コラーゲンマトリックスのアッセイは、過去二から三十年の間に多くの異なった研究グループの作業によって開発され、改善されました。ドーパミンと線条体の外植片のためにここで説明するアプローチは非常にこれらの研究から恩恵を受ける。さらに、著者らは、線条体の外植片培養を設定する際に彼女の助けをAsheetaプラサドに感謝します。ラボでの作業は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム推進機構（キャリア開発賞）によって資金を供給され、健康の研究開発のオランダ機構（ZonMW-ビディとZonMW-TOP）、Europanian連合（mdDA-NeuroDev、FP7/2007-2011 、グラント222999）（RJPに）、および科学研究費オランダ機構（TopTalent、ERESに）。

1。ラット尾コラーゲンの調製<ol><li> 6月10日成体ラットの尾（それは使用するまで-20℃で尻尾を格納することが可能です）を収集。 </li><li>室温（RT）で一晩、95％エタノール中で尾を浸します。 </li></ol> ラットの尾の解剖（組織培養フード内）： （それらを使用していない場合、70％エタノールでツールを保持し、この手順全体を通して使用されるすべてのソリューション、ツール、ガラス製品は、無菌であることを確認してください） <ol start="3"><li>尾から腱を収集するには、尾の先端を切り落とした。鉗子のペアで尾の大きい方の端を保持します。ホールド、曲げや他の鉗子に近い尾を破るために鉗子の別のペアを使用しています。引き離すと腱が取り残される（ 図1A、B）。 </li><li>滅菌H 2 Oの腱を収集し、すべての腱を採取した後、滅菌H 2 Oを使用して新しいペトリ皿に移動します</li><li> 2から3腱を取るために2組を使用してそれらを細断処理滅菌H 2 Oを使用して新しいペトリ皿でCEPSこのような静脈（; 図1C腱組織は光沢のある反射である）などの非腱組織を除去する。すべての非腱組織を除去した後、それぞれの尾は腱の約100から150 mgを得られます。 </li><li>滅菌3％酢酸300mlに腱を転送し、4℃で一晩ゆっくりかき混ぜる℃、 </li><li>滅菌3％酢酸の追加200ミリリットルを追加し、4℃で一晩ゆっくりかき混ぜる℃、 </li><li> 4で120分間〜2700×gで腱を含む酢酸溶液を遠心°Cペレットの非溶解腱および非腱組織へ。 </li><li>遠心分離中に透析チューブを準備します。 <ul><li> 40cmの部分をカット</li><li> 5分間500μMEDTAで沸騰</li><li>滅菌H 2 Oでクール</li></ul></li><li>透析チューブの一方の端に結び目を作ると自動pipettを使用して組織培養フード内で氷上で遠心腱液の上清をチューブを埋めるeと25mlのピペット。気泡を生成することは避けてください。結び目は、チューブのすべての部分が（ 図1D）氷の上で無菌アルミ箔上にチューブや店舗チューブのもう一方の端を、いっぱいになるまで。 </li><li>組織培養フード内で無菌0.1X MEMは、pH 4.0の10リットルを準備します。チューブの部分にフローターを追加し、10リットルのビーカーにあらかじめ冷却0.1X MEM液にこれらを追加します。 4℃で一晩透析°Cをゆっくり撹拌しながら。 pHが低く維持しながら、この透析は、過剰な酸を削除します。 </li><li>新しい事前水冷10リットル0.1X MEMと交換して、4℃で一晩攪拌℃、 </li><li>新しい事前水冷10リットル0.1X MEMで置き換えて、前述の手順を繰り返して、4℃で一晩攪拌℃、 </li><li>滅菌した50mlチューブにアリコートコラーゲン溶液。 4℃で保存のアリコート6-12ヶ月保つ、唯一の組織培養フード内でコラーゲンの在庫を処理します。 </li><li>それは精製されたコラーゲンはコラーゲンMATRで最適な結果を得るために（0.1×MEM）で希釈する必要があるかどうかをテストすることが重要です。IXアッセイ。したがって、コラーゲン希釈系列を生成します（原液コラーゲン、1:1、1:2と1:5希釈）を、最適なコラーゲン希釈を決定するために下記のようにコラーゲンマトリックスアッセイを実行します。 </li></ol> 2。ドーパミン作動性中脳7,8の解剖<ol><li>母親の子宮からE14.5マウス胚を分析し、必要になるまで氷の上でL15培地中に保持します。 </li></ol> 後続のすべての解剖の手順は、氷の上でL15培地中で行われています。 <ol start="2"><li>脳を解剖する。 </li><li>それぞれの終脳胞の内側の部分（線条体の外植片のための終脳胞を使用）に沿っ​​て切断することによって終脳を削除します。 </li><li>髄鞘を削除します。 </li><li>脳たわみのちょうど吻側腹カットを行います。 </li><li>脳たわみのちょうど尾別の腹のカットを行います。 </li><li> microdissectioを使用して、背側正中線に沿ってrostrocaudalカットを行う基礎となる腹側中脳組織を露出するn個のナイフ。それはドーパミン作動性ニューロン（ 図2）が含まれていると腹側中脳組織をヒットしないように注意してください。 </li><li> 2 rostrocaudalカットは横方向と背側中脳組織を削除する腹側正中線と平行にしてください。 </li><li>顕微解剖ナイフを使用して、外植片に、残りの腹側中脳組織を分割します。 </li><li>使用時まで氷中に5％FBSを含むL15培地に外植片を格納します。 </li></ol> 3。線条体の解剖 すべての解剖の手順は、氷の上でL15培地中で行われています。 <ol><li>脳の解剖時に解剖し終脳胞を使用しています。 </li><li>視床と鉗子を用いて線条体の間に切断することにより視床を削除します。 </li><li>そのような嗅球など吻側構造を削除する線条体への吻側中外カットを行います。線条体に尾側に位置し、組織に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>位置線条体のコロナのビューを取得するために、残りのスライス（ 図2）。 </li><li>線条体は、組織のやや密（より透明）の一部として認識することができます。顕微解剖ナイフを使用して、外植片に線条体およびカットを分析する。外側と内側神経節隆起の移行ニューロンを含む正中線に近く、やや暗い組織を避けることができます。 </li><li>使用時まで氷中に5％FBSを含むL15培地に外植片を格納します。 </li></ol> 4。アセンブリコラーゲンマトリックスアッセイ コラーゲンの調製（氷上ですべてのステップを冷却し、ピペットチップを使用します） <ol><li> 10倍MEMを100μlと1M重炭酸ナトリウム40μlの（NaHCO 3水溶液 ）で希釈し、コラーゲンの860μlを混合し、氷上に置きます。この時点で、コラーゲンが温まるなら、それは強固なものになります。 </li><li> 4よくヌンク皿のウェルにカバースリップに準備されたコラーゲンの20μlのドロップ（直径約5 mm）を追加するそれは30分（周囲のO 2濃度が十分である）のため°C、5％CO 2、37 CO 2インキュベーターに放置。このインキュベーションの間にコラーゲンがゼラチン化します。 </li></ol> コラーゲンゲルのセットアップ共培養 <ol start="3"><li>コラーゲンはゼラチン化した後、コラーゲンにドーパミンや線条体の外植片を転送するために200μlの先端にピペットを使用しています。 </li><li>針を使用して相互に近接して外植片を移動します。 1片（〜200から300μm）を（ 図2）の約直径の距離で、それらを離れてください。 </li><li>余分な培地を除去し、外植片の上に準備されたコラーゲンの20μlを加える。これは多くの場合、外植片が移動するようになります。 4.4で説明されるように針を用いて外植片の位置を変更します。 </li><li>コラーゲンは37℃、5％CO 2で30分間、続いて室温で15分間固化しましょう。 </li><li>コラーゲンが設定した後、電子の400μlを加えるxplant媒体と37℃CO 2インキュベーター内で2〜3日間成長℃、5％CO 2。 </li></ol> 5。免疫組織化学と定量化による解析 免疫組織化学 <ol><li>外植片を修正するには、静かに培地400μlの（これにより、4％PFAを希釈）をPBSで8％のパラホルムアルデヒド（PFA）400μlを加え、室温で1時間放置してみましょう。 </li><li>室温でPBSで3倍の15分間洗浄します。 </li><li>ブロッキングバッファー中でインキュベートする（BB、PBS + 1％FBS + 0.1％トリトンX-100）で2時間。 </li><li> 4℃でBBで一次抗体で一晩インキュベートドーパミン作動性の軸索は、線条体軸索抗DARPP32抗体（1:500）9およびすべての軸索抗βIIIチューブリン（1:3000）7を可視化するための抗チロシン水酸化酵素抗体（1:1000）7を使用してください。 </li><li>室温でPBSで5倍の1時間洗浄します。 </li><li>一晩4 BBの適切なフルオロフォア（1:500）にコンジュゲート二次抗体でインキュベート℃のこのステップからの光（例えば、アルミ箔でそれらをカバーする）への外植片の曝露を最小限に抑えます。 </li><li> 4℃でPBSで一晩洗浄°C次の日の間に数回の洗浄が続く。 </li><li>退色防止剤封入剤を長く使用してスライドを顕微鏡で外植片をマウントします。ガラス顕微鏡スライド上で〜10μlのドロップを追加します。カバースリップを取るとそっと下向きに植側に取り付け培地のドロップの上に置きます。非常に穏やかに取り付け培地のドロップでそれを下げることによって、デ·カバースリップの下に空気が入らないようにします。 </li></ol> P / D比を計算することによって定量化 <ol start="9"><li>落射蛍光顕微鏡（ 図3）を使用して、外植片のデジタル画像を取得します。 </li><li>これらの画像を使用して、近象限（隣接する植に最も近い植すなわち一部）と遠位象限（隣接explaから最も遠い片の一部を生成するために象限にそれぞれ植を分割NTの場合）（ 図2、4）。 </li><li>外植片からの両方の近位および遠位の象限における新興20長い神経突起の長さを測定します。 </li><li>個々の外植のためにP / D比を計算するために20の最長神経突起の平均長を使用しています。比&lt;1は、軸索反発を示しながら、AP / D比&gt; 1は、軸索の魅力を示しています。 </li><li>いくつかのケースでは、神経突起の密な成長は、個々の神経突起の長さの評価を防ぐことができます。このような状況では、定量化は、植の端と近位および遠位象限の軸索の成長をリードするフロント間の距離を測定することによって行うことができます。 </li></ol> 6。代表的な画像ドーパミンと線条体の外植片の成功培養した後の軸​​索の多数（図示せず）は明視野顕微鏡を用いて、可視または抗βIIIチューブリンの免疫細胞化学などによって可視化しています。これらの軸索のサブセットは、ドーパミン作動性またはsになります<html>可視化を使用して免疫細胞としてtriatal軸索（ 図3）。説明したように象限に外植片を分割し、P / D比を決定することにより、推定される軸索の魅力や反発効果が（ 図3E）を定量することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> 図1：ラット尾の腱からコラーゲンの調製を示す写真。ラットの尾を離れて引っ張る）は腱を公開しています。 B）腱は、ロープ状のバンドルとして表示されます。 C）腱は、光沢のある白い外観によって静脈から区別することは簡単です。 D）酢酸に腱を溶解後、溶液を透析チューブに転送されます。溶存コラーゲンの寒さを保つために、チューブを氷上に滅菌したアルミ箔上に配置されます。 E 2 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。手続きの異なる段階を示す模式図。適切な脳の領域は、解剖し、外植片を生成するためにカットされています。単一の脳と線条体の外植片は、コラーゲンマトリックスに近接して配置され、37℃で48〜72時間のために成長して残っている軸索は、蛍光免疫組織化学によって可視化しており、P / D比はchemotropic応答を定量化するために計算されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> 図3。コラーゲンマトリックス培養で軸索成長を示す代表的な結果。軸索伸長を明らかにし、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体で染色したA）中脳片。点線は、隣接した外植片を示します。表示個々の神経突起と成長円錐のB）倍率（矢印）。 C）線条体片は抗DARPP32で染色した。 D）Cの倍率は、個々の神経突起を示す。 E）の例P / D比の定量。外植片は、同じ象限に分かれています。遠象限は、それから離れに直面している間に近象限は、隣接する外植片に直面している。スケールバーは100μmを示す。

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	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

コラーゲンマトリックスアッセイは、ここで説明する（例えば、参照する5-8を参照）軸索ガイダンス分子と神経系の様々を調査するために過去数十年の多くの異なるラボで使用され、改善されました。これらの研究は、このアッセイは、効果と異なる（中間）の標的組織から分泌される軸索ガイダンス分子の調節を研究するための強力なツールであることが示されている。 しかし、コラーゲンマトリックスは、細胞外環境（ECM）の代替であることに留意する必要がありますが、明らかにECMに通常存在する多くのタンパク質が不足しています。 ECMの成分は、軸索ガイダンス分子10の効果に影響を及ぼすことが知られています。それにもかかわらず、コラーゲンマトリックスアッセイは、in vitroおよび他の組織培養の手法（例えば、器官スライス培養11）や遺伝子組み換え動物モデルの解析との組み合わせで基本的な分子機構を調べるために特に有用である。 </p&gt; いくつかの要因がコラーゲンマトリックスアッセイの成功を決定します。まず、外植片の大きさが最適な軸索の成長にとって極めて重要である。小さな外​​植片が不規則とfasciculated伸長を示しながら、大規模なドーパミンと線条体の外植片は、しばしば、限られた軸索の成長を表示します。さらに、個々の外植片の間の距離が大幅に分泌される分子は、隣接する外植片に発揮することができる効果に影響を与えます。植があまりにも遠く離れている場合は、拡散性分子は、外植片に到達するために失敗します。逆に、距離がある場合には小さすぎるの軸索は、それが困難な定性的および定量的軸索成長とガイダンスを評価すること、隣接した外植片に成長する可能性があります。最後に、ラット尾コラーゲンの品質が重要であり、直接軸索と外植片の生存の伸長と相関している。 ここで説明したアッセイは、特定の研究課題に対処するためのさまざまな方法で変更することができます。のインスタンスの、また、増殖培地に抗体をブロッキング関数は、（候補者）は、分子の機能阻害を可能にします。さらに、外植片は、細胞凝集体を分泌する特定の軸索成長とガイダンス因子と組み合わせることができます。最後に、外植片は、特定のニューロン集団とその軸索が標識されるGFPレポーターマウスから得られた。この設定を使用すると、軸索はコラーゲンマトリックスアッセイの過程を続けることができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801f未</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン（200mMの） </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWRインターナショナル</td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>メルク</td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地（MEM） </td><td>ギブコ</td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td>ギブコ</td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td>ギブコ</td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツのL-15培地</td><td>ギブコ</td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Gold褪色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>スペクトラムラボ</td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ</td><td> PEL-FREEZ </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗DARPP32（H-62） </td><td>サンタクルス</td><td> SC-11365 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗βIIIチューブリン</td><td>シグマ</td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®は、二次抗体を標識した</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

線条体1を含む終脳のいくつかの分野に向かって内側前脳束を経由して中脳ドーパミン（mdDA）ニューロンのプロジェクト。相互に、線条体黒質（直接）経路を生み出す線条体の中型有棘ニューロンは黒質2を支配する。これらの軸索路の開発は、神経突起によって、または（中間）のターゲット領域3,4から放出される分子を含む軸索成長とガイダンスの手がかりの茄多の組合せの行動に依存しています。これらの可溶性因子は、細胞外環境を模倣した軸索の三次元基板を提供するコラーゲンマトリックスで培養mdDA、そして/または、線条体の外植片によって in vitro で検討することができます。さらに、コラーゲンマトリックス（例えば、参考文献5および6を参照）近傍に配置された他の外植片または細胞から放出されるタンパク質の比較的安定した勾配の形成が可能になります。ここでは、PUR用のメソッドを記述するコラーゲンゲルとその後の免疫組織化学的および定量分析でラット尾コラーゲン、ドーパミンと線条体の外植片の顕微解剖、自分たちの文化のification。最初に、E14.5マウス胚の脳は、絶縁されており、ドーパミンと線条体の外植片は、マイクロダイセクションされています。これらの外植片は、その後の（共）、in vitroで 48から72時間のカバースリップ上にコラーゲンゲル内で培養されています。その後、軸索突起が定量化されるニューロンマーカー（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ、DARPP32、またはβIIIチューブリン）と、軸索の成長と魅力的または反発軸索応答を用いて可視化されています。この神経細胞の調製は、開発時にmesostriatalと線条体黒質軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムのin vitro試験のための便利なツールです。このアッセイを使用して、それがドーパミンと線条体軸索のために他の（中間）の目標を評価するために、または特定の分子の手がかりをテストすることも可能です。

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

中脳ドーパミン系と線条体からの外植片は、のためにコラーゲンマトリックスアッセイで使用されている<em&gt; in vitroで</emmesostriatalと線条体黒質経路の開発&gt;分析。このアッセイでは軸索伸長やガイダンスを操作して定量することができる。また、他の地域や分子手がかりを評価するために変更することができます。

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K ビュー.  University Medical Center Utrecht. 中脳ドーパミン系と線条体からの外植片は、のためにコラーゲンマトリックスアッセイで使用されている in vitroで分析。このアッセイでは軸索伸長やガイダンスを操作して定量することができる。また、他の地域や分子手がかりを評価するために変更することができます。

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

再考された補助的なモータ領域のファイバ接続：ファイバ解剖、DTI、および3次元文書の方法論

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...