます。カイモグラフは、原形質膜2上に 、タンパク質の連続的補充によって示されるように、VAEM動画データから対象のタンパク質の移動を決定する基本的な、しかし有益なアプローチです。 図4に示すようにカイモグラフは、GFP-PATROL1ドット&#39;滞留時間、および原形質膜へのそれらの低運動性の可視化を可能にした。逆に、カイモグラフは、細胞質のストリーミングなどのより複雑な動きを評価するための限られた有効性を有しています。もっとcompliについてcated動きは、このようなオプティカルフローなどの他の画像解析手法16が参考になります。

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell&#8217;s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant&#8217;s responses to environmental cues at the molecular level.
Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization3, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass&#8211;water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells5. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface7, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants6.
The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana8. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis8. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells8 and subsidiary cells9, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min9.

<table><tbody><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>TIRF unit</td><td>Olympus</td><td>IX3-RFAEVAW</td><td></td></tr><tr><td>TIRF objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100 &amp;times; OTIRF&amp;nbsp;</td><td>NA = 1.49</td></tr><tr><td>Laser angle control box</td><td>Chuo Seiki</td><td>QT-AK</td><td></td></tr><tr><td>Optically pumped semiconductor laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; LP USB 488-20 CDRH Laser</td><td></td></tr><tr><td>510&amp;ndash;550 nm band-pass filter</td><td>Olympus</td><td>U-FBNA</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ImagEM C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>C-mount camera magnification change unit&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph software</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaMorph version 7.7.11.0</td><td></td></tr><tr><td>TIRF microscopy manual</td><td>Olympus</td><td>AX7385</td><td>Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Olympus</td><td>Immersion Oil Typr-F</td><td>ne = 1.518 (23 degrees)</td></tr></tbody></table>

real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

このビデオの記事では、Aの GFP-PATROL1のVAEM観測のためのプロトコルシロイヌナズナ子葉気孔複雑な細胞が提供されています。空ドロップ実装はA.のVAEM調製物中の気泡の発生を減らすことができ、簡単な製造方法でありますシロイヌナズナ子葉（ 図1）。エントリーレーザーおよび/またはVAEMのための検体のz位置決めOvertiltingは不明画像を提供します。その場合、それは落射蛍光照明によって判断されるように、すぐにサンプル上の位置から再スタートすることをお勧めします。 VAEM観測の数日経験した後、それが成功し、日常VAEMムービーを取得することが可能であるべきで、GFP-PATROL1のここに示したような点滅が点在しています。 A.で12の独立した補助セル185からのGFP-PATROL1ドットの滞留時間は、 図4に示すカイモグラフ分析を使用してシロイヌナズナ子葉を測定しました。フィット密度関数は、ほとんどのGFP-PATROL1ドットは補助細胞表面上のプロトンポンプの高速エキソサイトーシス/エンドサイトーシスを示唆し、約3.5秒（ 図4E）のピークと、2〜10秒間の補助セルに常駐することが明らかになりました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53437/53437fig1.jpg" width="700" /> 空ドロップ実装方法の概略図1.ステップ1：検体シロイヌナズナ子葉は、スライドガラス上の基底バッファのドロップに浮かべています。ステップ2：基礎緩衝液滴の滴をカバーガラス上に配置されます。ステップ3：ドロップとカバーガラスは、逆さまにして、ドロップがスライドガラス上の試料の上方に配置されています。ステップ4：カバーガラスが解除され、液滴が試料へ落ちます。 （トップ）鳥瞰図。 （下）横と拡大図<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53437/53437fig1large.jpg" target="_blank">。PLE</a>ASEこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53437/53437fig2.jpg" width="700" /> 図2.レーザーセンタリングのキャリブレーションおよび集束ステップ1：顕微鏡リボルバーの空の位置を顕微鏡上の天井にレーザ光 ​​を送信するために選択されます。ステップ2：中央位置が天井に色付きの円シールを使用してマークされます。ステップ3：目的が選択されています。ステップ4：対物レンズを介してレーザ光を照射位置を確認してください。ステップ5：照明は、マークされた中心位置に調整されます。ステップ6：レーザ光が集光されます。ステップ7：集束レーザ光 ​​がマーク中心位置に移動される。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53437/53437fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 落射蛍光顕微鏡と角度可変落射蛍光顕微鏡（VAEM）の図3の比較。（A）落射蛍光顕微鏡でのレーザーの光路の概略図。 （B） シロイヌナズナの7日齢の苗における子葉表面でのGFP-PATROL1の代表的なエピ蛍光画像。スケールバーは5μmで示しています。 （C）VAEMにおけるレーザの光路の概略図。レーザーのエントリが傾いていることに注意してください、そして、それは、可変深度で試料の表面を照明します。 （B）に示すように、同じ領域の（D）VAEM画像。スケールバーは5μmでことを示します。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53437/53437fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図4.カイモグラフ分析は、GFP-PATROL1ドットの滞留時間を定量化する。（A）VAEMイメージをカイモグラフを作るために置い直線で。スケールバーは5μmで示しています。 （B）（A）に示される線に沿ってカイモグラフ画像。 （C）フィジーソフトウェアで生成された円のアルゴリズムに基づいて、（B）の二値画像、。黄色の線は、GFP-PATROL1信号の自動検出された領域を示しています。 （D）フィジー」粒子を分析し、「関数の結果テーブルのスクリーンショット。 （E）の子会社細胞におけるGFP-PATROL1ドットの滞留時間のヒストグラム。赤い線は密度関数を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53437/53437fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

このプロトコルの目的は、気孔複合体の細胞皮質内に、GFPタグPATROL1、膜輸送タンパク質のドットを点滅示す可変角度落射蛍光顕微鏡で植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視する方法を示すことですシロイヌナズナ 。

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.9K ビュー.  The University of Tokyo. このプロトコルの目的は、気孔複合体の細胞皮質内に、GFPタグPATROL1、膜輸送タンパク質のドットを点滅示す可変角度落射蛍光顕微鏡で植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視する方法を示すことですシロイヌナズナ 。 

ビデオ: Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

生物工学

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

発生生物学

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

生物学

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

共焦点イメージングによるERL1ダイナミクスの時空間的研究

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

著者スポットライト:気孔系統細胞における膜輸送イベントを研究するための画像ベースの方法  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

要約

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この動画の章

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

共焦点イメージングは、シロイヌナズナの花の開発のライブ

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。

気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

要約

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全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

共焦点イメージングは、シロイヌナズナの花の開発のライブ

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。