Die Kollagen-Matrix-Assay wurde entwickelt und durch die Arbeit von vielen verschiedenen Forschergruppen in den letzten zwei bis drei Jahrzehnten verbessert. Die Ansätze hier für striatalen dopaminergen und Explantate beschriebenen stark aus diesen Studien profitieren. Darüber hinaus möchten die Autoren zu Asheeta Prasad für ihre Hilfe danken, bei der Einrichtung von striatalen Explantatkulturen. Arbeit im Labor wurde von der Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award) gefördert, die Niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und Entwicklung (ZonMw-VIDI und ZonMw-TOP), das Europanian Union (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (zu RJP) und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (TopTalent; zu ERES).

1. Vorbereitung der Rattenschwanzkollagen <ol><li> Sammle 10.06 erwachsenen Rattenschwänzen (ist es möglich, die Schwänze bei -20 ° C bis zur Verwendung zu speichern). </li><li> Weichen Sie die Schwänze in 95% Ethanol über Nacht bei Raumtemperatur (RT). </li></ol> Dissektion der Rattenschwänzen (in Gewebekulturen Haube): (Halten Sie Ihre Werkzeuge in 70% Ethanol, wenn nicht mit ihnen und stellen Sie sicher, dass alle Lösungen, Tools und Glaswaren im Rahmen dieses Verfahrens benutzt steril sind) <ol start="3"><li> Um Sehnen aus den Schwänzen zu sammeln, schneiden Sie die Spitze des Schwanzes. Halten Sie große Ende des Schwanzes mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine andere Zange in der Hand, biegen und brechen den Schwanz in der Nähe der anderen Pinzette. Auseinander ziehen und die Sehnen werden zurückgelassen (Abbildung 1A, B). </li><li> Sammeln Sie die Sehnen in sterilem H 2 O und nach Einholung aller Sehnen verschieben Sie sie auf eine neue Petrischale mit sterilem H 2 O </li><li> Nehmen Sie 2-3 Sehnen und zerkleinern diese mit 2 Paar fürSteinpilze in einem neuen Petrischale mit sterilem H 2 O Entfernen Sie nicht Sehnengewebe wie Venen (Sehnengewebe ist glänzend und reflektierend; 1C). Nach dem Entfernen aller nicht-Sehnengewebe ergibt jede Schwanz etwa 100-150 mg von Sehnen. </li><li> Übertragen Sie die Sehnen zu 300 ml steriler 3% Essigsäure und rühren, langsam über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie eine weitere 200 ml sterile 3% Essigsäure und rühren, langsam über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren der Essigsäurelösung, enthaltend die Sehnen bei ~ 2700 × g für 120 min bei 4 ° C bis Pellet nicht gelösten Sehnen und nicht Sehnengewebe. </li><li> Während der Zentrifugation vorbereiten Dialyseschlauch: <ul><li> schneiden Stücke von 40 cm </li><li> kochen in 500 uM EDTA für 5 min </li><li> cool in sterilem H 2 O </li></ul></li><li> Verknoten an einem Ende der Dialyseschläuche und füllen den Schlauch mit dem Überstand des zentrifugierten Sehne Lösung auf Eis in der Gewebekulturabzug unter Verwendung eines automatischen abpipettierene und eine 25 ml Pipette. Vermeiden Sie Blasen entstehen. Knoten das andere Ende des Schlauchs und zu speichern Schlauch auf sterile Aluminiumfolie auf Eis, bis alle Schlauchstücke gefüllt (1D). </li><li> Planen 10 l sterile 0,1 × MEM, pH 4,0, in der Gewebekultur Haube. Fügen Sie Floater in Stücke von Schläuchen und fügen Sie diese dem vorgekühlten 0,1 × MEM-Lösung in einem 10-l-Becherglas. Dialysieren über Nacht bei 4 ° C unter langsamem Rühren. Diese Dialyse entfernt überschüssige Säure unter Beibehaltung der pH-Wert niedrig. </li><li> Durch neue vorgekühlten 10 l 0,1 X MEM und rühren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt durch den Austausch mit neuen vorgekühlten 10 l 0,1 X MEM und rühren, über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Aliquotieren Kollagenlösung in sterile 50 ml Röhrchen. Shop-Aliquots bei 4 ° C Halten Sie 6-12 Monate, nur dann transportieren die Kollagen-Lager in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Es ist wichtig, zu testen, ob das gereinigte Kollagen verdünnt (in 0,1 × MEM) werden muss, um optimale Ergebnisse in dem Collagen zu erhalten matrix-Assay. Daher erzeugen eine Kollagen Verdünnungsreihe (unverdünnt Kollagen, 1:1, 1:2 und 1:5 verdünnt) und führen Kollagenmatrix-Assays, wie unten für die optimale Kollagen Verdünnung zu bestimmen beschrieben. </li></ol> 2. Dissektion des dopaminergen Mittelhirns 7,8 <ol><li> Sezieren E14.5 Maus-Embryonen aus der Gebärmutter der Mutter und halten in L15 Medium auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol> Alle nachfolgenden Schritte werden in Dissektion L15 Medium auf Eis durchgeführt. <ol start="2"><li> Herauspräparieren das Gehirn. </li><li> Entfernen Sie das Telencephalon durch Schneiden entlang der medialen Teil jedes telencephalen Vesikel (verwenden Sie die telencephalen Vesikel für striatalen Explantate). </li><li> Entfernen Sie die meningealen Scheide. </li><li> Machen Sie einen dorsoventralen Schnitt nur rostral des mesencephalen Flexur. </li><li> Machen Sie einen anderen dorsoventralen Schnitt unmittelbar kaudal des mesencephalen Flexur. </li><li> Machen Sie einen rostrokaudalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie mit einem microdissection Messer, um die zugrunde liegenden ventralen Mittelhirn Gewebe freizulegen. Achten Sie darauf, den ventralen Mittelhirn Gewebe betroffen, da sie die dopaminergen Neuronen (Abbildung 2) enthält. </li><li> Machen Sie zwei seitliche Schnitte rostrokaudalen und parallel zur ventralen Mittellinie zu dorsalen Mittelhirn Gewebe zu entfernen. </li><li> Teilen Sie die verbleibenden ventralen Mittelhirn Gewebe in Explantate mit einem Messer Mikrodissektion. </li><li> Speichern der Explantate in L15-Medium mit 5% FBS auf Eis bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Präparation des Striatum Alle Schritte werden in Dissektion L15 Medium auf Eis durchgeführt. <ol><li> Verwenden Sie telencephalen Vesikel während Mittelhirn Dissektion seziert. </li><li> Entfernen Sie den Thalamus, indem zwischen dem Thalamus und Striatum mit einer Pinzette. </li><li> Machen Sie ein mediolateral Schnitt rostral des Striatum zu rostralen Strukturen wie der Riechkolben zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt für Gewebe kaudal des Striatum gelegen. </li><li> Positiondie restlichen Scheiben, eine koronare Ansicht des Striatum zu erhalten (Abbildung 2). </li><li> Das Striatum kann als etwas weniger dicht (transparenter) Teil des Gewebes erkannt werden. Präparieren Sie das Striatum und Schnitt in Explantate mit einem Messer Mikrodissektion. Vermeiden Sie den etwas dunkleren Gewebe in der Nähe der Mittellinie, die Migration von Neuronen des lateralen und medialen Ganglion Eminenz enthält. </li><li> Speichern der Explantate in L15-Medium mit 5% FBS auf Eis bis zur Verwendung. </li></ol> 4. Montage Kollagen-Matrix-Assays Vorbereitung des Kollagens (alle Schritte auf Eis gekühlt verwenden Pipettenspitzen) <ol><li> Mischen Sie 860 ul verdünnte Kollagen mit 100 ul 10x MEM und 40 ul 1 M Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3) und halten Sie auf dem Eis. Wenn an dieser Stelle das Kollagen wärmt es wird sich verfestigen. </li><li> Einen Tropfen von 20 ul (ca. 5 mm Durchmesser) von vorbereiteten Kollagen zu einem Deckglas in eine Vertiefung einer 4-Well Nunc Gerichtund lassen Sie es in einem CO 2-Inkubator stehen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min (Umgebungstemperatur O 2-Konzentration ist ausreichend). Während der Inkubation wird das Kollagen gelatinieren. </li></ol> Setup-Co-Kultur in Kollagen-Gel <ol start="3"><li> Nachdem das Kollagen geliert ist, verwenden Sie eine Pipette mit 200 pl Spitze, eine dopaminerge oder striatalen Explantat an das Kollagen zu übertragen. </li><li> Bewegen der Explantate in enger Nähe zueinander unter Verwendung einer Nadel. Halte sie in einem Abstand von etwa dem Durchmesser einer Explantat (~ 200-300 um) (Abb. 2). </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Medium und fügen 20 ul vorbereiteten Kollagen auf der Oberseite der Explantate. Dadurch entsteht häufig die Explantate zu bewegen. Positionieren Sie die Explantate mit einer Nadel wie in 4.4 beschrieben. </li><li> Lassen Sie die Kollagen verfestigen für 15 min bei RT gefolgt von 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nachdem das Kollagen gesetzt hat, fügen Sie 400 ul explant Medium wachsen und für 2-3 Tage in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 5. Die Analyse durch Immunhistochemie und Quantifizierung Immunhistochemie <ol><li> Um Explantate zu beheben, fügen Sie sanft 400 ul von 8% Paraformaldehyd (PFA) in PBS auf 400 ul Medium (und damit Verdünnung des PFA bis 4%) und lassen Sie stehen für 1 Stunde bei RT. </li><li> Waschen 3x 15 min in PBS bei RT. </li><li> Inkubieren in Blocking-Puffer (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) für 2 Stunden. </li><li> Über Nacht inkubieren mit Primärantikörper in BB bei 4 ° C Für dopaminergen Axonen verwenden Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper (1:1000) 7, für striatalen Axone Anti-DARPP32 Antikörper (1:500) 9 und für die Visualisierung aller Axone Anti-βIII Tubulin (1:3000) 7. </li><li> Waschen 5x 1 Stunde in PBS bei RT. </li><li> Inkubation mit sekundären Antikörpers, der an den entsprechenden Fluorophors (1:500) in BB über Nacht bei 4° C Von diesem Schritt auf Minimierung der Exposition der Explantate auf Licht (zB bedecken Sie sie mit Alufolie). </li><li> Waschen in PBS über Nacht bei 4 ° C, gefolgt von mehreren Wäschen während des nächsten Tages. </li><li> Montieren Sie Explantate auf Objektträgern mit Prolong Antifade Reagenz Eindeckmedium. Einen Tropfen ~ 10 ul auf einem Objektträger. Nehmen Sie das Deckglas und legen Sie sie vorsichtig auf den Tropfen Eindeckmedium mit dem Explantat Seite nach unten. Vermeiden Sie Trapping keine Luft unter de Deckglas durch sehr schonend senken sie auf den Tropfen Eindeckmedium. </li></ol> Die Quantifizierung durch die Berechnung P / D-Verhältnis <ol start="9"><li> Erwerben Sie digitale Bilder der Explantate mit dem Epifluoreszenzmikroskop (Abbildung 3). </li><li> Unter Verwendung dieser Bilder, teilen jedes Explantat in Quadranten, um ein proximales Quadranten (dh ein Teil des Explantats am nächsten zu dem benachbarten Explantat) und ein distales Quadranten (Teil der Explantat von der benachbarten Erläuterungen zu erzeugen weitestennt) (2, 4). </li><li> Die Länge von 20 längsten Neuriten, die aus dem Explantat sowohl in den proximalen und distalen Quadranten. </li><li> Verwendung der durchschnittlichen Länge der 20 längsten Neuriten, die P / D-Verhältnis für jeden einzelnen Explantat berechnen. AP / D-Verhältnis&gt; 1 bedeutet, Axon Attraktion, während ein Verhältnis &lt;1 bedeutet, Axon Abstoßung. </li><li> In einigen Fällen verhindert die dichte Wachstum von Neuriten die Bewertung der einzelnen Neuritenlänge. In diesen Situationen kann die Quantifizierung durch Messen des Abstands zwischen dem Rand des Explantats und dem vorderen vor Axonwachstum in den proximalen und distalen Quadranten werden. </li></ol> 6. Repräsentative Bilder Nach der erfolgreichen Kultur der striatalen dopaminergen und Explantate eine große Anzahl von Axonen sind sichtbar mit Hellfeld-Mikroskopie oder wie visualisiert durch anti-Tubulin βIII Immunzytochemie (nicht dargestellt). Ein Teil dieser Axone dopaminergen oder s.<html> triatal Axone als visualisiert mittels Immunzytochemie (Abbildung 3). Durch die Aufteilung der Explantate in Quadranten wie beschrieben und die Bestimmung P / D-Verhältnissen, kann eine putative Axon anziehende oder abstoßende Wirkung quantifiziert (Abbildung 3E) werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fotos zur Darstellung der Herstellung von Kollagen aus Rattenschwanzsehnen. A) Auseinanderziehen der Rattenschwanz macht die Sehnen. B) Sehnen sind sichtbar als seil-Bundles. C) Die Sehnen sind problemlos von Venen durch ihre glänzend weißes Aussehen unterscheiden. D) Nach Auflösen der Spannglieder in Essigsäure, wird die Lösung in einen Dialyseschlauch übertragen. Um die gelösten Kollagen kalt zu halten, werden die Rohre auf sterile Aluminiumfolie auf Eis gestellt. e 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; 2. Schema, das die verschiedenen Schritte des Verfahrens. Entsprechende Hirnregionen werden seziert und geschnitten, um Explantate zu generieren. Eine einzelne Mittelhirn und Striatum Explantat in unmittelbarer Nähe in einer Kollagenmatrix angeordnet und dann für 48-72 Stunden bei 37 ° C wachsen Axone werden visualisiert durch Fluoreszenz Immunhistochemie und ein P / D-Verhältnis wird berechnet, um chemotropische Antworten zu quantifizieren. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> 3. Repräsentative Ergebnisse zeigen Axonwachstum in einer Kollagenmatrix Kultur. A) Mittelhirn Explantat mit Anti-Tyrosin-Hydroxylase Antikörper enthüllt Axon Auswuchs gefärbt. Gepunktete Linie zeigt neben Explantat. B) Vergrößerung eines einzelnen Neuriten zeigen und das Wachstum Kegel (Pfeile). C) Striatale Explantat mit Anti-DARPP32 gefärbt. D) Vergrößerung der einzelnen Neuriten C zeigt. E) BeispielP / D-Verhältnis Quantifizierung. Explantate werden in gleiche Sektoren eingeteilt. Das proximale Quadrant wird mit Blick auf den angrenzenden Explantat während das distale Quadranten weg von ihm zugewandt ist. Scale-Balken zeigen 100 um.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Kollagenmatrix hier beschriebenen Assay verwendet wurde und von vielen verschiedenen Labors in den letzten Jahrzehnten verbessert, um eine Vielzahl von Axonen Molekülen und neuronalen Systemen untersuchen (zB siehe Referenzen 5-8). Diese Studien haben gezeigt, dass dieser Test ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Wirkungen und Regulation der axonale Wegfindung Moleküle, die durch verschiedene (Zwischen-) Ziel-Geweben sezerniert wird. Es sollte jedoch angemerkt, dass die Kollagenmatrix ein Ersatz für die extrazelluläre Umgebung (ECM) ist aber klar fehlt vielen Proteinen, die normalerweise in der ECM werden. Komponenten der ECM sind dafür bekannt, die Auswirkungen von Axonen 10 Moleküle beeinflussen. Dennoch ist die Kollagenmatrix Assay besonders zur Untersuchung grundlegenden molekularen Mechanismen in vitro und in Kombination mit anderen Gewebekultur Ansätze (z. B. organotypischen Kulturen 11) oder die Analyse von genetisch veränderten Tiermodellen. </p&gt; Mehrere Faktoren bestimmen den Erfolg der Kollagen-Matrix-Assay. Erstens ist die Größe der Explantate entscheidend für optimale Axonwachstum. Große striatalen dopaminergen und Explantaten zeigen oft begrenzten Axonwachstum, während kleine und unregelmäßige Explantate fasciculated Auswuchs zeigen. Ferner ist der Abstand zwischen den einzelnen Explantate einen großen Einfluss auf die Wirkung ein sezerniertes Molekül an benachbarten Explantate ausüben kann. Wenn die Explantate zu weit voneinander entfernt sind, werden frei bewegliche Moleküle nicht den Explantaten zu erreichen. Umgekehrt, wenn der Abstand zu klein ist, kann Axone in die angrenzenden Explantate wachsen, macht es schwierig, qualitativ und quantitativ beurteilen Axonwachstum und Führung. Schließlich ist die Qualität des Rattenschwanzkollagen wichtig und wird direkt mit dem Auswachsen von Axonen und das Überleben von Explantaten korreliert. Der hier beschriebene Assay kann auf verschiedene Weise auf spezifische Fragestellungen anzugehen geändert werden. Zum Beispiel, Zugabe vonFunktion blockierende Antikörper gegen das Wachstumsmedium ermöglicht die funktionelle Hemmung des (Kandidaten-) Moleküle. Darüber hinaus können Explantate mit Zellaggregate sezernierenden spezifischen Axonwachstum und Führung Faktoren kombiniert werden. Schließlich könnte Explantate von GFP-Reporter-Mäuse, in denen spezifische neuronale Populationen und ihre Axone sind beschriftet bezogen werden. Mit diesem Setup können Axone im Laufe der Kollagenmatrix Assay verfolgt werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Fetalem Kälberserum </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin (200mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Verlängern Sie Gold-Reagenz Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Dialyseschlauch </td><td> Spectrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-Tyrosin-Hydroxylase </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchen anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-Tubulin βIII </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor markierte sekundäre Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

Mittelhirn Dopamin (MDDA) Neuronen Projekt über die mediale Vorderhirnbündel gegen mehrere Bereiche im Telencephalon, einschließlich des Striatum ein. Umgekehrt innervieren Medium stachelige Neuronen im Striatum, die Anlass zur striatonigralen (direkten) Weg geben, die Substantia nigra 2. Die Entwicklung dieser Axonen des ZNS ist abhängig von den Aktionen der kombinatorischen einer Fülle von Axon Wachstum und Führung Cues einschließlich Moleküle, die von Neuriten oder durch (Zwischen-) Ziel-Regionen 3,4 freigesetzt werden. Diese löslichen Faktoren können in vitro durch Kultivieren MDDA und / oder striatalen Explantate in einem Kollagenmatrix, die eine dreidimensionale Substrat für die Axone Nachahmen der extrazellulären Umgebung bietet untersucht werden. Darüber hinaus ermöglicht die Kollagenmatrix für die Bildung von relativ stabilen Gradienten von Proteinen durch andere Explantate oder Zellen in der Umgebung (z. B. siehe Referenzen 5 und 6) angeordnet ist freigegeben. Hier beschreiben wir Verfahren für die PURifizierung von Rattenschwanzkollagen, Mikrodissektion von dopaminergen und striatalen Explantate, ihre Kultur in Kollagen-Gelen und anschließender immunhistochemische und quantitative Analyse. Erstens sind die Gehirne von E14.5 Maus Embryonen isoliert und dopaminerge und striatalen Explantate mikrodissezierten. Diese Explantate werden dann (Co) in Kollagengelen auf Deckgläsern gezüchtet für 48 bis 72 Stunden in vitro. Anschließend sind axonale Projektionen visualisiert mit neuronalen Marker (zB Tyrosin-Hydroxylase, DARPP32 oder βIII Tubulin) und Axon-Wachstum und anziehend oder abstoßend Axon Antworten werden quantifiziert. Diese neuronale Zubereitung ist ein nützliches Werkzeug für die in vitro-Untersuchungen der zellulären und molekularen Mechanismen von mesostriatal und striatonigralen Axonwachstum und Beratung bei der Entwicklung. Mit diesem Test ist es auch möglich, andere (Zwischen-) Ziele für die striatalen dopaminergen und Axonen zu beurteilen oder zu spezifischen molekularen Signale zu testen.

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Explantate aus dem Mittelhirn Dopamin und Striatum in einer Kollagenmatrix Assay für die Verwendung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Analyse der mesostriatal und striatonigralen Weg der Entwicklung. In diesem Test axonalen Wachstums und Anleitung können manipuliert und quantifiziert werden. Es kann auch für die Beurteilung der anderen Regionen oder Signalstoffe geändert werden.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K Aufrufe.  University Medical Center Utrecht. Explantate aus dem Mittelhirn Dopamin und Striatum in einer Kollagenmatrix Assay für die Verwendung In-vitro- Analyse der mesostriatal und striatonigralen Weg der Entwicklung. In diesem Test axonalen Wachstums und Anleitung können manipuliert und quantifiziert werden. Es kann auch für die Beurteilung der anderen Regionen oder Signalstoffe geändert werden.

Serie: Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Faserverbindungen des Ergänzungsmotorenbereichs Revisited: Methodik der Faserdissektion, DTI und Dreidimensionale Dokumentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...